MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno, rok 2012 Bc. Jana Adamcová 1
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ KALIBRACE A TERÉNNÍ VALIDACE PASIVNÍCH VZORKOVACÍCH ZAŘÍZENÍ PRO MONITORING NOVĚ SLEDOVANÝCH POLUTANTŮ VE VODÁCH DIPLOMOVÁ PRÁCE Bc. Jana Adamcová Vedoucí práce: Mgr. Jiří Kohoutek, Ph.D. Brno, 2012 2
Bibliografický záznam Autor: Bc. Jana Adamcová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Název práce: Kalibrace a terénní validace pasivních vzorkovacích zařízení pro monitoring nově sledovaných polutantů ve vodách Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Chemie životního prostředí Chemie životního prostředí Mgr. Jiří kohoutek, Ph.D. Akademický rok: 2012 Počet stran: 99 Klíčová slova: pasivní vzorkování, voda, polutanty, pesticidy, POCIS, vzorkovací rychlost, kalibrace, membrána, sorbent 3
Bibliographic Entry Author: Bc. Jana Adamcová Faculty of Science, Masaryk University Researche Centre for Toxic Compounds in the Environment Title of Thesis: Calibration and field validation of passive sampling device for monitoring of meeting aquatic pollutants Degree Programme:Environmental Chemistry Field of Study: Supervizor: Environmental Chemistry Mgr. Jiří Kohoutek, Ph.D. Academic Year: 2012 Number of Pages: 99 Keywords: passive sampling, water, pollutants, pesticides, POCIS, sampling rate, calibration, membrane, sorbent 4
Abstrakt Přítomnost pesticidních látek v životním prostředí a jejich působení na necílové organismy včetně člověka představuje velmi závažný problém. Vzhledem k potenciálním rizikům plynoucím z výskytu těchto látek je nezbytné mít k dispozici citlivé a robustní techniky pro jejich detekci. Tato diplomová práci se věnuje problematice pasivního vzorkování polárních látek a v praktické části především vývoji a laboratorní kalibraci pasivního vzorkovače určeného pro monitoring pesticidních látek v povrchové vodě. V rámci experimentů byly srovnávány různé konfigurace pasivního vzorkovače a jejich efektivita. Následně zvolený optimalizovaný vzorkovač byl nakalibrován a byly vypočteny vzorkovací rychlosti pro zvolenou sadu pesticidů. Abstract Presence of pesticides in the environment and their effects in non target species presents serious problem of these days. Regarding potential risks of tehese contaminants it is necessary to have sensitive and robust detection techniques. This thesis is devoted to the topic of passive sampling of polar compounds, especially polar pesticides in surface water. Experimental part of the thesis is focused on optimization and evaluation of performance of passive sampling device. Various configurations of the sampler were tested and calibrated in laboratory conditions. Finally sampling rates for given set of pesticides were calculated. 5
6
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu mé diplomové práce Mgr. Jiřímu Kohoutkovi Ph.D. za cenné rady, čas a všestrannou pomoc při vedení a vypracování této diplomové práce. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 13. května 2012 Bc. Jana Adamcová 7
OBSAH 1. Úvod,.12 2. Teoretická část....13 2.1. Pasivní vzorkování...13 2.2. Pasivní vzorkovače..15 2.2..1. Obecně..15 2.2..1.1. Základní informace..16 2.2..2. Typy pasivních vzorkovačů...17 2.2..2.1. Rovnovážné pasivní vzorkovače...20 2.2..2.2. Integrativní pasivní vzorkovače.24 2.3. HPLC/MS...32 2.4. Pesticidy.34 2.4..1. Osud pesticidů ve vodním prostředí.37 3. Experimentální část.39 3.1. Materiál a metody.39 3.2. Použité nástroje a vybavení 41 3.3. Konstrukce vzorkovače 42 3.4. Expozice, extrakce a instrumentální analýza...43 3.4.1. Vliv materiálu membrány na retenci pesticidů ve vzorkovači.44 3.4.1. Vliv materiálu sorbetu na retenci pesticidů ve vzorkovači...44 3.5. Kalibrace vzorkovače...45 3.5..1. Stanovení vzorkovací rychlosti v závislosti na rychlosti proudění 45 3.6. SPE (Solid Phase Exctraction)...47 8
3.7. Test výtěžnosti..48 3.8. Analýza pesticidů pomocí LC-MS..48 4. Výsledky a diskuze..50 4.1. Vliv materiálu membrány na retenci pesticidů ve vzorkovači 50 4.2. Vliv materiálu sorbentu na retenci pesticidů ve vzorkovači...51 4.3. Test výtěžnosti..53 4.4. Stanovení koncentrace analytův médiu pomocí SPE. 54 4.5. Stanovení vzorkovací rychlosti v závislosti na rychlosti prooudění..55 5. Závěr..58 6. Použitá literature..59 7. Přílohy 67 9
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK: API Cs Cw DEET Ionizace za atmosférického tlaku Koncentrace analytu ve vzorkovači Koncentrace analytu ve vodě N, N.diethyl-m-toluamid DG-SANCO Generální ředitelství pro zdraví a ochranu spotřebitele DI-SPME ESI GC/ECD GC/MS Odběr z matrice vzorku při SPME Elektrospray-Ionisation Plynová chromatografie s detektorem elektronového záchytu Plynová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií GC-SPME HLB HPLC/MS HS-SPME k 1 a k 2 Kow K SW LC-SPME MAX MCX MDMA MESCO Plynová chromatografie ve spojení s SPME Hydrophilic-lipophilic-balanced Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií Odběr z prostoru nad matricí při SPME Rychlostní konstanty Rozdělovací koeficient oktanol/voda Rozdělovací koeficient analyt/voda Kapalinová chromatografie ve spojení s SPME Mixed-mode anion exchange Mixed-mode cation exchange 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine Membrane Enclosed Sorptive Coating 10
NORMAN OCPs PAH PBDE PCB PCDD/F PDMS PFOA PFOS POCIS RECETOX Rs SBSE SEC SPE SPME TWA WHO YES Asociace referenčních laboratoří, výzkumných středisek a souvisejících organizací pro sledování nových znečišťujících látek v životním prostředí Organochlorované pesticidy Polycyklické aromatické uhlovodíky Polybromované difenylethery Polychlorované bifenyly Polychlorované dibenzopdioxiny / dibenzofurany Polydimethylsiloxan Perfluoroktanová kyselina Perfluoroktansulfonan Polar Organic Chemical Integrative sampler Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Vzorkovací rychlost Solid Bar Sorptive Extraction Size Exlusion Chromatography Extrakce na pevnou fázi Mikroextrakce na pevnou fázi Časově vážený průměr Světová zdravotnická organizace Test Yest Estrogen Screen 11
