Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Vysokoúčinná kapalinová chromatografie"

Alžběta Štěpánková
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací kapalinová chromatografie UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Extrémně účinná kapalinová chromatografie UHPLC Ultra High Pressure Liquid Chromatography Extrémně vysokotlaká kapalinová chromatografie Jan Poustka - ISM 2007 VŠCHT PRAHA

kapalinová chromatografie UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Extrémně účinná kapalinová

a eluent (mobilní fáze) Členění metod: - uspořádání: kolonová, na tenké vrstvě.

2 Princip: Princip kapalinové chromatografie dělení (separace, rozlišování) sloučenin na základě různé zádrže (retence) v chromatografickém systému: sorbent (stacionární fáze) a eluent (mobilní fáze) Členění metod: - uspořádání: kolonová, na tenké vrstvě... - separační parametry: účinnost, rychlost... - stacionární fáze: eluční, ionexová, chirální...

Separační parametry Rozlišení: 1 1 4 ' 2 ' 2 k k N R 0 0 ' t t t V V K n n k R m s D m s k kapacitní (retenční) faktor:

3 Separační parametry Rozlišení: ' 2 ' 2 k k N R 0 0 ' t t t V V K n n k R m s D m s k kapacitní (retenční) faktor: separační faktor: k 2 /k 1 N počet teoretických pater účinnost (efficiency výkonnost) w w t t R R R nebo ,55 w t N R

separační faktor: k 2 /k 1 N počet teoretických pater účinnost

4 R = 1,5 baseline separace

5 HETP = L/N - výškový ekvivalent teoretického patra Y - HETP X - Průměrná lineární rychlost

6 Interpretace separačních parametrů k ~ složení stacionární a mobilní fáze, teplota, průtok, délka kolony - charakterizuje retenci za daných podmínek - faktor retence (doby analýzy) ~ složení stacionární a mobilní fáze, teplota, průtok - charakterizuje separaci složek (porovnáváme k ) - faktor selektivity separace (rozdělení analytů) N ~ kvalita stacionární fáze - zrnění a třídění, složení mobilní fáze, průtok, délka kolony, teplota - charakterizuje kvalitu eluční zóny - šířka, symetrie... - faktor kvality eluční zóny (tvaru píku) R ~ sjednocující veličina - kombinuje všechny parametry separace

selektivity separace (rozdělení analytů) N ~ kvalita stacionární fáze - zrnění a třídění, složení mobilní fáze, průtok, délka kolony, teplota -

7 Stacionární fáze - volba typu (separační selektivity) a provedení chromatografie Rozdělovací: - normální fáze (klasická x HILIC) - reverzní fáze (klasická x semipolární) - iontově párová (na reverzní fázi) Iontově výměnná (IE) - katex, anex Chirální - cyklodextrinové fáze Afinitní HPLC: 3-10 µm - různé - p do 400 bar RRLC: 1,8 µm - porézní směsné - p do 600 bar UPLC: 1,7 µm - porézní unif. - p do 1000 bar UHPLC: 1,0 µm - neporézní - p do 5000 bar

(IE) - katex, anex Chirální - cyklodextrinové fáze Afinitní HPLC: 3-10 µm - různé - p do 400 bar RRLC: 1,8 µm -

8 Hlavní typy interakcí při separaci * van der Waalsovy síly disperzní London indukovaný dipól - indukovaný dipól * van der Waalsovy síly orientační Keesom dipól - dipól * van der Waalsovy síly indukční Debye dipól indukovaný dipól ** elektrostatické síly Coulomb *** vodíková vazba H O O H H N H O H O S O H C N O H C N C H H **** π - π interakce

der Waalsovy síly indukční Debye dipól indukovaný dipól ** elektrostatické síly

9 Chromatografie na normální fázi: Stacionární fáze - polární: silikagel, modifikovaný silikagel Mobilní fáze - nepolární (retence podle složení m.f.) HILIC Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography

Mobilní fáze - nepolární (retence podle složení m.

