Návod pro laboratorní úlohu z měřicí techniky Práce O7. Mikroskopická obrazová analýza

Návod pro laboratorní úlohu z měřicí techniky Práce O7 Mikroskopická obrazová analýza

Laboratorní práce analýza částic sypkých směsí 1. Úvod: Tato laboratorní úloha je koncipována jako seznámení se s principy snímání mikroskopických obrazů a jejich následnou obrazovou analýzou pomocí vhodných softwarových prostředků. Základním předpokladem pro úspěšné provedení obrazové analýzy je správné sejmutí obrazu analyzovaného materiálu. Tento proces je ovlivňován mnoha faktory, z nichž nejdůležitějšími jsou osvětlení, podklad a kvalita snímacích zařízení. Hlavním zde uvedeným zařízením, které nám pomáhá co nejlépe sejmout obraz sledovaného vzorku, je světelný mikroskop Nikon s kamerou Jenoptik ProgRes CT3. Výběr zařízení, pomocí kterých můžeme sejmout obraz analyzované směsi, je v dnešní době velmi široký. Aby bylo možné obraz následně počítačově zpracovat, je vhodné jej získat přímo v digitální formě. K tomuto účelu slouží digitální fotoaparáty a kamery, které v sobě mají zabudovaný vhodný snímací prvek. V současnosti jsou nejpoužívanějšími typy CCD (Charge-Coupled Device) a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semicoductor) senzory. Oba druhy mají svůj zcela základní princip společný: převádějí světelnou energii na elektrickou. Velmi zjednodušeně lze tento proces popsat tak, že tisíce až milióny buněk citlivých na světlo jsou uspořádány do plošné matice. Velikost matice, tedy součin počtu sloupců a řádků matice, udává rozlišovací schopnost jednotlivých přístrojů. Každá buňka převádí světelnou informaci ze své malé části obrazu na elektrický signál. Hodnoty náboje jednotlivých buněk je poté potřeba přečíst. U systému CCD je nakumulovaný náboj ve formě analogového signálu přesouván přes matici tvořenou Shottkyho diodami, která se tedy chová obdobně jako posuvný registr, a jedním rohem matice přechází do vyhodnocovacího zařízení. Analogově/digitální převodník poté převede každou hodnotu buňky do digitální podoby. Protože jsou jednotlivé elementy citlivé především na intenzitu světla a méně na barvu, je takto získaný obrázek černobílý. Barevného obrázku se většinou dosahuje předřazením příslušného barevného filtru. Pro vytvoření jednoho barevného bodu (pixelu) výsledného snímku proto potřebujeme nejméně tři buňky matice. V praxi se však na jednom pixelu barevného obrazu podílí většinou čtyři buňky CCD senzoru. Je zde totiž dvakrát zařazen zelený filtr, čímž je simulována větší citlivost lidského oka právě na zelenou barvu. Výsledný barevný bod pak vzniká aditivním smícháním těchto tří barev. Nevýhodou CCD detektorů je vzájemné ovlivňování nábojů v sousedních buňkách, malý rozsah intenzit a nemožnost adresovat jednotlivé buňky. Naopak výhodami tohoto detektoru oproti druhému typu je vysoké rozlišení, vysoká rychlost převodu signálu a nízký šum ve výsledném obraze. CCD detektory bývají využívány pro práci na vysoce kvalitních snímcích, s mnoha dokonale zhodnocenými pixely a za vyšší citlivosti ke světlu. Naopak senzory CMOS mívají obrazovou kvalitu nižší, nižší rozlišovací schopnost a nižší citlivost, ale přístroje s těmito senzory jsou mnohem levnější a mají nižší spotřebu energie a proto jsou vhodné pro přístroje, používající jako zdroje energie baterie. U technologie CMOS dlouhou dobu chyběla adekvátní kvalita záznamu obrazu. Nicméně výrobcům se v poslední podařilo eliminovat většinu nevýhod CMOS snímačů, a kvalitu snímaného obarzu se značně podařilo přiblížit CCD snímačům. Největší výhodou CMOS snímačů je rychlost s jakou se dá přenést zaznamenaný náboj ze snímače na A/D převodník. CMOS těží ze své schopnosti okamžitě a prakticky současně odvést zaznamenaný náboj ze všech buněk najednou a nezdržovat se posunem náboje a jeho postupným odčítáním. Vlastnosti senzoru, díky kterým je světelný signál převáděn na elektrický, jsou sice nejdůležitější, ale ne jedinou charakteristikou snímacího zařízení. Při volbě vhodnosti použití jednotlivých zařízení pro danou aplikaci je nutné brát v úvahu také další schopnosti zařízení. 2

