MINERÁLNÍ LÁTKY Definice: složky potraviny, které zbývají po úplné oxidaci organické matrice vzorku (složky popela potraviny). Klasifikace podle množství: příklady podle příklady významu: majoritní prvky K, P, Ca, Mg, esenciální Na, K, Cl, P, (tisíce mg/kg) Cl Ca, Mg, Fe, Zn, Cu, Mn, Se, I... minoritní Na, (Al, Fe, toxické As, Cd, Pb, Hg (desítky-stovky mg/kg) stopové (desítky mg/kg a méně) Mn) Fe, Zn, Cu, Mn, Ni, Co, I, Se, Mo, As neesenciální (Al, Sn) Důvody pro stanovení minerálních látek v potravinách kontrola složení výrobku přirozený obsah esenciálních prvků fortifikace sloučeninami Ca, Fe... hygienická jakost (obsah toxických prvků) technologická jakost Stanovení popela obsah popela je hrubý ukazatel množství minerálních složek ve vzorku vážkové stanovení popela: navážka vzorku v porcelánové misce (kelímku) se po vysušení zuhelní a zpopelní v elektrické peci (550-600 C, 1-4 h), popel se zváží stanovení nerozpustného popela (písku): popel se vyluhuje 3M HCl, nerozpustné látky se odfiltrují, vysuší a zváží 1
OBECNÉ SCHEMA ANALYTICKÉHO POSTUPU PŘI STANOVENÍ MINERÁLNĆH PRVKŮ PŘÍPRAVA VZORKU K ANALÝZE, PŘÍPRAVA SLEPÝCH VZORKŮ (SEPARACE A ZAKONCENTROVÁNÍ ANALYTU) MĚŘENÍ KONCENTRACE PRVKU VE VZORKU A SLEPÝCH VZORCÍCH VÝPOČTY (výpočet meze detekce, výpočet obsahu prvku ve vzorku) 2
PŘÍPRAVA VZORKU K ANALÝZE většinou spočívá v převedení vzorku do vodného roztoku minerální kyseliny. Typ vzorku Způsob úpravy Anal. koncovka kapalné vzorky zředění roztokem AAS, ICP-AES (mléko, nápoje...) HNO 3, surfaktantů... kapalné extrakce zředěnou HCl AAS, ICP-AES (oleje, tuky) nebo HNO 3 za horka tuhé potraviny rozklad AAS, ICP-AES, spektrofotometrie, voltametrie... ROZKLAD VZORKU zajišťuje částečnou nebo úplnou destrukci organické matice vzorku a převedení analytu (analytů) do roztoku. Většinou se jedná o oxidační rozklad nebo o kombinaci hydrolýzy a oxidace vzorku. Metody rozkladu na suché cestě klasický suchý rozklad (zpopelnění) moderní verze suchého rozkladu na mokré cestě v otevřených nádobách za atmosferického tlaku v uzavřených nádobách za zvýšeného tlaku kombinované postupy 3
KLASICKÝ SUCHÝ ROZKLAD (ZPOPELNĚNÍ) probíhá v otevřených nádobách (Pt, křemenné kelímky, kádinky z křemenného nebo borosilikátového skla) za atmosferického tlaku a za přístupu vzduchu (oxidační agens je vzdušný kyslík) popel výluh popela v HNO 3 nebo HCl navážka 1-25 g sušiny pomocná činidla HNO 3, Mg(NO 3 ) 2, K 2 SO 4, H 2 SO 4 použitelnost: nevhodné pro stanovení Hg, P, Sn, (Se); při stanovení As a/nebo Se nutný přídavek Mg(NO 3 ) 2 Fáze procesu Teplota a čas Zařízení 1.sušení <110 C topná deska 1-2 h nebo 2.zuhelnění < 350 C 8-20 h 3.spalování (zpopelnění) 4.loužení popela 450-500 C 12-20 h 20-100 C 0,5-1 h program. pec topná deska nebo program. pec běžná nebo program. pec topná deska nebo ultrazvuk. lázeň Pozn. možnost přídavku pom. činidla* pomalý nárůst teploty po ukončení možnost přídavku pom. činidla** výsledná konc. kyseliny: 0,1-1M HNO 3 nebo HCl * zpravidla roztok Mg (NO 3 ) 2 nebo roztok K 2 SO 4 nebo H 2 SO 4 **nejčastěji se po skončení spalování přidává HNO 3, odpaří se do sucha a krátce (1-4 hod.) se žíhá v peci při 450-500 C Výhody zpopelnění vysoká účinnost rozkladu velké navážky vzorků rozklad většího počtu vzorků nízké náklady malá spotřeba reagencií malá bezpečnostní rizika Nevýhody zpopelnění ztráty analytů není univerzální kontaminace vzorků časová náročnost 4