10 Chromatografie na reverzní fázi: Stacionární fáze - nepolární: modifikovaný silikagel (C18) Mobilní fáze - polární (retence podle složení m.f.) ODS - oktadecylovaný silikagel (C18) C4,C8,C30 Endcapping (Embedding): Klasický - 100% nepolární Polární - část polární skupiny Porézní x neporézní Monomerní x polymerní (zesítěný)

11 Porovnání HILIC, NP a RP chromatografie

12 Chirální chromatografie: Stereoisomery (enantiomery, diastereoisomery... ) - jsou separovány interakcí s chirální fází

13 Iontově párová chromatografie: Polární analyt + polární činidlo (iontově párové činidlo) nepolární komplex s retencí na nepolární s.f. - realizace na reverzní fázi

14 Iontově výměnná chromatografie: Stacionární fáze - zakotveny nebo ; opačné ionty jsou mobilní (retence podle složení m.f.)

15 Afinitní chromatografie: Stacionární fáze - imobilizace ligandu (biologicky aktivní sloučeniny) ; vzorek se váže do komplexu, z kterého je uvolněn změnou složení m.f.)

16 Mobilní fáze - polarita, iontová síla, technika eluce Volba: - rozpustnost vzorku - kompatibilita se stacionární fází a celým systémem - isokratická...x... gradientová eluce

17 Mobilní fáze - volba podle eluční síly Polarita (Snyderův polaritní index)... P Eluotropní hodnota - eluční síla (typ stacionární fáze, primárně pro NP) - ε 0 Rozpustnostní parametr... Rozpouštědlo P ε 0 (silikagel) ε 0 (C18) Hexan 0,1 0-7,3 Aceton 5,1 0,53 8,8 9,6 Acetonitril 5,8 0,52 3,1 12,7 Methanol 5,1 0,7 1,0 14,5 Voda 10, ,5

Typické kolony a sorbenty - technické parametry Rozměry kolony Zrnění Průtok Chromatografie 10-25 cm x 3-4,6 mm 3-10 μm 0,1-2 ml/min konvenční (klasická) 0,5-7,5 cm

10-200 cm x 0,2-0,5 mm 1-5 μm 1-10 μl/min kapilární (s náplní) 100-200 cm x 0,04-0,08 -------- < 1 μl/min kapilární (open tubular) 0,5-2 cm x 2 mm 1,8 μm 0,5-2,5

18 Typické kolony a sorbenty - technické parametry Rozměry kolony Zrnění Průtok Chromatografie cm x 3-4,6 mm 3-10 μm 0,1-2 ml/min konvenční (klasická) 0,5-7,5 cm x 3-4,6 mm 3-10 μm 0,1-2 ml/min rychlá 5-25 cm x + 2 mm 3-10 μm 0,05-1 ml/min narrow x micro-bore cm x + 1 mm 3-10 μm μl/min narrow x micro-bore cm x 0,2-0,5 mm 1-5 μm 1-10 μl/min kapilární (s náplní) cm x 0,04-0, < 1 μl/min kapilární (open tubular) 0,5-2 cm x 2 mm 1,8 μm 0,5-2,5 ml/min RRLC 5-15 cm x 2 mm 1,7 μm 0,1-1,0 ml/min UPLC 5-15 cm x < 1-2 mm 1,0 μm < 0,1-0,5 ml/min UHPLC Drážky na čipu 2,5-10 μm < 1 μl/min nano-lc (Lab on Chip) Lab on Chip

19 Třídění sorbentu - vliv na back pressure Vstupní frita SORBENT Výstupní frita - větší propustnost porozita může být větší než zrnění sorbentu - menší propustnost porozita musí být menší než zrnění sorbentu odpovídající back pressure

být větší než zrnění sorbentu - menší propustnost

20 Aplikace sorbentů o nízkém zrnění

21 Aplikace rychlé separace (RRLC)

Aplikace UPLC - multireziduální analýza pesticidů 100 HPLC % 20.06 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.

22 Aplikace UPLC - multireziduální analýza pesticidů 100 HPLC % UPLC % Time Průtok 0,3 ml/min (oba systémy) Time UPLC 10 min HPLC 50 min

Podobné dokumenty

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po