1. Úvod Voda je jednou ze základních podmínek pro existenci života na naší planetě. V současné době však dochází na mnoha místech k masivnímu znečišťování a degradaci vodních zdrojů. Tento stav je způsoben velmi často antropogenní činností. Daná situace se zatím nezlepšuje a v současném světě je jedním z největších problémů. Stejně jako se zvyšuje počet obyvatel na této planetě, roste i sucho a poptávka po vodě. Zásoby vody v mnoha oblastech jsou velmi omezené a je potřeba se o ně starat tak, aby mohly být opětovně použity jako zdroj pro zachování vodních ekosystémů a pitné vody. K veškerým škodlivým antropogenním vlivům se přidá i velké množství různých chemikálií, které jsou denně používány a dostávají se i do povrchových a podzemních zdrojů vody. Nejčastěji jsou těmito látkami pesticidy a léčiva. Pesticidy jsou sice užívány pro vyšší výnos zemědělských produktů a léčiva pro ochranu lidského zdraví, ale zároveň ohrožují a negativně ovlivňují životní prostředí. Mimo tyto látky se do vody dostává i řada jiných kontaminantů a to při jejich přepravě ze zdrojů, splachy z měst a půd. Jsou to látky jak organické (čistící a dezinfekční prostředky, ropné deriváty a organické uhlovodíky ), tak i anorganické (emise z průmyslové výroby, hnojiva, těžké kovy ). Kromě lidské činnosti ke znečištění vody přispívají i přirozené zdroje znečištění jako sopečná činnost, vyplavování toxických látek, sesuvy půdy, uhynulé organismy a mnoho dalších. Čistírny odpadních vod nejsou schopny všechny tyto látky z vody úplně odstranit. Proto je potřeba tyto látky v prostředí dlouhodobě monitorovat a hledat vhodné metody pro jejich stanovení. Cílem mé diplomové práce bylo vyvinout a nakalibrovat pasivní vzorkovač určený pro dlouhodobý monitoring vybrané skupiny látek-pesticidů v povrchové vodě tak, aby následně mohl být použit v terénních přírodních podmínkách a sloužil ke sledování koncentrací těchto škodlivých látek ve vodě. 12
2. Teoretická část 2.1. Pasivní vzorkování V dnešní době se více zaměřuje pozornost na monitoring znečišťujících a škodlivých látek v životním prostředí, jelikož jsou velkou hrozbou pro zdraví člověka a celého ekosystému. Prováděné odběry vzorků z prostředí slouží k analýze široké škály organických i anorganických látek. Zlepšením v oblasti analytických metod se zvýšily informace v oblasti životního prostředí o přítomnosti řady škodlivých látek v prostředí. Jedná se převážně o řadu léčiv, produktů pro osobní péči, směsí pesticidů a jiných znečišťujících látek, objevujících se ve stopovém množství. Tyto látky se do prostředí dostávají přímo ze zdrojů, jako jsou i odpadní vody z čistíren, úniky ze septiků a skládek, splachy povrchových vod atd. Ekologické dopady dlouhodobých expozic k nízkým koncetracím těchto aktivních sloučenin jsou většinou neznámé a je těžké provézt analýzu rizik [1],[2]. Aby bylo možné provést hodnocení expozice je v první řadě nezbytné mít co nejlepší přehled o koncentracích daných látek v konkrétní matrici. Jedním ze zásadních faktorů, které určují přesnost a správnost výsledné koncentrace konkrétní ho polutantu v matrici je vlastní vzorkování. Existuje celá řada přístupů, které je možné využít. Obecně lze vzorkovací metody rozdělit na aktivní vzorkování (tzv. konvenční bodový odběr) a pasivní vzorkování. Obě tyto metody se užívají pro monitoring různých polutantů v životním prostředí. Oba přístupy mají samozřejmě jisté výhody i nevýhody a výběr konkrétní metody je třeba podřídit požadavkům charakteru výsledků. Většina monitorovacích programů užívá pro vzorkování tzv. konvenční bodový odběr. To znamená jednorázový odběr vzorku v konkrétním místě a čase. Tento přístup má však celou řadu nevýhod, které se projevují především v případě látek jejichž koncentrace jsou velmi výrazně časově a prostorově variabilní. Výsledné koncentrace znečišťujících látek určené na základě bodových odběrů také vykazují velkou variabilitu a následně je velmi obtížné stanovit skutečnou průměrnou koncentraci, jejíž znalost je však nezbytná k správnému odhadu potenciálních rizik vyplývajících z přítomnosti konkrétních látek v prostředí. [3]. 13
Řada znečišťujících látek se vyskytuje v prostředí pouze v omezeném časovém intervalu a ve stopovém množství a jejich koncentrace při odběru je ovlivněna řadou faktorů (množství vody, klidový nebo proudící stav vody ). Následná laboratorní analýza tak nabízí jen výsek z hodnoty množství dané látky v prostředí v době odběru. Jedním z řešeních tohoto problému je zvýšení četnosti odběrů, nebo instalace automatických odběrových zařízení. To je ale v mnoha případech nákladné a nepraktické, a v jistých lokalitách takřka neproveditelné. Automatická odběrová zařízení totiž obvykle vyžadují obsluhu zkušených operátorů a přístup ke zdroji elektrické energie. V důsledku toho došlo v posledních dvou desetiletích k rozvoji alternativních metod, které minimalizují výše zmíněné nevýhody. Začaly se zavádět metody pasivního odběru vzorků, které se ukázaly jako velmi slibný nástroj pro měření širokého spektra prioritních znečišťujících látek. [4] Pasivní vzorkování slouží k odběru vzorků v delším časovém rozsahu. Jeho použití je snadné, levné a není potřeba zdroj energie. Vybavení používaná na pasivní vzorkování jsou malá a jednoduchá, což má velký význam, protože místa odběrů vzorků se často nachází daleko od laboratoře, ve které musí být provedeno další zpracování vzorků a analytické, popřípadě toxikologické vyhodnocení. Nevýhodou ale je nižší citlivost a možnost interference s jinými polutanty.[5] Jak uvádí studie Kočího a Grabice [6] význam použití těchto pasivních vzorkovačů zvyšuje možnosti interpretace. Nezobrazují okamžitou koncentraci látky, ale její dlouhodobou úroveň v prostředí, tedy koncentrace, které jsou často příčinou zdravotních problémů. Většina pasivních vzorkovačů je tedy zaměřená na detekci biodostupných forem sledovaných analytů, které bezprostředně vstupují do těla a negativně působí. 14
