Sterilisace. Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Sterilisace Igor Hochel & Kateřina Demnerová

Sterilisace a hodnocení účinnosti sterilisačních postupů sterilisace zahrnuje aplikaci biocidního agens nebo fyzikální pochody s cílem odstranit, nebo usmrtit zárodky všech mikroorganismů podmínky sterilace degradace aktivních složek preparátů snížená stabilita zhoršená uživatelská přijatelnost testování účinnosti sterilisačních postupů znalost složení kontaminující mikroflory bez informací kontaminující bakterie jsou citlivé jako referenční organismus původci spongiformní encefalopathie (BSE), Creutzfeldt-Jakobovy choroby sterilizace vlhkým teplem 134-138 C, 18 min referenční mikroorganismy spory Bacillus stearothermophilus (sterilizace vlhkým teplem) spory Bacillus subtilis (sterilizace suchým teplem, chemická sterilace) spory Bacillus pumilus (sterilizace ionisujícím zářením)

Průmyslově využívané metody sterilizace fysikální metody sterilisace sterilisace vlhkým teplem sterilisace suchým teplem sterilisace ionisujícím zářením sterilisace UV zářením sterilisace filtrací chemické metody sterilisace sterilisace ethylenoxidem sterilisace formaldehydem

Kinetika hynutí mikroorganismu vlivem smrtících faktorů

dn dt t 0 cdt Účinnost sterilizace dn dt t 0 cdt N počet živých buněk, t čas, c měrná reakční rychlost pro tepelnou destrukci spor ln N N 0 cn N ct N 0 e ( E / RT ) kde c Ae log N N 0 kt c t ln10 c t 2,303

Log počtu živých buněk D hodnota 6 5 D t t )(log N log N ) 1/ k ( 2 1 1 2 4 3 2 D 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Čas (min)

Tepelná rezistence mikroorganismů Mikroorganismus (z~5 C) D (min) Salmonella sp. D 65 0,02-0,25 Staphylococcus aureus D 65 0,8-1,0 Escherichia coli D 65 0,1 plísně D 65 0,5-3,0 Campylobacter jejuni D 55 1,1 bakteriální endospory (z~10 C) B. stearothermofilus D 121 1,5 C. botulinum typ A a B D 121 0,1-0,2 C. sporogenes D 80 0,1-3.0 C. botulinum typ E D 110 <1 sekunda

Tepelná rezistence mikroorganismů bakterální spory > vegetativní buňky spory termofilní MO > psychotrofní MO > psychrofilní MO > askospory = vegetativní buňky fáze růstu (logaritmická stacionární) nízký obsah vody, dipikolinát vápenatý (spory) ph <6 a >8 přítomnost tuků a sacharosy v prostředí konc. ethanolu

Log D z hodnota 3.0 2.8 2.6 2.4 z ( T2 T1 )(log D1 log D2 ) 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 z 1.0 1 2 3 4 5 Teplota

Sterilita farmaceutických produktů

Sterilizace teplem teplo nejspolehlivější a nejvíce využívaný prostředek sterilizace destrukce enzymů a dalších buněčných komponent sterilisace vlhkým teplem (121 134 C) sterilizace suchým teplem (160 180 C)

Teplotní profil sterilizačního procesu

F-hodnota tepelné procesy nejsou ani rovnoměrné ani konstatní F-hodnota vyjadřuje celkový lethální efekt tepelného procesu v minutách při dané teplotě (dolní index) má-li nějaký proces tepelné sterilizace hodnotu F 121 = 4 znamená to, že zvolená kombinace teplot je ekvivalentní konstatnímu zahřátí produktu na teplotu 121 C, zahřívání při této teplotě po dobu 4 minut a následnému ochlazení F hodnota závisí na teplotní rezistenci mikroorganismu referenční mikroorganismus: spory B. stearothermophylus (z~10 C) F 121 D 121 (log N 0 log N) kde D 121 je D hodnota pro teplotu 121 C, N 0 je počáteční a N finální počet živých mikroorganismů na jednotku objemu F0 t 10 ( T 121) / z kde Δt je časový interval mezi měřením teploty, T je teplota produktu v čase t z je 10 C