Jedná se například o charakter připojení přístroje k počítači, formát získaných snímků nebo schopnost sejmout digitální videozáznam. Zařízením použitým pro sejmutí obrazu sledovaného vzorku v této laboratorní úloze, je světelný mikroskop Nikon, kamera Jenoptik ProgRes CT3 a automatizovaný mikroposuvný skenovací stolek Prior. 2. Zařízení používaná v této práci 2.1. Mikroskop Nikon Eclipse LV100D Mikroskopy Nikon řady Elipse LV jsou určeny pro celou řadu nejrůznějších oborů, jako například výroba, výzkum a vývoj polovodičů, elektroniky, léků, dále pak v obecné metalurgii, krystalografii a ve výzkumu, vývoji a výrobě keramických materiálů. Mikroskop má zabudovánu nekonečnou optiku CFI60, která koriguje chromatickou vadu v celém zorném poli. Obraz je tedy extrémně ostrý, s vysokým kontrastem a minimálním kolísáním jasu. Navíc parfokální vzdálenost 60 mm (tj. vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla) a větší průměr objektivu zajišťují jak větší pracovní vzdálenost tak větší numerickou aperturu. Ve stojanu mikroskopu je zabudovaný světelný zdroj pro diaskopické osvětlení a páčka přepínání osvětlení dia/epi. Na následujících obrázcích je popis základních prvků tohoto mikroskopu. Celkový pohled: kamera Jenoptik ProgRes CT3 okuláry horní osvětlovací lampa analyzátor spodní osvětlovací lampa iluminátor objektivy řídící jednotka skenovacího stolku automatizovaný mikroposuvný skenovací stolek ovládání posuvu skenovacího stolku 3

Detaily ovládacích prvků: přepínač obrazu mezi kamerou a okuláry držáky filtrů polarizátor přepínač pro pozorování ve světlém a v tmavém poli modrý filtr clona zorného pole intenzita spodního osvětlení 4

intenzita horního osvětlení Zacházení s mikroskopem bude před začátkem laboratorní práce demonstrováno asistentem. Při práci s mikroskopem dbejte na pokyny asistenta, nezacházejte s žádným ovládacím prvkem hrubě a nezkoušejte nic, co vám asistent neukáže nebo nedovolí. Tento mikroskop je velmi nákladná součást laboratoře (cca 650 tisíc Kč) a jakákoliv oprava je nejen finančně, ale také časově náročná a výrazně by narušila chod laboratoří. 2.2. Digitální kamera Jenoptik ProgRes CT3 Tato kamera má jako snímací prvek CMOS detektor, jehož rozlišení je 2048 1536 pixelů (3.15 Megapixelů). Velikost aktivní snímané oblasti je 6.55 4.92 mm. Napájení kamery je zajišťováno pomocí standardního rozhraní IEEE 1394 (neboli FireWire). Přes toto rozhraní je také kamera ovládána buď pomocí software NIS-Elements nebo jiných programů pro ovládání FireWire kamer (mimo jiné i LabVIEW). Rychlost snímkování kamery je maximálně 35 snímků za sekundu (ale pouze při rozlišení 682 512), maximální doba expozice je 3 s. Kamera nemá vestavěný objektiv, a aby bylo možné získávat snímky, je tedy nutné k ní přes standardní C-závit připevnit vhodný objektiv v závislosti na velikosti sledovaného materiálu. V této úloze je objektiv nahrazen mikroskopem Nikon. 5