ROZKLAD NA MOKRÉ CESTĚ ZA ATMOSFERICKÉHO TLAKU = rozklad kyselinami v otevřeném nebo polouzavřeném systému (varná nádoba + zpětný chladič) obecně více univerzální, než suchý rozklad, je však nevhodný pro stanovení halogenidů (F -, Cl -, Br -, I - ) doba rozkladu - několik hodin až několik desítek hodin navážka 0,5-3 g sušiny (výjimečně 5g sušiny), menší navážky (0,2-1 g sušiny) při použití HClO 4 v mineralizační směsi a zvýšení navážky- riziko exploze! důležitý faktor - vhodně zvolený teplotní režim (výtěžnost, bezpečnost práce) pro stanovení Hg je nutná polouzavřená skleněná aparatura se zpětným chladičem a pojistnou trubicí s HNO 3 Používaná činidla teploty pozn. zředěná HCl 60-120 C pouze hydrolýza - solubilizace vzorku HCl+HNO 3 (3+1) 60-120 C pro rozklad půdy HNO 3 +H 2 SO 4 60-180 C nejběžnější směs, ztráty Se, (As), nerozpustné sírany Ca, Sr, Ba, Pb, přijatelné ztráty Hg HNO 3 (+H 2 O 2 ) 60-120 C malá účinnost rozkladu, ztráty Hg HNO 3 +H 2 SO 4 +H 2 O 2 60-180 C nižší ztráty Se, As HNO 3 +H 2 SO 4 +HClO 4 60-210 C vysoká účinnost rozkladu, vhodné pro stanovení Se, As, ztráty Pb, malé ztráty Hg, riziko exploze HNO 3 +HClO 4 60-200 C beze ztrát Pb, ztráty Hg, větší riziko exploze Při použití směsi HNO 3 s H 2 SO 4 a/nebo HClO 4 se po ukončení rozkladu obvykle ze směsi odpaří HNO 3. 5
ROZKLAD NA MOKRÉ CESTĚ ZA ZVÝŠENÉHO TLAKU uzavřené reakční nádoby : z teflonu (PTFE...) - teplotní limity 240-260 C, z křemenného skla - max. používaná teplota cca 320 C navážky 0,2-1g sušiny (velká navážka exploze!) činidla: většinou HNO 3 nebo HNO 3 + H 2 O 2 ohřev a) celé nádoby konvekcí, b) mikrovlnný ohřev teplota se zvyšuje postupně nad t.v. HNO 3 (122 C), max. teplota (většinou 180-240, někdy až 300 C) a prodleva při ní ovlivňují účinnost rozkladu bezpečnost: oxidací vzorku se uvolňují oxidy dusíku, CO 2 a H 2 O tlak v nádobce roste na desítky MPa, proto jsou reakční nádobky umístěny v masivních pouzdrech; nutnost tlakových pojistek (vypnutí mikrovlnného ohřevu, řízená expanze) doba celého procesu (rozklad + chlazení) obvykle desítky minut Výhody tlakového rozkladu minimální ztráty analytu minimální kontaminace vyřazení HClO 4 z použití vyšší bezpečnost práce, vyřazení H 2 SO 4 eliminace interferencí menší spotřeba kyselin rychlý rozklad (zvláště mikrovlnná zařízení)- možnost automatizace Nevýhody tlakového rozkladu dražší zařízení menší navážky nižší účinnost rozkladu při teplotách cca 200 C 6
STANOVENÍ MINERÁLNÍCH LÁTEK TITRAČNÍMI A VÁŽKOVÝMI METODAMI Základní omezení: pouze stanovení majoritních prvků Stanovení hořčíku a vápníku komplexometrickou titrací při analýze vzorků potravin je nezbytné použít zpětnou titraci (přítomnost fosforečnanů způsobuje chyby při přímé titraci) 1) stanovení sumy Mg+Ca: alikvotní podíl výluhu popela + amoniakální pufr + přebytek odměrného roztoku chelatonu 3 + ErioT: ionty Mg 2+ a Ca 2+ jsou kvantitativně převedeny na cheláty MgY 2- a CaY 2-, následuje zpětná titrace