Sterilizace vlhkým teplem nasycená pára kontakt s chladnějšími předměty způsobí kondensaci uvolnění cca 85 % celkové tepelné energie pára se vyvíjí přímo ve sterilizátoru, nebo odděleně ve vyvíječi páry přehřátá pára se chová jako horký vzduch méně účiné sterilizační médium přítomnost vzduchu omezuje průnik tepla do sterilizovaného materiálu Teplota ( C) Čas (min) Tlak (kpa) 115 30 69 121 15 103 126 10 138 134 3 207

Sterilizátory přenosné sterilizátory velkoobjemové sterilizátory (400-800 l) sterilizátory pro porésní materiály (minimální teplota 134 C) sterilizátory pro sterilizaci kapalin (minimální teplota 121 C)

Sterilizátory

Průběh sterilizace vlhkým teplem odstranění vzduchu a vhánění páry vytlačení vzduchu parou (lahvované roztoky) mechanické odsávání vzduchu (obvazový materiál, 2,5 kpa) kombinace obou metod intravenosní roztoky ve flexibilních plastových obalech nucené promíchávání vzduchu a páry, kontinuální zkrápění horkou vodou po odstranění vzduchu je pronikání páry do materiálu velmi rychlé a zahřátí je téměř okamžité zahřívání a exposice po dosažení provozní teploty a tlaku sušení a chlazení obvazový materiál evakuace a zahřívání (pára v plášti sterilizátoru), obnovení atm. tlaku vháněním sterilního vzduchu lahvované roztoky chlazení vodou v plášti sterilizátoru, rozprašování kondenzátu, vhánění filtrovaného stlačeného vzduchu vyjmutí sterilizovaného materiálu po dosažení atm. tlaku ve vnitřním prostoru a teplot <80 C

Horkovdušná sterilizace letální efekt horkého vzduchu = oxidativní procesy sterilizační podmínky: 160 180 C, 2 hodiny použití: sklo, kovové chirurgické nástroje, termostabilní roztoky, termostabilní práškový materiál eliminace pyrogenů 250 C F H -hodnota vyjadřuje letální efekt horkovzdušné sterilizace (v minutách) která je ekvivalentní počtu minut při expozici teplotou 170 C. z hodnota referenčního mikroorganismu (spory Bacillus subtilis) je 20 C

Horkovdušné sterilizátory horkovzdušná pec z leštěné nerezové oceli, kapacita 250 l mezi vnitřním a vnějším pláštěm topná tělesa, ventilátor na cirkulaci vzduchu police perforované z nerezové oceli kontinuální horkovzdušné sterilizátory infračervené záření nucená laminární konvekce zahřátého vzduchu sterilizační podmínky 250 300 C, několik minut sterilovaný materiál je chráněn před post-sterilizační kontaminací balením do papíru, nebo uzavíráním do kontejnerů s dobrou tepelnou vodivostí teplo se v sterilizovaném materiálu šíří zářením a konvekčním prouděním kolísání teplot max. ± 5 C

Sterilizace UV světlem a ionisujícím zářením urychlené elektrony (β-částice) γ-záření UV záření cílová molekula: DNA letální efekt přímé působení + poškození DNA volnými radikály vznikající v důsledku radiolýzy vody (γ-záření, urychlené elektony) = zlomy v řetězci DNA absorpce a excitace (UV záření λ = 260 nm, pyrimidinové base) = thyminové můstky O O CH3 CH 3 O 2 HN CH 3 hν HN NH O N H O N H N H O

Sterilizace UV světlem a ionisujícím zářením ionisující záření G - bakterie < G + bakterie = plísně < spory = kvasinky < viry Deinococcus (Micrococcus) radiodurans radiolýza roztoků, poškození obalů (polypropylen, PTFE) suchý materiál (chirurgický materiál, jednorázové stříkačky atd.) UV záření (pigmenty) G - bakterie < G + bakterie = plísně < bakteriální spory < spory plísní << viry nízká penetrace sterilizace vzduchu, vody, pracovních ploch referenční mikroorganismus spory Bacillus pumilus (D hodnoty) dávka: 25 kgy

Sterilizace γ-zářením zdroj záření: 60 Co ( 137 Cs) - poločas rozpadu 5,25 roku energie záření 1,33 MeV a 1,17 MeV kobaltové pelety uspořádané do prutů (740 TBq) celková aktivita zdroje: 3,7 10 4 TBq podmínky sterilizace: dávka závisí na výkonu zdroje doba sterilisace: cca 20 hodin