2.2. Pasivní vzorkovače 2.2.1. Obecně Pasivní vzorkovací zařízení mají dlouhou historii v oblasti použití při sledování znečišťujících látek v okolním životním prostředí a i přesto se stále dál rozvíjí. Jsou velmi perspektivním nástrojem pro dlouhodobé sledování hydrofilních i hydrofobních znečišťujících látek ve vodních ekosystémech. Vzhledem k tomu, že příjem chemických látek do tohoto zařízení je založen na procesu pasivního dělení směsi mezi vodou a lipofilním substrátem, mohou být tyto vzorkovače použity jako ukazatele biologické dostupnosti chemických látek. [7] Pro správný průběh pasivního vzorkování je potřeba, aby umístěné vzorkovače byly neustále ponořeny ve vodním prostředí s dostatečnou výměnou vody (alespoň minimální výměna vody v blízkém okolním prostředí). Množství vody potřebné pro výměnu závisí na druhu vzorkovače. [6] Podle Millse [1] tato zařízení pracují na principu, kdy nízká koncentrace znečišťující látky (blízko nuly) se udržuje na povrchu sorpční fáze s vysokou afinitou pro měřenou sloučeninu (viz obr.1). Tím je zajišťována průběžná difúze polutantu z vodní fáze na sorpční fázi. Nejdříve začne docházet k adsorpci analytu na vnějším povrchu membrány. Poté dojde k rozpouštění a šíření analytu přes membránu. A v posledním kroku k difúzi analytu z vnitřního povrchu membrány.[7] Separace je založena na rozdílu mezi koncentracemi kontaminantu v prostředí a v sorpčním médiu. Délka vzorkování závisí na době nutné pro ustanovení rovnovážného stavu. [5] Základní princip pasivního vzorkování je zachycen na obrázku č. 1. Látka volně prostupuje jednotlivými složkami systému z média až do receptorové fáze. Přenos látky je modulován použitím difúzní propustné membrány mezi médiem a sorbentem, který je příjemcem. Hybnou silou tohoto příjmu je rozdíl mezi chemickými potenciály analytu ve vodné a sorpční fázi. 15
Obr. č. 1. Schéma přestupu modelové látky z média do receptorové fáze přes jednotlivé komponenty pasivního vzorkovače [1] 2.2.1.1. Základní informace Pasivní vzorkovač je konstrukčně velmi jednoduché zařízení. Jeho základní součástí je sorpční médium (kapalné nebo pevné), které je obvykle od vzorkovaného prostředí odděleno polopropustnou membránou. V případě jednofázových pasivních vzorkovačů se od jejího používání upouští a vzorkovací médium je potom přímo v kontaktu s prostředím. Výběr a vlastnosti jak vzorkovacího média tak polopropustné mebrány jsou dány vlastnostmi sledovaného polutantu. Při průchodu analytu dochází k molekulární difúzi, která probíhá podle Fickových zákonů. Příjem polutantů do pasivního vzorkovače popisuje kinetická rovnice prvního řádu, kterou můžeme popsat pomocí následujícího matematického vztahu : k1 k2t CS ( t) = CW (1 e ) k 2 kde Cs (t) je koncentrace analytu v daném čase expozice ve vzorkovači, 16
Cw je koncentrace analytu ve vodném prostředí, k 1 a k 2 jsou rychlostní konstanty. [4] Po uplynutí doby expozice se vzorkovač z daného vzorkovacího místa odebere a přemístí do laboratoře k analytickému zpracování. Provede se extrakce sorbentu do vhodně zvoleného rozpouštědla a následně analýza obsahu konkrétních látek pomocí instrumentálně analytických metod nebo biotestů. [6] Obecně platí, že nasorbování analytu do pasivního vzorkovače ve vodním prostředí, je závislé na řadě faktorů, jako jsou fyzikálně-chemické vlastnosti membrány, sorbentu, sledované látky, biologické znečištění membrány, vodní turbulence a průtok, teplota vody, ph, salinita 2.2.2. Typy pasivních vzorkovačů Díky velkému rozvoji pasivního vzorkování bylo vyvinuto mnoho druhů vzorkovacích zařízení, která se využívají ke sledování nejrůznějších organických i anorganických látek ve všech složkách životního prostředí. Pasivní vzorkovače můžeme rozdělit na základě různých způsobů akumulace ve vzorkovači, konstrukce i typu vzorkovaných látek. Základní rozdělení je však dáno okamžikem, ve kterém je vzorkování ukončeno. Akumulace látek v pasivním vzorkovači jakéhokoli typu a konstrukce může být graficky znázorněna pomocí křivky na obr. č. 2. Různé typy vzorkovacích zařízení se od sebe liší pouze strmostí počáteční části křivky. Na základě toho potom dělíme pasivní vzorkovače na zařízení pracující v integrativním a rovnovážném režimu. 17
Obr. č. 2 Schéma vývoje koncentrace analytu v pasivním vzorkovači v závislosti na době expozice C S Rovnovážný režim může být charakterizován následující rovnicí [8]: k u = CW CW K SW, ke kde Cs je koncentrace analytu v daném čase t expozice ve vzorkovači, Cw je koncentrace analytu ve vodném prostředí, k u a k e jsou rychlostní konstanty, K SW je rozdělovací koeficient vzorkovač/voda charakteristický pro konkrétní analyt. Při rovnovážném vzorkování lze některé koncentrace odhadnout a v některých případech mohou být účinky environmentálních podmínek zanedbatelné. Tento přístup ale vyžaduje znalost rozdělovacího koeficientu pasivní vzorkovač/voda. Navíc, doba expozice musí být dostatečná pro dosažení rovnováhy mezi vzorkovačem a vodou a doba odezvy musí být kratší než jakékoliv změny v podmínkách kvality vody. Rychlost dosažení rovnováhy je závislá především na kapacitě vzorkovacího média a proto vzorkovače používané v rovnovážném režimu většinou obsahují minimální množství vzorkovacího média. To s sebou přináší určitou nevýhodu velmi limitované kapacity vzorkovače a tím pádem i nižší citlivosti 18
takovéto metody. Tento přístup je vhodný především ve stabilním prostředí jako jsou např. laboratorní experimenty. [8] Pro integrativní vzorkování může být předchozí matematický vztah redukován na : C S = C k t, jelikož k e je zanedbatelné [8]. W u Při využití tohoto přístupu dochází v průběhu expozice k lineárnímu nárůstu koncentrace látek ve vzorkovacím médiu. Rychlost akumulace je v optimálním případě nezávislá na koncentraci látek ve vzorkovaném médiu a množství naakumulované látky je pouze funkcí času, rychlosti difuze/proudění a teploty. Vzorkovače operující v tomto režimu obsahují obvykle větší množství sorbentu, tedy takové, aby doba lineárního příjmu analytů před dosažením rovnovážné fáze byla v řádu dní až týdnů. Tím pádem vzrůstá i kapacita a citlivost této metody a vzorkovač je schopen zakoncentrovávat i ultrastopová množství rozpuštěných látek na detekovatelnou úroveň. Studie Kociho a Grabice [6] uvádí, že pro dobrou interpretaci výsledků je nejlepší udržet vzorkovač v lineární oblasti vzorkování. Poté závislost přechází do nelineární (rovnovážné) oblasti a po ustálení koncentrace analytu ve vzorkovači již navzorkované množství neodráží celé časové období vzorkování. 19