nadbytku chelatonu odměrným roztokem hořečnaté soli: Y 4- + Mg 2+ MgY 2- (barevný přechod modrá vínová) 2) stanovení Ca: alikvotní podíl výluhu popela + KOH ph 12 (vysrážení Mg 2+ jako Mg(OH) 2 ) + přebytek chelatonu 3 + fluorexon: ionty Ca 2+ jsou kvantitativně převedeny na chelát CaY 2-, následuje zpětná titrace nadbytku chelatonu odměrným roztokem vápenaté soli známého titru: Y 4- + Ca 2+ CaY 2- (růžové zbarvení zelená fluorescence) Vážkové stanovení vápníku z výluhu popela v HCl se po zalkalizování amoniakem vylučuje přídavkem šťavelanu amonného sraženina CaC 2 O 4.H 2 O. Sraženina se odfiltruje a promyje, odpařením se zředěnou H 2 SO 4 do sucha se šťavelan převede na síran, po vyžíhání se váží jako CaSO 4. 7
Stanovení vápníku manganometrickou titrací Ca 2+ + C 2 O 4 2- CaC 2 O 4 CaC 2 O 4 + 2 H 2 SO 4 H 2 C 2 O 4 + Ca 2+ + 2 HSO 4-5 H 2 C 2 O 4 +2 MnO 4 - + 6 H + 10 CO 2 + 2 Mn 2+ + 8 H 2 O Vážkové stanovení hořčíku z kyselého výluhu popela se po úpravě ph amoniakem vyloučí přídavkem fosforečnanu sodného nebo amonného sraženina NH 4 MgPO 4.6H 2 O. Po odfiltrování a promytí se převede žíháním na Mg 2 P 2 O 7, který se váží. Vážkové stanovení fosforu po mineralizaci vzorku na mokré cestě roztok obsahuje jako jedinou sloučeninu fosforu kyselinu trihydrogenfosforečnou. Fosforečnanové ionty se pak ze slabě amoniakálního prostředí srážejí hořečnatou solucí (roztok MgCl 2 +NH 4 Cl) jako NH 4 MgPO 4.6H 2 O. Žíháním se sraženina převede na formu k vážení difosforečnan hořečnatý Mg 2 P 2 O 7. Argentometrické stanovení chloridů Příprava vzorku: zpopelnění, výluh popela v horké vodě Mohrova metoda: přímá titrace Cl - odměrným roztokem AgNO 3 na indikátor K 2 CrO 4 : Cl - + Ag + AgCl (bílá sraženina ve žlutém roztoku hnědočervená sraženina Ag 2 CrO 4 ) Volhardova metoda: přídavek přebytku AgNO 3, zpětná titrace odměrným roztokem NH 4 SCN nebo KSCN na indikátor Fe 2 (SO 4 ) 3 (bílá suspenze červené zbarvení) 8
STANOVENÍ PRVKŮ ATOMOVOU ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIÍ AAS umožňuje stanovit téměř všechny kovy, stanovení některých nekovů (B, Si) je možné jen s obtížemi Plamenová AAS (F AAS) slouží v analýze potravin hlavně ke stanovení esenciálních prvků s vyšším obsahem (Na, K, Mg, Ca, Fe, Mn, Zn, Cu) Plameny C 2 H 2 vzduch: Na, K, Mg, (Ca), Fe, Zn, Mn, Cu... C 2 H 2 N 2 O: (Mg, Ca), Al, Sn, (Si, Mo, Cr, V...) Vlastnosti F AAS citlivost: vyjadřuje se nepřímo jako charakteristická koncentrace (c [mg/l] A= 0,0044) mez detekce: obvykle o něco menší, než charakter. konc. koncentrační rozsah: stanovení prvků v koncentracích desetin až stovek mg/l možno měnit výběrem z několika spektrálních čar prvku (nižší nebo vyšší citlivost), otočením hořáku kolmo vůči paprsku (podstatné snížení citlivosti, tj. posunutí pracovního rozsahu do vyšších koncentrací) kalibrace: obecně nelineární, používá se 3-10 stand. roztoků rychlost analýzy: velmi vysoká (cca 4-5 roztoků za minutu) shodnost (opakovatelnost) měření: v optimálním konc. rozsahu velmi příznivá (RSD < 0,5%) správnost: při použití adekvátních podmínek atomizace (druh plamene, složení palivové směsi, eventuálně přídavek uvolňovacích a deionizačních činidel) velmi dobrá nároky na přípravu vzorku: kapalné vzorky lze analyzovat po zředění přímo, u tuhých postačuje částečný rozklad (solubilizace vzorku) 9