2.3. Automatizovaný mikroposuvný skenovací stolek Prior Mikroskop Nikon je vybaven automatizovaným mikroposuvným skenovacím stolkem, který umožňuje přesně definovanou manipulaci se vzorkem ve směru všech tří prostorových souřadnic. Stolkem je pohybováno pomocí šroubů a mikroposuvných motorků, které jsou ovládány manuální harwarovou jednotkou nebo softwarově. Mezi důležité parametry stolku patří: minimální krok ve směru os X a Y: 1.0 μm minimální krok ve směru osy Z: 0.1 μm posuv ve směru os X a Y: 2 mm na otáčku šroubu posuv ve směru osy Z: 100 μm na otáčku šrobu Použití stolku umožňuje snímání povrchů reliéfních vzorků v několika hladinách ve směru osy Z a následné složení zaostřeného snímku s nekonečnou hloubkou ostrosti. Významnou aplikací skenovacího stolku je také automatické snímání velkých obrázků v rozsahu několika zorných polí použitého objektivu. Užitečnou výhodou stolku je rovněž snadná automatická kalibrace objektivů nebo automatické zaostřování snímaných obrazů. 2.4. Software NIS-Elements 3.2 AR Program NIS-Elements je nejpoužívanější software pro obrazovou analýzy na VŠCHT Praha a jeden z nejpoužívanějších v ČR. Důvodem této obliby je to, že má českého výrobce Laboratory Imaging, s.r.o. a tudíž i českou jazykovou verzi, což je velmi výhodné především pro výuku. NIS-Elements je systém obrazové analýzy určený ke sledování, snímání, archivaci a ručnímu nebo automatizovanému měření preparátů. Používaný snímací systém nejčastěji tvoří optický přístroj (mikroskop, stereomikroskop resp. makrooptika, skener), dále kamera nebo digitální fotoaparát, nezbytný počítač a softwarové vybavení. Vybavení programu NIS- Elements je možné rozdělit do několika stupňů rozdělených podle náročnosti prováděné obrazové analýzy, v této laboratoři je používán nejvyšší stupeň nazvaný NIS-Elements Advanced Research. Software je zaměřen na vysoký výkon a co nejplynulejší chod experimentů. Dokáže bezchybně zvládnout snímání a zobrazení vícedimenzionálních obrázků až v šesti dimenzích naráz (X, Y, Z, vlnová délka, čas, multipoint). Dále disponuje škálou přídavných nástrojů pro úpravy nasnímaných obrazů, jakými jsou například velmi účinná dekonvoluce, modul rozšíření hloubky ostrosti (EDF) nebo obrazová databáze. Automatizovaná měření Automatizace měření má svůj velký význam u opakujících se měření. NIS-Elements pomocí binární vrstvy automaticky změří délkové a plošné parametry objektů. Automatickým měřením je možné měřit kolem 30 různých příznaků. Pro vytvoření libovolné požadované sekvence příkazů v sobě NIS-Elements zahrnuje pohodlně ovladatelný editor maker. Makra lze také vytvářet nahráváním či z historie příkazů. 6