Sterilisace γ-zářením

Sterilizace urychlelnými elektrony a UV světlem maximální energie urychlených elektronů je 3 MeV a 10 MeV (podle typu urychlovače) vyšší energie indukovaná radiace výhody: sterilizační dávka je dosažena velmi rychle omezení: malá balení sterilizovaného materiálu UV záření rtuťové lampy 88 % záření představuje světlo o vlnové délce λ=254 nm ( tj. 85 % biol. aktivity záření o vlnové délce λ=260 nm )

Sterilizace filtrací filtrace odstraňuje živé i mrtvé buňky mikroorganismů z filtrovaného materiálu použití sterilizace tepelně nestabilních roztoků sterilizace vzduchu a technických plynů používaných v aseptických prostorách součást fermentorů, odstředivek, autoklávů a sušáren testování sterility filtrační materiály estery celulosy, polytetrafluorethylen, skleněná vlákna, skleněné nebo keramické sintrové filtry, infuzoriová hlinka sintrové filtry se sterilují tlakovou párou nebo horkým vzduchem, obtížné čistění (horká kyselina sírová s příměsí kys. dusičné) typy filtrů filtrační materiál (celulosová, viskosová, skleněná vlákna ) je stlačen ve válci a tvoří homogenní vrstvu značné výšky. Náplň musí být plněna pečlivě (rovnoměrné rozptýlení) aby nevznikaly kanálky a filtrovaný materiál nemůže pronikat podél stěn. Sterilizace: tlakovou párou, sušení horkým vzduchem jemná vlákna (plasty) jsou pro zpevnění podložena pevným textilním podkladem, filtrační jednotka je tvořena tenkou vrstvou. Používá se jedna filtrační vrstva nebo několik vrstev ve filtrech konstuovaných jako kalolis. Sterilizace formaldehydem (vlhké teplo)

Mechanismy záchytu částic adsorpce (porcelán, infuzoriová hlinka) záchyt přímé zachycování částic na vlákna filtru zachycování účinkem elektrostatických sil (velikost náboje častice a vlákna filtru, vliv vlhkosti, klesá s rychlostí toku filtrovaného materiálu) zachycování difusními silami (Brownův pohyb) efekt síta záchyt částic, které dosahují určité velikosti

Filtrace kapalin memránové filtry (velikost pórů 0,2-0,22 μm) sintrové filtry (<1 μm) omezené použití na korozivní roztoky, viskosní kapaliny a organická rozpouštědla kombinace několika filtračních disků kombinace s filtry pro záchyt velkých částic (prodloužení životnosti filtrační jednotky)

Filtrace vduchu vysoce účinné filtry (HEPA High-Efficiency Particulate Air) zachytí 99.997 % částic o velikosti >0,3 μm (většina bakteriálních buněk vázaná na prachové častice, spory plísní) použití: filtrace vzduchu do místností se zvýšenými požadavky na mikrobiální čistotu laminární boxy sterilizace vzduchu pro tkáňové a mikrobiologické kultury čištění a sterilizace plynů pro lékařské účely čištění a sterilizace technických plynů ve farmaceutické výrobě

Sterilizace nízkoteplotní plasmou plasma ionisovaný plyn (směs neutrálních částic, iontů a elektronů) serilizátory: objem 75 l páry peroxidu vodíku, peroctové kyseliny, směs kyslíku, vodíku a inertního plynu provozní teplota <50 C délka sterilizačního cyklu: 60 90 minut výhody: neexistence toxických residuí ve sterilizovaném materiálu, šetrná metoda nevýhody: nelze použít na sterilizaci kapalin a práškovitých materiálů použití: sterilizace lékařského materiálu (chirurgické nástroje, materiál pro jednorázové použití např. chirurgické rukavice, stříkačky atd.)