Podmínky stanovení některých prvků plamenovou AAS Prvek λ [nm] d [nm] Plamen Charakter. koncentrace Optimální koncentrační rozsah [µg/ml] [µg/ml] Al 309,3 0,2 C 2 H 2 -N 2 O 0,75 35-140 As 193,7 1,0 C 2 H 2 -N 2 O 1,2 55-220 Ba 553,6 0,2 C 2 H 2 -N 2 O 0,20 10-40 Ca 442,7 0,2 C 2 H 2 -N 2 O 0,013 0,5-2,5 239,9 0,1 C 2 H 2 -N 2 O 2,6 120-470 Cd 228,8 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,011 0,5-2,0 Co 240,7 0,1 C 2 H 2 -vzduch 0,053 2,5-10 Cr 357,9 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,055 2,5-10 Cu 324,7 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,04 2-8 Fe 248,3 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,045 2-8 Hg 253,7 0,5 C 2 H 2 -vzduch 2,2 100-400 K 766,5 1,0 C 2 H 2 -vzduch 0,009 0,4-1,6 404,4 0,1 C 2 H 2 -vzduch 3,3 150-600 Mg 285,2 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,003 0,1-0,6 202,5 1,0 C 2 H 2 -vzduch 0,09 5-20 Mn 279,5 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,021 1-4 Na 589,0 0,5 C 2 H 2 -vzduch 0,003 0,15-0,6 330,2 0,5 C 2 H 2 -vzduch 1,5 70-270 Ni 232,0 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,05 2-10 Pb 217,0 1,0 C 2 H 2 -vzduch 0,11 5-20 283,3 0,5 C 2 H 2 -vzduch 0,23 10-40 Sb 217,6 0,2 C 2 H 2 -vzduch 0,29 10-50 Se 196,0 1,0 H 2 -vzduch 0,47 20-90 Sn 235,4 0,5 C 2 H 2 -N 2 O 1,1 50-200 Sr 460,7 0,5 C 2 H 2 -N 2 O 0,041 2-10 V 318,5 0,5 C 2 H 2 -N 2 O 0,75 35-130 Zn 213,9 0,5 C 2 H 2 -vzduch 0,009 0,4-1,6 10
Atomová absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací (ET AAS, GF AAS) používá se ke stanovení stopových a ultrastopových koncentrací prvků, v potravinářské analýze nejčastěji při stanovení kontaminujících toxických prvků Pb, Cd (As). Možné je samozřejmě i stanovení dalších prvků (Al, V, Cr, Mo, Ni, Co, Cu, Sn, Se...). Hlavní rozdíly ve srovnání s F AAS atomizátor je elektricky vyhřívaná (a chlazená) grafitová trubice umístěná v optické ose přístroje vzorek se dávkuje do atomizátoru jednorázově (5-50 µl), následuje pracovní cyklus: sušení (odpaření rozpouštědla) termický rozklad atomizace (pouze v tomto kroku se měří absorbance) čištění atomizátoru chlazení atomizátoru citlivost GF AAS je o 2-3 řády vyšší: vyjadřuje se jako tzv. charakteristická hmotnost (m 0 [pg] A = 0,0044) pracovní rozsah: obvykle setiny až desítky µg/l případně desetiny až stovky µg/l měření je mnohem pomalejší: 1 cyklus trvá cca 1-3 min shodnost: v oblasti nízkých koncentrací (desetiny až jednotky µg/l) je RSD opakovatelnosti cca 10 % správnost výsledků může být dotčena řadou rušivých vlivů (ztráty analytu během termického rozkladu, nespecifická absorpce...) vysoké nároky na kvalifikaci analytika nároky na přípravu vzorku: vyšší než v plamenové AAS, většinou je nejvhodnější tlakový rozklad kyselinou dusičnou 11
SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY STANOVENÍ PRVKŮ jsou nejčastěji založeny na vzniku barevných komplexních sloučenin kovů s organickými ligandy nebo na oxidačně redukčních reakcích. Koncentrace prvku se určuje měřením absorbance příslušného barevného roztoku. Spektrofotometrické stanovení fosforu H 3 PO 4 obsažená v mineralizátu tvoří s přebytkem molybdenanu amonného nebo sodného slabě žlutě zbarvenou kyselinu molybdátofosforečnou H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ], která silně absorbuje v UV (λ max = 310 nm). Redukcí molybdátofosforečné kyseliny (např. hydrazinem, askorbovou kyselinou, železnatou solí...) vzniká tzv. molybdenová modř směs heteropolykyselin molybdenu v oxidačních stupních V a VI. λ max je 660-820 nm v závislosti na podmínkách redukce (analogicky jako fosfor reagují také As, Si a Ge) Spektrofotometrické stanovení železa Fe 3+ poskytuje s rhodanidem v prostředí HCl červený komplex: Fe 3+ + n SCN - [Fe(SCN) n ] 3-n Fe 2+ dává s 2,2 -bipyridylem nebo 1,10-fenanthrolinem při ph 3-6 červený resp. červeno-oranžový komplex; Fe 3+ se předem redukuje hydroxylaminem na Fe 2+ Fe 2+ + 3 bipy [Fe(bipy) 3 ] 2+, λ = 522 nm, ε = 8700 l.mol -1.cm -1 Fe 2+ + 3 fen [Fe(fen) 3 ] 2+, λ = 512 nm, ε = 11000 l.mol -1.cm -1 N N bipyridyl N N fenanthrolin 12
Spektrofotometrické stanovení mědi reakcí Cu 2+ v roztoku vzorku (ph 4-11) s kupralem (diethyldithiokarbamát sodný) vzniká žlutý komplex nerozpustný ve vodě: Cu 2+ + 2 C 2 H 5 C 2 H 5 N C S SNa C 2 H 5 C 2 H 5 N S S C 2 H 5 C Cu C N + 2 Na + S S C 2 H 5 komplex lze vytřepat do CHCl 3, CCl 4, iamoh, amylacetátu..., λ = 436 nm, ε = 14000 l.mol -1.cm -1 (CCl 4 ). Měří se absorbance extraktu komplexu v organickém rozpouštědle. 13
ELEKTROCHEMICKÉ METODY STANOVENÍ PRVKŮ Potenciometrie s iontově selektivními elektrodami stanovení halogenidů (Cl -, F - ), stanovení NO 3 - a NO 2 - Polarografie a voltametrie se používá hlavně pro stanovení kovů, které tvoří se rtutí amalgám (Zn, Cd, Pb, Sn, Cu...) a stanovení Ni, Co, As, Se. Stanovení mědi a zinku se obvykle provádí diferenční pulsní polarografií (DPP) nebo voltametrií (DPV). Polarogafické (voltametrické) křivky mají tvar píků, jejichž výška je úměrná koncentraci prvku. Koncentrace prvků se určují metodou standardního přídavku. Stanovení mědi lze uskutečnit v kyselém výluhu popela (v 0,1-1M HNO 3 ) nebo ve zředěném mineralizátu, který obsahuje zbytkovou H 2 SO 4. Potenciál píku mědi je cca + 0,05 V. Před stanovením zinku je třeba upravit ph roztoku na > 2 přídavkem octanu sodného. Potenciál píku zinku v kyselém roztoku pufrovaném octanem je cca 0,9 V. DPV Ep = -700 mv (1): 5 ml vzorku v 0,2 M HNO3 + 1,5 ml 1M CH3COONa (2): (1) + 5 µg Zn, V = 6,75 ml (3): (1) + 10 µg Zn, V = 7,0 ml 14
Ke stanovení kadmia a olova (někdy i mědi) se obvykle používá vysoce citlivá metoda diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV). Kovy se nejprve z kyselého roztoku vzorku (např. z výluhu popela v 0,1-0,5M HNO 3 nebo HCl) nahromadí na pracovní elektrodu (např. visící rtuťovou kapku) elektrolýzou při negativním potenciálu (např. 0,8 V) a pak se elektrochemicky z elektrody rozpustí zpět do roztoku. Rozpouštění je dosaženo řízenou změnou potenciálu pracovní elektrody směrem k pozitivnějším hodnotám (2-20 mv/s). Během rozpouštění se měří hodnota proudu. Na křivce i=f(e) se objeví píky (pík Cd cca 0,55 V, pík Pb cca 0,35V), jejichž výšky jsou přímo úměrné koncentracím kovů. 15