2.2.2.1. Rovnovážné pasivní vzorkování Rovnovážné pasivní vzorkovače mají díky malému objemu nízkou kapacitu sorbentu (sběrného média) a tím velmi krátkou dobu expozice. Patří mezi rovnovážné vzorkovací techniky, u kterých dochází k rychlému dosažení rovnováhy mezi rovnovážnými koncentracemi kontaminantů ve vzorkovacím i sběrném médiu.[4] Rovnovážné vzorkování můžeme popsat pomocí rozdělovací konstanty, pro kterou platí následující rovnice : C S K SV =, CV kde K SV je rozdělovací konstanta mezi vzorkovanou a sběrnou fází, C S je koncentrace analytu v sorbentu, C V je koncentrace analytu ve vzorku. [5] Díky dosažení rovnováhy dojde i k vyrovnání rychlostí pohybu polutantů při příjmu do vzorkovacího zařízení a jejich zpětnému úniku do prostředí. Nejznámějšími metodami pro užití rovnovážných pasivních vzorkovačů jsou techniky pro odběr hydrofobních polutantů jako SPME (Solid Phase Microextraction) a SBSE (Solid Bar Sorptive Extraction). V porovnání těchto dvou metod v závislosti na log K OW analytů má SPME mnohem nižší výtěžnost než SBSE (viz obr. č.3). SBSE má 100 1000 krát nižší detekční limity (µg ng/l) než SPME. [9] 20
Obr. č.3 Výtěžnost HS-SPME a SBSE v závislosti na log K OW analytů [9] SPME Solid Phase Micro Extraction Mikroextrakce tuhou fází je jednoduchá sorpčně-desorpční metoda, která slouží k přípravě vzorku bez použití rozpouštědla a tím podstatně zkracuje dobu extrakce, jelikož umožňuje automatizaci postupu při přípravě vzorku. Používá se pro odběr a zkoncentrování analytů přímo z kapalných či plynných médií a nepřímo z tuhých vzorků. [10] Vzorky se za využití této metody dají připravovat dvěma způsoby. První je přímý odběr z matrice vzorku, při kterém se vlákno se ponoří až do matrice DI-SPME. Jeho výhodou je možnost extrakce netěkavých látek a také rychlejší ustanovení rovnováhy. Křehké vlákno však může být poškozeno mechanicky nebo látkami v roztoku. Druhou možností je odběr vzorku z prostoru nad matricí HS-SPME. Při tomto způsobu sice nehrozí poškození vlákna, nicméně jako jistou nevýhodu lze spatřovat delší ustanovení rovnováhy a také větší náročnost na standardizaci a stabilitu prostředí, především teploty. Metoda se dá použít ve spojení s plynovou (GC-SPME) i kapalinovou chromatografií (LC-SPME). Je vhodná pro získání výsledků v širokém koncentračním rozsahu a při vhodně zvoleném typu vlákna může dosahovat reprodukovatelných výsledků i pro nízké koncentrace analytů. [11] 21
Vzorkovač SPME se skládá z vlákna potaženého tenkou vrstvou stacionární fáze, které je vložené v obalu jehly (viz. obr. č.4). Díky těsnícímu septu, kterým jehla prochází, může být tento vzorkovač bezpečně přepravován do laboratoře. [12] Obrázek č. 4 Schéma pasivního vzorkovače SPME [12] Průběh SPME je ovlivněn řadou faktorů jako jsou: volba stacionární fáze (tloušťka a polarita), parametry sorpce (teplota, doba, míchání, poloha vlákna, úprava vzorku), druh sorbentu (homogenní čisté polymery-pdms nepolární, PA polární; porézní polymery) a parametry desorpce (teplota, délka, umístění vlákna, typ a objem rozpouštědla ) [11] Pro stanovení pesticidů v environmentálních vzorcích vyvinul v Kanadě Pawliszyn se svými spolupracovníky metodu SPME, která se stala komerčně přijatelnou metodou. Beltran et al. ve svém článku [13] uvádějí SPME postup pro stanovení 12 organofosfátových pesticidů ve vzorcích vody při nízkých koncentracích (ng/ml). Při stanovení byly použity dva typy vláken: 100 µm polydimethylsiloxanu a 85 µm polyakrylátu. Získané limity detekce se pohybovaly mezi 0,01 a 0,2 ng/ml s relativní standardní odchylkou nižší než 15% na 1 ng/ml..metoda tedy ukázala dobrou linearitu mezi 0,1 a 10 ng/ml s regresními koeficienty v rozmezí mezi 0,97 a 0,999. Stanovení organofosforových pesticidů ve vzorcích vody v koncentraci nižší než 0,1 ng/ml lze tedy snadno provést touto rychlou a bezrozpouštědel ekonomicky výhodnou metodou. 22
SBSE Stir Bar Sorptive Extraction SBSE je metoda založená na stejných principech jako metoda extrakce na pevné fázi (SPE), kde pevnou fází je v tomto případě magnetické míchadélko (viz.obr. č.5). Slouží pro extrakci a obohacení organických sloučenin ve vodných matricích a umožňuje dosáhnout velmi nízkých detekčních limitů. [14] SBSE se skládá z magnetického míchadélka se skleněným povrchem potaženým velmi tenkou (0,3 1mm), ale přesto pevnou vrstvou PDMS (polydimethylsiloxanu), na kterém dojde k zachycení vzorkovaných analytů. Odběr vzorků se provádí přímo zavedením SBSE zařízení do vodného roztoku. Po určité době míchání se míchací tyčinka (1 4 cm) odstraní z vodného roztoku a analyty jsou tepelně desorbovány on-line přímo v plynovém chromatografu. Vzhledem k mnohem většímu objemu PDMS vrstvy je účinnost extrakce mnohem lepší než SPMD. [15], [16] Obr. č. 5 Schéma pasivního vzorkovače SBSE [15] Tyto vzorkovače jsou díky inertnosti PDMS vhodné pro labilní, ve vodě málo nebo středně rozpustné a reaktivní sloučeniny bez katalytického rozkladu. Na druhou stranu má ale tento vzorkovač nízkou kapacitu [14]. 23
2.2.2.2. Integrativní pasivní vzorkovací zařízení Integrativní pasivní vzorkovače působící v integrační (lineární) oblasti zobrazují závislost množství zachycených analytů na době expozice. V době odběru nedojde k vytvoření rovnováhy, analyty se absorbují až do doby, kdy se ustálí tok a celková vzorkovací koncentrace dosáhne poloviny hodnoty rovnovážné konstanty Ksw. Proto se předpokládá, že vzorkovací rychlost nebo míra přenosu analytu je po celou tuto dobu konstantní. Díky vysoké kapacitě sběrné fáze vzorkovače je vytvořen delší lineární příjem a můžeme tak vyjádřit průměrnou koncentraci analytů a konstantní vzorkovací rychlost Rs po celoudobu vzorkovací periody. [17] Sledovaný analyt difunduje na základě gradientu koncentrace k povrchu sorbujícího materiálu, kde je zachycen na základě fyzikální adsorpce nebo chemické reakce. Následně se látka desorbuje a stanoví vhodnou citlivou analytickou metodou. Pro stanovení se používá hmotnostní spektroskopie, spektorfotometrie, plynová, kapalinová nebo tenkovrstevná chromatografie. [18] Jako membrána se používá polopropustná membrána nebo jiné difúzní zařízení, které oddělí sběrné médium od vzorkovacího. Tato bariéra ovlivňuje výsledek při kvantitativním vyhodnocení, protože je rozhodující pro rychlost příjmu molekul analytů ve vzorkovači. [17],[19] Tyto pasivní vzorkovače oproti rovnovážným umožňují stanovení časově váženého průměru (TWA) průměrné koncentrace znečišťujícíh látek (ultra-stopových přesto toxikologicky významných) za průměrnou dobu expozice.[2],[20] Využívají pouze síly molekulární difuze a díky tomu mají řadu výhod: nepotřebují zdroj energie, jejich konstrukce je jednoduchá, jsou malé, lehké a levné. Jsou ale velmi citlivé na vlivy vnějšího prostředí jako teplota, vlhkost [18] Integrativní pasivní vzorkovače rozdělujeme [18]: - podle přenosu hmoty : a) difuzní vzorkovače plněné sorbetem (POCIS) b) permeační vzorkovače plněné rozpouštědlem (MESCO), vzorkovače se semipermeabilní membránou (SPMD) 24