Strukturovaný dokument NIS-Elements používá vlastní dokumenty, které se skládají z více vrstev. Takto strukturovaný dokument zaručuje nedestruktivní archivaci obrazových dat včetně anotací (šipek, čar, textových poznámek), naměřených dat, binárních vrstev (pro uložení výsledků prahování a klasifikace) a tzv. meta-dat (s informacemi o nastavení snímání a podmínkách experimentu). Každý dokument (tedy okno s obrazem) se skládá ze tří-vrstevné struktury, která je ideální pro zpracování obrazu. Pro ukládání více vrstev do jednoho dokumentu jsou ideální formáty JPEG2000 a ND2. Anotační vrstva - je vrstva uchovávající anotační objekty (šipky, textové poznámky) a objekty manuálního měření ve vektorovém formátu. Binární vrstva - Binární vrstva je rastrový obraz, jehož pixely mohou nabývat jen dvou hodnot (např. černá/bílá). Binární obraz vzniká často jako výsledek nějaké transformace, např. prahování. Nejčastěji se používá pro provádění automatických měření na naprahovaných objektech. Pro jeden obraz může být vytvořena více než jedna binární vrstva. Obrazová data - tato vrstva obsahuje samotná obrazová data. Když otevřete obraz uložený na disku, nahraje se do této vrstvy. Může obsahovat obrazy s bitovou hloubkou až 16 bitů na složku. Rozměry této vrstvy určují zobrazení všech ostatních vrstev dokumentu. NIS-Elements pracuje s formáty obrazových souborů jako jsou JPEG2000, TIFF, JFF, JPG, JTF, BMP, LIM, AVI, ICS/IDS. Navíc je zde formát ND2 vyvinutý přímo pro NIS-Elements. Tento unikátní formát umožňuje uložit sekvence obrazů nasnímaných během ND experimentů. Obsahuje kompletní informace o nastavení hardware a podmínkách experimentu. Analýza obrazu a rozšířené možnosti zpracování obrazu Inovativní přístup ke zpracování obrazu NIS-Elements nabízí uživateli široké možnosti jak při snímání tak i analýze obrazu. Rozšířené metody vizualizace, snímání 3D dat, analýza 2D/3D dat a sešívání velkých obrazů jsou za pomoci NIS-Elements hračkou. 7

Morfologie NIS-Elements nabízí široké spektrum funkcí matematické morfologie (vyčištění, eroze, dilatace, otevření, zavření, vyhlazení), funkce morfologického oddělení, lineární morfologické funkce, výplňové funkce (vyplnit díry, zavřít díry), funkce skeleton (střední osa, skelet, vyčištění) a další funkce (jako: binární inverze, konvexní obálka, obrysy, homotopické značkování, zóny vlivu, atd.) Spojování kanálů V NIS-Elements je možné spojit dohromady několik jednokanálových obrazů (nasnímaných s různými optickými filtry nebo s různým nastavením kamery). Obrazy spojíte jednoduše táhnutím myši z jednoho obrazu do druhého. A navíc, zkombinovaný obraz můžete uložit do nového souboru se zachováním původní bitové hloubky. Nebo můžete zkombinovaný výsledek konvertovat do RGB obrazu. Sešívání velkých obrazů NIS-Elements zahrnuje i možnost sešívání velkých obrazů. Obrazy automaticky nasnímejte pomocí motorizovaného XY stolku se zapnutým automatickým zaostřováním. Snímky se spojí do jednoho velkého obrazu. Speciální algoritmy zajišťují maximální přesnost, výsledkem je pak obraz ve vysokém rozlišení. Obecný postup analýzy obrazu programem NIS-Elements Advanced Research je následující: 1. Sejmutí obrazu Po spuštění programu NIS-Elements se objeví dialogové okno, ve kterém uživatel volí, zda bude snímat pomocí kamery nebo použije simulátor snímání případně nebude obrázky vůbec snímat obrázky pomocí programu NIS-Elements, ale pouze analyzovat již dříve získané snímky. Stisknutím tlačítka Živý obraz na horní liště se v hlavním okně programu zobrazí aktuální obraz, který snímá kamera. Pro korekci světelných a barevných vlastností obrazu se používá funkce Nastavení kamery v nabídce Snímání resp. v pravé části obrazovky na záložce Nastavení kamery. Pokud obrázek odpovídá představám uživatele, stiskne se tlačítko Sejmout na horní liště a tak se obrázek převede do počítače. Doporučuje se obraz ihned uložit do počítače pomocí pokynu Uložit v nabídce Soubor. 2. Otevření obrazu Obraz sejmutý jinak než přímo online kamerou se otevírá jednoduše příkazem Otevřít v nabídce Soubor. 8