Sterilisace chemickými prostředky kritéria chemického sterilizačního agens značný biocidní efekt již při nízkých koncentracích neškodnost pro sterilizovaný materiál účinnost za normálních teplot a tlaků cenová dostupnost nesmí být hořlavý, explozivní a toxický snadná odstranitelnost reziduí sterilizačního agens v průmyslovém měřídku - sterilisace chemicky reaktivními plyny (ethylenoxid (CH 2 ) 2 O, formaldehyd CH 2 O) mechanismus účinku alkylace sulfhydrylových, hydroxylových, karboxylových skupin a aminoskupin proteinů a iminových skupin nukleových kyselin použití: sterilizace chirurgického materiálu a nástrojů, některých lékařských a diagnostických zařízení a pomůcek, povrchová sterilizace práškových materiálů

Sterilizace ethyleoxidem ethylenoxid (oxiran) je bezbarvý plyn, pod bodem varu bezbarvá kapalina. mol. hmotnost: 44,05 teplota varu: 10,7 C teplota tání: -112 C rozpustnost: rozpustný ve většině organických rozpouštědel a vodě vysoce hořlavý plyn, explosivní ve směsi se vzduchem v poměru 3-100 % pro sterilizaci se používá ve směsi s CO 2 (10 %) nebo HFC124 (8,6 %) [HFC 2-chloro-1,1,1,2-tetrafluorethan], nebo čistý plyn po odstranění vzduchu účinná koncentrace: 800 1200 mg l -1 operační teplota: 45 63 C výhody: snadná penetrace obalovým materiálem (papír, plasty, tkaniny) nevýhody: výbušný a toxický (karcinogenní) plyn, nutnost odstraňovat toxická rezidua (nucená cirkulace teplého vzduchu 2 24 h)

Sterilizace ethyleoxidem sterilizátory ocelové komory odolné proti úniku plynu (100 300 l) a zabezpečené proti explozi nucená cirkulace plynu, subatmosferický tlak obalový materiál musí být propustný pro páru, vzduch i použité sterilizační agens

Sterilizace formaldehydem formaldehyd jako sterilizační plyn se připravuje zahříváním 37 % roztoku párou na teplotu 70 75 C, účinná koncentrace: 15 100 mg l -1 toxicita: podobná jako u ethylenoxidu nevýhody: nízká penetrace obalové materiály papír, bavlněná tkanina

Podmínky sterilizace farmaceutických produktů Sterilizační metoda Podmínky sterilizace vlhkým teplem 121 C, 15 min 134 C, 3 min horkovzdušná sterilizace 160 C, 120 min 170 C, 60 min 180 C, 30 min γ-záření, urychlené elektrony 25 kgy filtrace velikost pórů: 0,22 μm, sterilní membránové filtry ethyleoxid koncentrace: 800 1200 mg l -1 teplota: 45 63 C vlhkost: 30 70 % doba sterilizace: 1 4 h formaldehyd koncentrace: 15 100 mg l -1 teplota: 73 C doba sterilizace: 40-180 min

Validace sterilizačních postupů validace znamená jednoznačný průkaz že sledovaný proces trvale poskytuje výsledky pro které byl navržen proces validace metody sterilizace vlhkým teplem zahrnuje kalibrace a testování všech měřících zařízení, které slouží k monitorování procesu sledování kvality produkované páry testy netěsnosti autoklávu, testy penetrace páry (prázdný autokláv, autokláv naplněný materiálem) testování účinnosti sterilačního cyklu pomocí biologických indikátorů testy opakovatelnosti vedení odpovídající dokumentace způsoby validace sterility jsou voleny podle termostability sterilizovaného produktu a celkového počtu mikroorganismů před sterilizací biol. indikátor obsahující 10 6 testovacího mikroorganismu bude inaktivován v polovině předepsané doby exposice (tzn. že k dosažení hladiny 10-6 proběhne redukce živých zárodků o 12 řádů v předepsané době exposice)

Monitorování sterilizačních postupů soustavné ověřování efektivity sterilizačního procesu spolu s kontrolou sterility produktů slouží ke stanovení mikrobiologické nezávadnosti daného lékového přípravku fyzikální indikátory měření teploty (termočlánky) tlaku (tlakoměry) vlhkosti, koncentrace sterilizačního média nezávisle na tlaku, aplikované dávky záření (filmové dozimetry) měření účinnosti filtrů (dioktylftalátové částice) chemické indikátory založeny na schopnosti tepla, páry, ionisujícího záření měnit fyzikálně-chemické vlastnosti indikátoru (změna nastává pouze při dosažení požadovaných podmínek) indikátory monitorující několik parametrů (teplota, saturace páry, čas) indikátory monitorující jediný parametr použitelné k rozlišení sterilizovaného a nesterilizovaného materiálu chemické indikátory procházejí procesem tání nebo změnou barvy