- podle způsobu záchytu : a) reakční b) sorpční založeny na reverzibilní sorpci Jak uvádí Alverez et al. ve svém článku [21] jsou tyto vzorkovače nejvíce rozvinuty a používány. SPMD je po celém světě přijata jako nástroj pro monitoring lipofilních organických nečistot ve vodě (Booij et al, 2003; Petty et al, 2004; Huckins et al, 2006). POCIS byl vyvinut pro poskytnutí údajů pro široké spectrum vodních biologicky dostupných polárních organických kontaminantů (Alvarez et al, 2004, 2005, 2007; Jones-Lepp et al, 2004; Petty et al, 2004). Difuzní integrativní pasivní vzorkovače - pohyb analytu u těchto zařízení je řízen jednosměrnou difúzí. Její rovnováha je dána 1. Fickovým zákonem : d d x J = D12, kde J je difúzní tok látky [mol.cm 2.s -1 ], D je difúzní koeficient, x je z koncentrace polutantu a z je délka ve směru difúze. [18] - vliv teploty se zvyšující se teplotou se zvyšuje i vzorkovací rychlost - časová odezva - udává rychlost transportu analytů přes difuzní bariéru: 2 L t r =, kde t r udává dobu setrvání molekul analytu v difúzní zóně, L je délka difúzní 2D dráhy a D je difúzní koeficient. [22] 25
Permeační integrativní pasivní vzorkovače - analyty se pohybují přes propustnou membránu difuzí popsanou 1. Fickovým zákonem: ( P P ) 2 1 F = D A, kde F je permeační tok složky membránou [µg.s -1 ], D je S difuzní koeficient složky při dané teplotě, A je plocha membrány, P1 a P2 jsou parciální tlaky složky na dvou stranách membrán a S je tloušťka membrány. [18] - časová odezva udává rychlost transportu analytů přes permeační bariéru: t r 2 LM =. Tyto hodnoty jsou oproti difuzním koeficientům mnohem nižší (pouze 6D p v řádu několika sekund). [22] MESCO Membrane Enclosed Sorptive Coating Tento integrativní pasivní vzorkovač vznikl úpravou techniky SBSE jako kombinace pasivního vzorkování se zkoncentrováním bez použití rozpouštědla. Byl vytvořen pro pasivní vzorkování perzistentních, hydrofobních organických polutantů ve vodném prostředí a v praxi byl použit pro pesticidy, polychlorované bifenyly a polycyklické aromatické uhlovodíky. [23] Vzorkovač se skládá z míchadélka Twister potaženého PDMS (polydimethylsiloxan, komerčně dostupné zařízení pro SBSE), které se volně pohybuje v prostoru vyplněném destilovanou vodou a ohraničeném membránou z regenerované celulózy, která funguje jako polopropustná membrána (viz.obr. č.6). [24] Dalším vývojem vznikl nový MESCO vzorkovač - membrane-enclosed silicone collector. Místo PDMS obsahuje stabilnější membrány, např z polyethylenu (LDPE). Tyto membrány jsou hydrofobní, odolné vůči rozpouštědlům a biologickému rozkladu. Míchadélko Twister je nahrazeno levnější variantou ze silikonové hmoty. [25] 26
svorky membrána fluidum míchadélko Obr. č. 6 Schéma pasivního vzorkovače MESCO [3] Při vzorkování dojde k zakoncentrování rozpuštěných organických sloučenin z vodné fáze do vrstvy PDMS na povrchu míchadélka a nakonec k desorpci zachycených analytů on-line přímo ve spojení s kapilárním GC/MS systémem. Rychlost příjmu vzorkovaných chemických látek je závislá na jejich rozdělovacím koeficientu mezi vodou a PDMS a teplotou vody.[26] SPMD (Semi-Permebale Membrane Device) Ocelka et al. ve své studii [27] uvádějí, že SPMD neboli pasivní vzorkovač s polopropustnou membránou je používán již od roku 1990. Nejprve byl použit pro odběr vzorků vody, následně i pro monitoring ovzduší a sedimentů. V České republice dnes slouží pro vyhodnocování environmentálního monitoringu hlavních povrchových toků. Huckins et al. [28] představil jednu z prvních studií o pasivním vzorkování organických polutantů ve vodách pomocí polopropustné membrány v SPMD. A dodnes se neustále většina výzkumů organických látek ve vodě pasivními vzorkovači zaměřuje na SPMD. Tento pasivní vzorkovač je navržen pro vzorkování v tucích nerozpustných (nepolárních nebo hydrofobních) semivolatilních organických chemických látek. [29] Skládá se z tenké polopropustné polyethylenové membrány (tloušťky 75-95 µm), obsahující malé množství nepolární látky - trioleinu (syntetického rybího tuku vysoké čistoty 97%). Tyto membrány se předčistí dialýzou v hexanu, poté se napnou na vzorkovací držák, který se umístí do ochranné ocelové klece a umístí do vzorkovaného prostředí (viz.obr.č. 7). Lipofilní organické kontaminanty pronikají 27
membránou a poté se zkoncentrují do náplně vzorkovače. Doba expozice bývá několik dní až měsíců (pro PAH, PCB, PCDD/F 28-30 dnů). [30] Obr. č. 7 Schéma SPMD [31] c w Matematický model pro vzorkování pomocí SPMD popsal Huckins,J.N. [30]: cspmd =, kde c w je koncentrace analytu ve vodě daná vztahem koncentrace analytu R t S v SPMD (c SPMD ), efektivní rychlostí vzorkování (R S ) a času vzorkování (t). Množství analytu zachyceného v SPMD závisí na následujících parametrech [7]: - koncentrace látek ve vodě a ve vzduchu během intervalu expozice - teplota vzorovaného média vyšší teploty obecně poskytují vyšší Rs v SPMD - délka expozice - další faktory: plocha povrchu, molekulární průřez průměru, rozdělovací koeficient oktanol/voda K OW 28
POCIS Polar Organic Chemical Integrative Sampler Pasivní vzorkovač POCIS je jeden z prvních a nejpoužívanějších pasivních vzorkovacích zařízeních pro monitoring polárních organických polutantů a i částečně hydrofobních organických sloučenin (s hodnotou Kow 3-4) a stanovení jejich průměrné koncentrace v delším časovém období (TWA). Mezi tyto znečišťující látky patří léky, antibiotika, steroidní hormony, látky osobní potřeby, pesticidy a jiné. Skládá se ze dvou mikroporézních hydrofilních membrán většinou polyethersulfonových, mezi které je vložena vrstva sorbentu a uzavřena. [32] Obr. č. 8 Pasivní vzorkovač POCIS originál (vlevo) [33], schéma uvnitř (vpravo) POCIS obvykle využívá dvě konfigurace. Jednou z nich je obecná metodika, která je vhodná pro zkoumání hydrofilních organických nečistot. Tento systém obsahuje tzv. třífázový sorbent (směs tří sorbentů: Isolute ENV, polystyren divinylbenzen a Ambersorb 1500), který velmi dobře zachycuje hlavně pesticidy, přírodní a syntetické hormony a další kontaminanty spojené s odpadní vodou. Jeho velkou výhodou je vysoká kapacita, nevýhodou však příliš vysoká cena. Druhá konfigurace slouží pro farmaceutické odběry vzorků. Byla vytvořena především pro záchyt léčiv s více funkčními skupinami, které mají tendenci se vázat na uhlíkaté části sorbentu. V tomto případě se využívá sorbent Oasis HLB (kopolymerní styrendivinyl benzenová pryskyřice) a polyethersulfonová membrána, která se snadno používá a má i dobrou chemickou a mechanickou odolnost. [2],[23] 29