3. Úprava barevného obrazu nabídka Obraz Oříznout Pokud naskenovaný obraz obsahuje zbytečně mnoho pozadí a objektů, které nebudou analyzovány, je možné příkazem Oříznout upravit velikost obrazu tak, aby obsahoval všechny objety, které mají být analyzovány a pokud možno minimum rušivých částí. Oříznout je možné pouze do tvaru obdélníku a výběr se nastaví táhnutím myši a potvrdí tlačítkem Enter. Kontrast Pokud se sledované detaily v obraze svou světlostí málo liší od ostatních objektů, pak je možné jejich kontrast zvýšit funkcí Kontrast (pro šedý obraz) příp. Kontrast složek pro zvýraznění barevných složek obrazu. Při posouvání hodnot kontrastu na stupnici se v náhledu zobrazuje porovnání původního a upraveného obrazu. Upravit obraz Funkce v nabídce Upravit obraz umožňují další změny barev a intenzity v obraze, jako jsou například matematické transformace jednotlivých barev, změna sytosti nebo odstínu apod. Vyhladit/Zaostřit Tyto funkce potlačí resp. zvýrazní detaily v obraze. Velikost/Otočit/Převrátit/Posunout Tyto funkce manipulují s obrazem a upravují jeho rozměry. Detekce Funkce v menu Detekce vyhledávají a zvýrazní (zvýšením světlosti) určité vlastnosti obrazu, jako jsou hrany nebo oblasti, kde hodnoty světlosti vytvářejí tzv. údolí nebo vrcholy,tj. lokální minima nebo maxima. Morfologie Morfologické funkce upravují objekty v obraze tak, že je zmenší nebo odstraní (Eroze), zvětší a příp. spojí (Dilatace), vyhladí kontury, odstraní malé objekty, rozpojí objekty spojené tenkou šíjí (Otevření) nebo zaplní díry, vyhladí okrajové trhliny a spojí blízké objekty (Zavření). 4. Transformace obrazu Konverze Tato funkce z nabídky Obraz převádí barevný obraz na šedý (Převést do šedého obrazu), obraz vyjádřený RGB (červená, zelená, modrá) stupnicí převedou na HSI (odstín, sytost, světlost) stupnici (Převést RGB na HSI) a naopak (Převést HSI na RGB). Dále je možné z obrazu vybrat jednu barevnou vrstvu příp. určitou hodnotu světlosti, odstínu a převést ji do šedé stupnice (Vytáhnout složku - výsledkem je tedy šedý obraz vytvořený na základě specifických požadavků uživatele). Prahování Prahování je jedna z nejdůležitějších funkcí obrazové analýzy, která převádí barevný nebo šedý obraz na binární (tj. obraz, ve kterém jsou pouze dvě hodnoty barev obvykle černá a bílá). Program NIS-Elements dovoluje prahovat (tedy stanovit práh mezi pozadím a objekty v binárním obraze) podle jednotlivých barevných složek obrazu (Prahování resp. Prahování po složkách), podle hodnot HSI (Prahovat podle HSI) a nebo podle předem stanovené reference (Prahování podle reference). 5. Editace binárního obrazu nabídka Binární Otevření/Uzavření/Eroze/Dilatace/Vyčištění/Vyhlazení Tyto funkce jsou obdobou výše zmíněných funkcí pro barevný obraz, pouze pracují s binárním obrazem. Uzavřít díry/zaplnit díry Tyto funkce se používají v těch případech, kdy chceme např. měřit plochu objektů, ve kterých vznikly během prahování a jiných úprav kvůli odleskům nebo jiným jasovým odchylkám díry. První funkce uzavře díry, které jsou v úzkém místě otevřeny a druhá funkce pak takto uzavřené díry vyplní. 9