Monitorování sterilizačních postupů biologické indikátory standardisovaný preparát bakteriálních spor referenčního mikroorganismu suspendované ve vodě, v suchém stavu na papíru, hliníku nebo plastovém nosiči po sterilizaci asepticky přeneseny do kultivačního média a pravidelně kontrolovány známky růstu požadavky na referenční mikroorganismus spory nepathogenních druhů mikroorganismů nadprůměrná rezistence k dané sterilizační metodě krátká inkubační doba

Biologické indikátory doporučené Evropskou farmakopedií (2002) Sterilizační metoda Druh Inokulum D sterilizace vlhkým teplem (121 C) B. stearothermophylus >5 10 5 >1,5 min horkovzdušná sterilizace (160 C) B. subtilis var. niger >1 10 5 5-10 min H 2 O 2, kys. peroctová B. stearothermophylus >5 10 5 - ethylenoxid (54 C, 60 % rel. vlhkost, 600 mg l - 1 ) B. subtilis var. niger >5 10 5 >2,5 min formaldehyd B. subtilis var. niger >5 10 5 - ionisující záření B. pumilus >1 10 7 1,9 kgy filtry: velikost pórů 0,45 μm, mikroorganismus: Serratia marcescens (0,5 μm) velikost pórů 0,22 μm, mikroorganismus: Brevundimonas diminuta (0,3 μm) standardisované inokulum: 10 7 buněk cm -2 počáteční validace, charakteristiky výrobní dokumentace

Testy sterility farmaceutických výrobků sterilní produkt neobsahuje žádné živé zárodky mikroorganismů testy kultivace testovaného materiálu v živném médiu problémy: destruktivní test (omezené množství testovaného materiálu) média podporující růst nutričně nenáročných bakterií, kvasinek a plísní podmínky kultivace

Testy sterility farmaceutických výrobků metody přímá inokulace na thioglykolátové médium (anaerobní organismy inkubace 30 35 C) tryptosové médium (anaerobní organismy: inkubační teplota inkubace 30 35 C, kvasinky a plísně: inkubace 20 25 C) druhé alternativní médium membránová filtrace filtrace přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm, promytí filtry, dělení a inkubace v odpovídajících médiích rozpouštění past a prášku při 45 C ve fysiologickém roztoku, filtrace přídavek koncentrovaného kultivačního média k roztoku intravenosní roztoky

Testy sterility farmaceutických výrobků Antimikrobiální činidla Antimikrobiální činidlo fenol, kresol alkoholy parabeny rtuťnaté sloučeniny kvartérní ammonné sloučeniny benzylpenicilin, ampicilin ostatní antibiotika sulfonamidy inaktivační činidlo žádné (ředění) žádné (ředění) ředění a Tween SH-sloučeniny lecithin a Tween β-laktamasa (B. cereus) žádné (filtrace) kyselina p-aminobenzoová

Positivní testy průkaz že se mikroorganismus bude pomnožovat za podmínek testu použitý mikroorganismus musí být citlivý na antimikrobiální agens v léčivém přípravku (růst mikroorganismu indikuje dostatečnou inaktivaci aktivní složky) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niger

Testy na přítomnost vybraných pathogenů Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae pomnožení v médiu obsahující sojový a kaseinový hydrolyzát (37 C, 24 h) očkování na selektivní a diagnostické půdy anaerobní pathogeny (kultivace v Columbia agaru a thioglykolátovém médiu) při záchytu je nutná jednoznačná identifikace

Vzorkování šarže všechna balení jednoho přípravku současně připravená a sterilizovaná 900 lahví infuzního roztoku sterilizované ve 3 autoklávech = tři šarže normované postupy (20 vzorků pro šarže o velikosti >500 položek)

Kvalita sterilizované látky Měřítkem zachování kvality sterilizovaného produktu Q je koncentrace důležité (aktivní) složky po sterilizaci: Q ln C C 1 2 kde C 1 je koncentrace důležité složky před sterilizací, C 2 je koncentrace složky po sterilizaci. V rovnici se neobjevuje faktor objemu a proto je měřídko zachování kvality látky nezávislé na rozměru použitého zařízení