Alvarez ve své studii [21] uvádí obecný postup zpracování vzorku, který je podobný ostatním publikovaným postupům. (viz. obr. č. 9). POCISy jsou velmi jemně čištěny za účelem odstranění případných interferencí. Sorbent každého z nich je převeden do skleněné chromatografické kolonky na extrakci. Analyty jsou poté extrahovány pomocí 50ml extrakčního rozpouštědla (methanol:toluen:dichlormathan v poměru 1:1:8) a následně 20ml ethylacetátu. Objem extrátu se sníží odpařováním na vakuové odparce nebo pod mírným proudem dusíku. Následně se zfiltruje a zakoncentruje jako ekvivalentní vzorek, připravený pro vyhodnocení. Obr. č. 9 Schéma zpracování vzorku POCIS [21] Vzorkovací rychlost těchto vzorkovačů se vypočítá na základě měření poklesu koncentrace vody c w v čase, podle rovnice: c ( t) = c ( 0 ) exp[ ( k + k ) t] = c ( 0) exp[ kt] která se upraví na: c Ln c w w ( t) ( 0) = kt, kde ku a kd jsou rychlostní konstanty absorpce a rozptylu, CW (0) a CW (t) jsou koncentrace vody na zahájení experimentu a v čase t. w w U D w Vzorkovací rychlost R S lze tedy vypočítat na základě následujícího vztahu: R = k S U V T kde V T, kde je počáteční objem vody. Hodnota k je odhadována z poklesu koncentrace analytu ve vodě (Ln [CW (t) / CW (0)]) v průběhu expozice. [34] 30
Vzorkovače jsou nejčastěji přichyceny pomocí šroubů na nosič, který je vsazen do vzorkovacího koše (viz obr.č. 10) a ten je umístěn na vzorkovací místo, v případě potřeby upevněn pomocí ocelových lanek. Obr. č. 10 Vzorkovací koš s POCIS disky [41] Vzorkovače se umísťují do terénu na dobu několika týdnů až měsíců. Proto je potřeba pečlivě vybrat vzorkovací místo, které bude splňovat řadu požadavků, důležitých pro správné vzorkování [35]: - vzorkovače by během expozice měly zůstat ponořené ve vodě a neklesnout do usazenin - neměly by se vkládat do silných průtoků, aby nedošlo k poškození - vybírat oblasti co nejméně navštěvované lidmi, aby se zabránilo vandalismu Tyto vzorkovače již byly použity na řadě míst ve světě, nejvíce testů však proběhlo ve Spojených státech amerických. Zde byl POCIS použit federálními agenturami pro monitorování ve vodě rozpustných organických kontaminantů. Byly vzorkované jak stojaté vody a hlavní říční systémy, tak i odpadní vody. [35] 31
Jeden z konkrétních testů je uveden ve studii [36], kde pro detekci vybrali jedny z nejvíce předepisovaných léků v USA: omeprazol, fluoxetin, azithromycin a levothyroxin a dvě nelegální drogy: MDMA (extáze) a metamfetamin. Tyto látky měly velmi vhodné polární vlastnosti. Tato studie měla sociálně-ekonomický význam, jelikož poskytla účinný a spolehlivý přístup pro monitorování užívání léčiv i nelegálních látek. Douhton (2001) navrhl používání tohoto monitoringu pro neustálé získávání dat a reálný pohled na celkový rozsah nedovoleného užívání návykových látek [36]. V našem centru pro výzkum toxických látek RECETOX byla v roce 2007 vytvořena studie pro vývoj a zhodnocení pasivního vzorkovače pro microcystiny, kterou uvádí J. Kohoutek ve svém článku. Bylo zjištěno, že nejlepších výsledků dosahoval tento vzorkovač s polykarbonátovou membránou a serbentem Oasis HLB (2,75 mg sorbentu/cm 2 ), který byl schopen akumulovat zhruba 40% microcystinů ve vodě během 14ti denního odběru vzorků [37]. 2.3. HPLC/MS Pro instrumentální analýzu odebraných vzorků po extrakci slouží řada separačních a detekčních metod, často užívané jsou termální desorpční GC, GC/ECD, GC/MS, HPLC, HPLC/MS. Vysoce účinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií je velmi univerzální instrumentální technikou, jejíž základy se vztahují na tradiční kapalinovou chromatografii a přístrojové vybavení, které byly původně vyvinuty pro GC. Základní výhodou metody HPLC/MS oproti GC/MS je schopnost analyzovat mnohem širší spektrum látek díky tomu, že vzorky nemusí být těkavé jako u GC. Mohou to být sloučeniny tepelně nestabilní, vykazující vysokou polaritu nebo vysokou molekulovou hmotnost, ale analyzovat se dají také i bílkoviny a řada dalších látek. [38] První část HPLC kapalinový chromatograf se skládá z pumpy, dávkovače, kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Druhá část hmotnostní spektrometr je složen z iontového zdroje, analyzátoru a detektoru. Celé tyto systémy jsou vzájemně propojeny (viz.obr. č.11). [39] 32
Vzorky určené k analýze jsou injekčně přiváděny do kolony HPLC, která je tvořena úzkou nerezovou ocelovou trubičkou (obvykle 150 mm dlouhá o vnitřním průměru 2mm, nebo menší) plněnou stacionární fází (jemnými, chemicky modifikovanými křemičitými částicemi). Protékající mobilní fází je vzorek unášen do kolony. Analyty jsou od sebe odděleny na základě jejich relativní interakce se stacionární fází a mobilní fází (rozpouštědlem). Látky uvolňující se z chromatografické kolony jdou přes specializované rozhranní (nejčastěji ionizace elektosprejem ESI nebo za atmosférického tlaku API) do hmotnostního spektrometru, kde jsou analyzovány. [38] Dnešní moderní chromatografy jsou řízeny počítačem, který umožňuje přesné nastavení dávkování vzorku, složení mobilní fáze, řízení průtokové rychlosti, řízení průtokové rychlosti i celkové vyhodnocení chromatogramu. [40] Obr. č. 11 Schéma hmotnostního spektrometru s ionizací za atmosférického tlaku a analyzátorem typu iontové pasti [42] 33