Konvexní obálka Funkce vytvoří konvexní obal kolem objektů (někdy to může pomoci, např. při pouhém počítání objektů, ale při měření plochy částic se tato funkce nedoporučuje vzhledem k tomu, že přidává objektům další pixely navíc, které by mohly rušit přesné měření). Obrysy - Tato funkce vyhledá a zvýrazní obrysy objektů. Morfologická separace objektů Tato funkce umí rozdělit objekty, které se řekrývají nebo dotýkají (oddělit objekty je možné i manuálně, nakreslením čáry do obrazu viz Vložit čáru, kruh, elipsu). Lineární/Pokročilá morfologie Tyto funkce provádějí jednoduché i velmi složité morfologické operace s objekty v obraze (pracují tedy s rozměry a tvarem objektů a mění je podle druhu funkce a požadavků uživatele). Zpracování po objektech Tato funkce umožňuje provádět příkazy (funkce) pro každý objekt zvlášť (příkazy se zadávají textově nebo výběrem ze seznamu). Vložit čáru, kruh, elipsu Pomocí této funkce je možné do obrazu vložit geometrický tvar v barvě objektů nebo pozadí binárního obrazu. Vkládání tvarů v barvě objektů se používá např. pro dokreslení objektu, pokud se jeho část prahováním odstranila a nebo pro přidání objektu, který při prahování zcela zmizel. barva pozadí se používá pro již zmíněnou separaci nakreslením úsečky mezi dvěma dotýkajícími se objekty nebo vymazání nežádoucích objektů. 6. Výběr objektů v obraze nabídka Měření Editace masky Editor masky Slouží k úpravě barevného i binárního obrazu tak, aby neobsahoval nežádoucí objekty, které by mohly rušit analýzu nebo naopak k výběru požadovaných objektů. Po spuštění editoru se změní levá i horní lišta programu. V levém rohu se volí, zda budou maskou označeny objekty, které se mají analyzovat (přepnutím čtvercového políčka na pozici FG - ), nebo naopak objekty, které se mají přesunout do pozadí (pozice BG ). Dále se volí nástroj, kterým se bude masku vytvářet (obdélník, kruh, linii, elipsu či libovolný jiný i nepravidelný tvar). Pravidelné tvary se vytvoří pouhým zakreslením tvaru do obrazu potažením myši, nepravidelný tvar se vytvoří vyznačením několika bodů určujících rozměry a tvar masky a nakonec potvrzením vykreslení masky pravým tlačítkem myši. Když je maska hotová (může mít i několik částí), editor se zavře a pokračují další úpravy a analýzy obrazu. 7. Měření nabídka Měření Interaktivní měření Toto měření umožňuje uživateli provádět přímá měření objektů s okamžitým výstupem naměřených údajů ve zvolených jednotkách. Můžeme si vybrat z těchto parametrů: Délka, Plocha, Profil intenzity, Taxonomie, Počet, Poloměr, Poloosy, Úhel. Měření jednotlivých objektů Při použití této funkce program změří předem nastavené parametry všech objektů v binárním obraze; nejprve je nutné nastavit Příznaky pro měření objektů, příp. Omezení hodnot příznaků (tedy nastavení mezí měření), poté Změřit objekty a nakonec je možné přečíst Výsledky měření objektů. Měření polí Obdobně jako jednotlivé objekty je možné měřit pole, kdy jsou změřeny zvolené parametry objektů (Příznaky pro měření polí) a zprůměrňovány pro všechny objekty dohromady (tj. za celé pole). Měřicí rámeček Toto je velmi důležité nastavení rámečku určujícího, které objekty v obraze budou (uvnitř rámečku) a které nebudou (vně rámečku) měřeny; rámeček je možné upravit i po stisknutí klávesy F popotažením jeho okrajů myší. Rámeček má 10

strany označeny dvojím způsobem, čárkovanou a plnou čárou. Objekty, které se dotýkají plné čáry (levý a spodní okraj rámečku) nebudou do měření započítány. Objekty dotýkající se čárkované linky (pravý a horní okraj rámečku) se do měření započítávat budou. 8. Vytvoření makra nabídka Makro Makro slouží k tomu, aby uživatel nemusel při opakovaných analýzách vždy znovu nastavovat všechny použité funkce, ale mohl celý sled funkcí spustit pouhým jedním kliknutím. Nové, Otevřít - Zde se vytvoří a uloží nové makro nebo otevře makro již hotové. Vytvoření a pojmenování nového makra je nutné udělat před začátkem nahrávání makra, jinak bude sled funkcí zapisován do přednastaveného makra s názvem pracovní.mac. Záznam (F3) - Pokud je zvoleno požadované makro (nové, již dříve vytvořené nebo pracovní), spustí se klávesou F3 záznam funkcí a dále se provádí analýza tak, jak si to uživatel předem vyzkoušel. U dříve vytvořeného nebo pracovního makra budou dříve zaznamenané funkce přepsány příp. zachovány a k nim budou přidány funkce nové (podle toho, jak si uživatel vybere v dialogovém okně, které se objeví po stisku klávesy F3). Po provedení všech úprav a měření v obrazu se nahrávání makra ukončí opět tlačítkem F3 a nebo v nabídce Makro pokynem Zastavit záznam. Editovat (F8) Zde je možné editovat makro jako textový program, tedy textově měnit parametry funkcí, mazat nebo přidávat funkce. Tato funkce je určena především pro zkušenější uživatele programu NIS-Elements. 11

3. Úkoly: 1) Sejmout obraz velké plochy polydisperzní sypké směsi pomocí mikroskopu Nikon, automatizovaného stolku Prior, digitální kamery Jenoptik ProgRes CT3 a softwaru NIS-Elements. 2) Pomocí prahování vytvořit binární obraz s cílem odlišit analyzované částice od pozadí. 3) Pomocí software NIS-Elements sestavit posloupnost funkcí pro vyhodnocení plochy a počtu jednoho druhu částic ve směsi. 4) Výsledky analýzy exportovat do programu Excel a vyhodnotit tabulkou i grafem. 12

4. Postup práce: 4.1. Pracovní plocha a základní ovládání Po zapnutí počítače se přihlašte do sítě VŠCHT pod zadaným přihlašovacím jménem a heslem. Z plochy zpusťte program NIS-Elements 3.2 AR. Během startu budete vyzváni k volbě grabberu. Zvolte kameru Jenoptik ProgRes CT3. Po naběhnutí programu zařaďte na otočném karuselu mikroskopu objektiv 5x a aktivujte jej v horní liště vhodnou ikonou. Na skenovací stolek položte pod objektiv zadaný vzorek. Aktivujte živý obraz talčítkem v horní liště nebo stiskem klávesy [+]. Nechte proběhnout automatické zaostření stiskem kláves Ctrl + f. Většinu pracovní plochy zabírá pohled na snímaný vzorek tzv. živý obraz, případně sejmutý snímek. Po pravé straně živého obrazu se nacházejí tzv. dokovací okna, která nám usnadňují snadné ovládání důležitých funkcí programu. Dokovací okna lze libovolně zavírat nebo vyvolávat z menu stiskem pravého tlačítka myši v ploše mimo živý obraz. Během práce budou využita tato dokovací okna: a) ovládací prvky snímání - ProgRes CT3 Color Nastavení b) ovládací prvky snímání - XYZ navigace c) ovládací prvky analýzy - Anotace a interaktivní měření Celkový pohled na pracovní plochu softwaru NIS-Elements 3.2 AR: 13

Dokovací okno nastavení kamery ProgRes CT3: V dokovacím okně ProgRes CT3 Color Nastavení lze měnit parametry snímající kamery. Kromě nastavení rozlišení obrazu (tlačítko [Příkazy] - volba [Pokročilé nastavení kamery]) využijeme během práce funkci [Auto expozice] a [Auto bílá]. Dokovací okno ovládání skenovacího stolku: virtuální joystick K ovládání skenovacího stolku použijte dokovací okno XYZ Navigace. Pohyb stolku můžete ovládat virtuálním joystickem ve všech prostorových osách. Stolek lze rovněž ovládat šipkami v osmi směrech XY kolem joysticku. Posouvají stolkem v diskrétních krocích definované velikosti. Využít lze hrubého a jemného kroku, přičemž velikosti kroků definujeme v pravé části okna. Totéž platí pro pohyb pomocí šipek ve směru osy Z. Další možností ovládání je přímé najetí stolku na zadanou pozici určenou XYZ souřadnicemi. V polích [Prior XY Drive] a [Prior Z Drive] lze zadat jakoukoli souřadnici v dovolených mezích a přemístit se na zadanou pozici tlačítkem [Najet]. 14