2.4. Pesticidy Antropogenní kontaminanty jsou přítomny ve vodních systémech po celém světě jako složité směsi. Zahrnují znečišťující látky od chlorovaných pesticidů (OCs), polychlorovaných bifenylů (PCB), polychlorovaných dioxinů a furanů (PCDD, PCDF) a polycyklických aromatických uhlovodíků (PAU), až po pesticidy, léčiva a výrobky osobní hygieny. [43] Pro ochranu lidského zdraví se omezují koncentrace mnoha pesticidů a průmyslových chemikálií, taková omezení ale neplatí pro běžně používané domácí chemikáli, léky a látky osobní hygieny. Alvarez ve svém článku [44] předkládá, že podle výzkumu se velké množství polárních organických chemikálií vstupujících do vodních systémů dostává až na globální měřítko a mohou být zodpovědné nejen za akutní toxické účinky, ale i za chronické abnormality vodních organismů. Pesticid je látka nebo jakákoliv směs látek určených k hubení, předcházení, odpuzování nebo zmírnění působení nežádoucích škůdců (rostlin nebo živočichů). V dnešní době jsou populárnější biologicky založené pesticidy, jako jsou feromony a mikrobiální pesticidy, které představují menší nebezpečí než chemické pesticidy.[45] Pesticidy se skládají z aktivní látky a dalších složek, které pomáhají při aplikaci ke správné administraci účinné látky. Aktivní (účinné) složky jsou chemické látky, které zabíjejí, kontrolují nebo odpuzují škůdce. Často se stává, že tvoří malou část celého výrobku. Hotové produkty musí obsahovat štítek, na kterém je uveden název každé účinné látky a jeho koncentrace v produktu. Ostatní/inertní složky mají různé funkce, jako přitahování škůdce,zvyšování trvanlivosti. U těchto látek jsou minimální limity reziduí (tolerance), které mohou být užity jídlem. [46] Existuje mnoho druhů pesticidů, podle toho jakou cílovou skupina je potřeba zneškodnit se dělí na [46]: - algicidy ke zpomalení růstu řas - akaricidy k hubení roztočů, kteří napadají rostliny a zvířata 34
- fungicidy k hubení plísní - herbicidy k hubené nežádoucích rostlin a plevelů - insekticidy k hubení hmyzu - ovicidy k hubení vajíček hmyzu a roztočů - moluskocidy k hubení měkkýšů - rodenticidy k hubení hlodavců - a další: feromony, repetenty, látky na impregnaci dřeva, dezinfekční prostředky, nelegální a padělané pesticidy Největší snaha zregulovat negativní následky těchto látek je v oblasti zemědělství. Přesto se i nadále používají různé jejich modifikace za účelem jednoduššího hospodaření a zvýšení výnosů. Výzkumy mezi jednotlivými farmáři prokázaly značné následky na jejich zdraví při používání pesticidů. Světová zdravotnická organizace WHO uvádí, že každý rok zasáhne účinek pesticidů asi 3 miliony zemědělců, přičemž 18 000 z nich následkům podlehne. Z tohoto důvodu byly před několika lety zavedeny speciální normy na ochranu spotřebitelů, které udávají jaké procento pesticidů může být v potravinách. V evropské unii se touto kontrolou zabývá zvláštní komise DG-SANCO (Generální ředitelství pro zdraví a ochranu spotřebitele).[47] Národní institut právní medicíny (NILM) v Portugalsku zjistil při zkoumání intoxikace pesticidů, že pesticidy jsou stále velkým faktorem příčiny smrti. Z prováděných výzkumů jsou zajímavé výsledky pro porovnání pohlaví a věku u lidí zasažených pesticidy (viz. obr. č.12 ). Zasažení podle věkového rozložení bylo u mužů a žen podobné, s výjimkou věkové skupiny 41-50 let, která měla největší počet otrav pesticidy. Je také zajímavá vyšší hodnota ve věkové skupině 61-70 let a po 71 letech. [48] 35
Graf č.1 Relativní zasažení populace pesticidními látkami v závislosti na věku a pohlaví (studie provedena v období mezi lednem 2000 a prosincem 2002) [48] V posledních letech se rozvíjí stanovení pesticidů pasivním vzorkováním, převážně metodou POCIS. Tuto metodu uvádí ve své studii Thomatou et al. [49], ve které se zaměřuje na pasivní vzorkování vybraných 13ti pesticidů v povrchových vodách (atrazin, atrazinedeethyl, simazin, prometryne, alachlor, s-metolachlor, chlorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, diazinon, malathion, benalaxylu, pyrimethanil, triadimenol). Délku expozice stanovili pro vzorkovač POCIS na 28 dní. Na základě laboratorních experimentů byla provedena kalibrace a ze získaných hodnot stanoveny vzorkovací rychlosti. Analytické postupy byly založeny na dvou typech stanovení. Prvním byl bodový odběr s následnou extrakcí vody pomocí SPE (extrakce pevnou fází, sorbent Oasis HLB) a druhým pasivní vzorkování se vzorkovačem typu POCIS. Výtěžky nasorbovaných pesticidů ze vzorkovače POCIS byly pro všechny látky větší než 79% s relativní směrodatnou odchylkou (RSD) <16%. Vypočtené vzorkovací rychlosti se pohybovaly v rozmezí od 0.025 do 0.388 L/den s RSD <29%. Na základě těchto výsledků byla provedena krátká studie na jezeru Amvrakia v západním Řecku. Korelační koeficienty z lineární regrese se pohybovaly mezi 0.9214 a 0.9807 s relativní směrodatnou odchylkou mezi 3 a 26%. Analýza rozptylu příjmu v POCIS a Oasis HLB neprokázala žádné významné rozdíly mezi těmito dvěma modely (p <0,001). Vzorkovače POCIS tedy ukázaly vhodné výsledky pro monitorování širokého spektra pesticidů. 36
2.4.1. Osud pesticidů ve vodním prostředí Pesticidy patří mezi organické polutanty, které jsou značně variabilní co se týče jejich stability ve všech složkách prostředí. Ve vodě jsou tyto látky poměrně velmi dobře rozpustné. Některé však mají tendenci spíše se zachytávat na tuhých částicích (prach, sedimenty, popílek ). Významným zdrojem těchto látek v rámci vodního prostředí mohou být i plachy z polí, vozovek, průmyslové odpadní vody, depozice z atmosféry jsou ukládány na dně vodních ekosystémů v sedimentech a odtud mohou být po určité době uvolněny a dostávat se zpět do vodné fáze. [50] Používání pesticidů v zemědělské praxi probíhá podle schválených podmínek v souladu s principy správné zemědělské praxe GAP (Good Agriculture Practices) a WHO (World Health Organization). Hlavním účelem těchto nařízení je zamezení nálezů nepřijatelných reziduí pesticidů v potravinách a ochranna lidského zdraví.[51] Procesy ovlivňující osud pesticidů v prostředí (viz obr. č. 13): - Degradace je proces odbourání pesticidu, který může být ovliněn řadou biotických a biotických faktorů. Tento proces může probíhat chemicky (pomocí chemických reakcí), mikrobiálně (odbourání mikroorganizmy) nebo fotodegradací (odbourání slunečním světlem). Díky těmto procesům se pesticidy transformují do polárnějších sloučenin a jejich měnící se vlastnosti tak mohou zvyšovat riziko vyluhování z půdy do podzemních vod. [52] - Těkání je proces přenosu látky z kapalné fáze do plynné, tímto způsobem mohou látky unikat z cílového místa aplikace pesticidu. - Adsorpce adsorpci pesticidů charakterizuje především rozdělovací koeficient K OC v půdě, který zobrazuje schopnost pesticidu vázat se na půdní částice. Pesticidy s vysokými hodnotami se na částice vážou dobře, s nižšími hodnotami K OC méně dobře, což způsobuje riziko kontaminace vod. [53] 37