4.2. Sejmutí obrazů Na vhodnou podložku nasypte a rovnoměrně rozmístěte sypkou směs. Zaostřete na povrch vzorku 1) pomocí dokovacího virtuálního joysticku v okně XYZ Navigace 2) pomocí funkce automatické zaostření (ctrl+f). Pomocí dokovacího okna XYZ Navigace najděte místo s rovnoměrnou distribucí rozptýlených částic. Dbejte na rovnoměrné rozmístění částic také v okolí daného zobrazovaného pole. V dokovacím okně "ProgRes CT3 Color Nastavení" proklikněte tlačítka [Auto expozice] a [Auto bílá]. Doba expozice by se měla pohybovat okolo 50ms, v žádném případě by neměla klesnout pod 40ms. V menu [Snímání] zadejte volbu [Sejmout velký obrázek automaticky]. Zobrazí se dialogové okno "Snímání velkých obrázků". Nastavte několik parametrů: o Počet polí X a Y: zadejte 3 x 3. o Rozhodněte zda-li má být aktuální živý obraz středem snímaného velkého obrazu nebo jeho levým horním rohem. o Zvolte způsob zaostřování během získávání jednotlivých snímků. K dispozici je automatické doostření, ruční doostření nebo snímání bez zaostřování mezi jednotlivými snímky. o Hodnota překryvu: zadejte 15%. Stiskněte tlačítko [Skenovat] a nechte proběhnout proces nasnímání a složení velkého obrázku. Ořízněte případné nerovnosti v krajích obrazu. Jsou způsobené drobnou odchylkou rovnoběžnosti světelného paprsku a osy pozorování (nepřesnost přišroubování kamery). Analýzou výsledného velkého obrázku provedete v jednom kroku devítinásobné množství práce ve srovnání s postupnou analýzou devíti jednotlivých polí! 4.3. Analýza obrazu Podle obecné části návodu si vyberte takové funkce programu, které jsou pro analýzu vhodné nebo dokonce nezbytné. Důležitá je nejprve úprava snímku tak, abyste zvýraznili analyzované částice a potlačili pozadí a maximum nežádoucích částic. Poté je nutné snímek vhodně naprahovat a převést na binární (funkce Definice prahování). Pokud jsou v obraze nějaké binární objekty, které neodpovídají částicím analyzované sypké směsi, pak je odstraňte použitím masky (funkce Editace binárního obrazu ). Zkontrolujte nastavení měřícího rámečku (ikona na pravé svislé liště) a případně upravte jeho rozměry tak, aby zabíral celý snímek s výjimkou úzkého okraje snímku (plocha, kde jsou částice uříznuty krajem snímku). Nyní nastavíte parametry měření (funkce Příznaky pro měření objektů) tak, aby program změřil plochu (Area) 15

analyzovaných částic. Nakonec už jen pustíte měření (Změřit objekty) a zobrazíte si naměřená data výsledky měření objektů). Výsledky exportujte do programu Excel a vyhodnoťte průměrnou plochu částic analyzované sypké směsi. Doporučený postup práce je následující: o Obraz - Upravit kontrast (zvýraznit částice analyzované sypké směsi, potlačit pozadí a příměsi). o Obraz Prahování (převod obrazu na binární). o Binární Vyčištění obrazu (odstranění malých částic), Zaplnění děr, Separace objektů (oddělení dotýkajících se zrnek), Editace binárního obrazu (odstranění zbylých nežádoucích částic z obrazu). o Měření Nastavení Příznaků pro měření objektů, Změření objektů. o Měření Výsledky měření objektů (export naměřených dat do souboru). 5. Vyhodnocení výsledků: Výsledný protokol by měl obsahovat: a) Tabulku nastavení parametrů snímání obrazu (zvětšení mikroskopu, formát ukládaného obrazu, velikost uloženého obrazu). b) Tabulku funkcí obrazové analýzy (pořadí, název, jednoduchá specifikace tj. funkce z dokovacího okna Anotace a Interaktivní měření). c) Tabulku naměřených hodnot ploch analyzovaných částic (μm 2 ). d) Vypočtenou průměrnou hodnotu plochy analyzovaných částic (μm 2 ). e) Závěr s vyhodnocením výsledků celého měření. 16