- Vymývání při nadměrném množství srážek nebo zavlažování dochází k vymývání pesticidů z půdního prostředí do podzemních vod, kde dojde k interakci pesticidu s vodou. [54] - Perzistence je schopnost pesticidů nebo jejich zbytků po degradaci setrvávat. Pro vyjádření času degradace se používá tzv. poločas rozpadu. Je to čas, který pesticid potřebuje, aby dosáhl poloviční úrovně aktivity, kterou měl v době aplikace. Na tuto hodnotu má vliv: aerobní a anaerobní podmínky, dostupnost, teplota, vlhkost, hloubka a ph půdy. [55] - Splach probíhá pohybem pesticidů ve vodě z vyššího místa do nižšího. Podle vlastností jsou pesticidy buď to ve vodě rozpuštěny, nebo navázány na jiné částice. Obr. č. 12 Schéma osudu pesticidů v půdě a ve vodě [56] 38
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Materiál a metody Použité chemikálie, roztoky a rozpouštědla: - methanol, acetonitril (LC-MS Grade, Biosolve, Nizozemí) - octan amonný, kyselina trifluoroctová (p.a., Sigma-Aldrich, Česká republika) - pesticidy (viz. Tab.č.1) Tabulka č. 1 Přehled použitých standardů pesticidů Pesticidy Výrobce Čistota [%] Koncentrace [µg/ml] Atrazine AccuStandard 99,5 1000 Azinphos metyl AccuStandard 99,5 1000 Carbendazim AccuStandard 99,5 100 Chlorsulfuron AccuStandard 99,5 100 Diazinon AccuStandard 99,5 1000 Dimethoate AccuStandard 99,5 1000 Disulfoton AccuStandard 99,5 1000 Fenitrothion AccuStandard 99,5 1000 Fenoxaprop AccuStandard 99,5 1000 Fenpropimorph AccuStandard 99,5 100 Fonofos AccuStandard 99,5 1000 Metamitron AccuStandard 99,5 100 Metribuzin AccuStandard 99,5 1000 Phosmet AccuStandard 99,5 1000 Simazine AccuStandard 99,5 100 Temephos AccuStandard 99,5 100 Terbufos AccuStandard 99,5 1000 Dimethachlor AccuStandard 99,5 1000 Metolachlor AccuStandard 99,5 1000 Prochloraz AccuStandard 99,5 1000 Propiconazole AccuStandard 99,5 1000 39
Tebuconazole AccuStandard 99,5 100 Acetochlor AccuStandard 99,5 100 Isoproturon AccuStandard 99,5 100 Metazachlor AccuStandard 99,5 1000 Alachlor AccuStandard 99,5 1000 Chlorpyrifos AccuStandard 99,5 1000 Terbuthylazin AccuStandard 99,5 100 Chlortoluron AccuStandard 99,5 1000 Materiál pro konstrukci vzorkovače: - plastové lahve a víčka - mikroporézní membrány (průměr 90mm, porozita 0,4µm, Sterlitech, CA, U.S.A): polyethersulfonát, polykarbonát, polyester, nylon - SPE sorbety (Waters, Milford, MA, U.S.A): Oasis HLB - Hydrophilic-lipophilic-balanced reversed-phase Oasis MAX - Mixed-mode anion exchange (pro kyselé látky) Oasis MCX - Mixed-mode cation exchange (pro zásadité látky) Obr. č. 13. Charakteristika použitých sorbentů Oasis HLB,MAX,MCX [57] 40
3.2. Použité nástroje a vybavení - Laboratorní váhy (OHAUS Voyager PRO VP214CM) - Automatický extraktor B-811 (Büchi, Švýcarsko) - Vortex mixer (Stuart) - Ultrazvuková lázeň (Sonorex, Bandelin electronic, Německo) - automatické pipety (Nichiryo Nechipet EX, Japonsko) - vakuová odparka Laborota 4000 (Heidolph, Německo) - magnetická míchačka (Lavat) - SPE manifold Baker 12G (J.T. Baker, USA) - HPLC/MS: chromatograf Agilent 1100 series (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) s hmotnostním spektrometrem AB Sciex Qtrap 5500 (AB Sciex, Toronto, Kanada) - HPLC kolona: Synergi Fusion C-18, 4µm, 100x2mm (Phenomenex, Torrance, CA, U.S.A) 41
3.3. Konstrukce vzorkovače Pro pasivní vzorkování jsem se snažila vyvinout pasivní vzorkovač a optimalizovat jeho konfiguraci tak, aby poskytovala co nejlepší výsledky při vzorkování polárních pesticidů. Na konstrukci vzorkovače byly použity plastové láhve s širokým hrdlem s odpovídajícími víčky. Láhve byly za pomoci pilky pod hrdlem uřezány a ve víčkách vyřezány kulaté otvory. K lahvím bylo vybráno odpovídající víčko (viz. obr. č.14). Obr. č. 14 Plastová víčka a hrdla připravená ke kompletaci a výrobě pasivních vzorkovačů Do vzorkovačů byly vkládány různé typy mikroporézních membrán: polyethersulfonát, polykarbonát, polyester a nylon. Jednotlivé membrány byly naplněny SPE sorbetem o naváženém množství 40mg. Jako SPE sorbent byl použit Oasis HLB, MAX a MCX buď samostatně, nebo namíchané v různých poměrech. Membrána se sorbetem byla přehnuta napůl, opatrně vložena na uřezané hrdlo plastové lahve, tak aby obsah SPE sorbentu uvnitř membrány byl uprostřed otvoru hrdla a opatrně se na ni zašroubovalo víčko tak, aby membrána pevně držela v hrdle a přitom se neroztrhla nebo jinak nepoškodila. Vzorkovače byly tímto připraveny na použití. Pro kalibraci vzorkovače a zjištění rychlosti sorpce pesticidů na jednotlivé SPE sorbety byl použit roztok pesticidů o koncentraci 5µg/mL. Tento roztok byl vytvořen smícháním jednotlivých standardů pesticidů v koncentracích 100 µg/ml nebo 1000 µg/ml a methanolu.. 42
3.4. Expozice, extrakce a instrumentální analýza Expozice vzorkovačů byla provedena v kádinkách o objemu 1L, do kterých byla přidána destilovaná voda (1L) a následně bylo pomocí mikropipety přidáno 20µL směsi pesticidů. Výsledný roztok byl promíchán a vzorkovače připevněné na drátěné mřížce byly umístěny do roztoku (viz. obr. č.15). Takto neexponované vzorkovače byly ponechány po dobu expozice jednoho týdne a během této doby byl pravidelně vyměňován roztok vody s pesticidy tak aby koncentrace analytů ve vzorkovacím médiu byla po celou dobu expozice stejná. Obr. č. 15 Pasivní vzorkovače exponované v médiu Exponované vzorkovače byly rozmontovány a membrána obsahující sorbent byla přenesena do 15mL plastové centrifugační zkumavky do které bylo přidáno 5ml extrakčního rozpouštědla (90% roztok methanolu ve vodě). V případě, že nebylo možné provést extrakci okamžitě, byly centrifugační zkumavky s naexponovanými vzorkovači uchovány v mrazícím boxu. Analyty byly extrahovány působením ultrazvuku (15 minut). Po uplynutí této doby byla zkumavka přendána na centrifugu, aby se membrána se sorbentem usadili. Za pomoci injekční stříkačky byla odebrána oddělená kapalina a vložena do odparné baňky kryté alobalem, aby nedošlo k odpaření rozpouštědla. 43