Využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů

Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc. Ing. Petr Svoboda, CSc. Využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů CERTIFIKOVANÁ METODIKA Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Chmelařský institut s.r.o., Žatec 2012

Metodika je výstupem řešení výzkumného projektu NAZV QH91164 Využití kryoterapie k ozdravení bramboru a chmele od vybraných patogenů. Metodika proběhla oponentním řízením. O uplatnění metodiky byla dne 14.5. 2012 uzavřena smlouva podle ustanovení 269 zákona č. 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. UKZUZ Brno, jako certifikační orgán, vydal dne 16.11. 2012 Osvědčení č.j. 194-18/KÚ/UKZUZ/2012 o uznání uplatněné certifikované metodiky. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2012 ISBN: 978-80-7427-109-0 2

Autoři: Ing. Miloš Faltus, Ph.D. (40%) Ing. Jiří Zámečník, CSc. (30%) Ing. Petr Svoboda, CSc. (30%) Název: Využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 250 výtisků Vyšlo v roce 2012, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: faltus@vurv.cz zamecnik@vurv.cz p.svoboda@chmi.cz Autor fotografií: Miloš Faltus Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2012 ISBN: 978-80-7427-109-0 3

VYUŽITÍ METODY KRYOTERAPIE PRO OZDRAVENÍ CHMELE OD VIROVÝCH PATOGENŮ Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2012 4

Miloš Faltus a kol. Využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů CERTIFIKOVANÁ METODIKA Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2012 5

Využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů Tato metodika představuje moderní a velice účinnou metodu eliminace virových patogenů chmele pomocí působení kryogenních teplot. V metodice jsou popsány základní principy metody, postup přípravy rostlinného materiálu, vystavení kryogenním teplotám i princip následného hodnocení zdravotního stavu explantátů chmele pomocí metod ELISA. Tato metodika bude využita pro získání ozdraveného výchozího materiálu chmele pro produkci bezvirózní sadby chmele. Use of the cryotherapy for virus elimination in hop This method is a novel and highly effective method for elimination of some viral pathogens in hop by means of a cryogenic temperature treatment. Basic principles of the method, steps of explants preparation, cryogenic treatment and presence of viral pathogens evaluation are described. This method will be utilized for an improvement of virus-free planting material production efficiency in hop. Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2012 6

Obsah: I. Cíl metodiky... 8 II. Vlastní popis metodiky... 8 A. Princip metody... 8 B. Materiál... 8 1. Přístrojové vybavení... 8 2. Chemikálie... 9 3. Drobné pomůcky... 9 4. Rostlinný materiál a kultivační podmínky... 11 5. Kultivační media... 11 6. Příprava sterilního silikagelu pro dehydrataci vzorků... 12 7. Metody diagnostiky a kontroly virových a viroidních patogenů... 12 C. Postup metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů... 12 1. Namnožení explantátů... 12 2. Předkultivace a otužování explantátů... 12 3. Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou... 14 4. Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem... 14 5. Vystavení explantátů kryogenním teplotám... 14 6. Regenerace explantátů... 14 7. Testování zdravotního stavu... 14 III. Srovnání novosti postupů... 15 IV. Popis uplatnění metodiky... 17 V. Ekonomické aspekty... 17 VI. Seznam použité související literatury... 18 VII. Seznam publikací, které předcházely metodice... 19 VIII. Dedikace... 19 IX. Jména oponentů:... 19 7

I. Cíl metodiky Cílem metodiky je definovat postup pro eliminaci virových patogenů pomocí metody kryoterapie. II. Vlastní popis metodiky A. Princip metody Tato metoda je založena na poznatku, že rostliny, respektive některé jejich části, jsou za jistých okolností schopny tolerovat působení ultranízkých teplot (bod varu tekutého dusíku, cca -196 C). Podstatou metody kryoterapie je vystavení zavirovaných explantátů ultranízké teplotě, které vede k poškození zpravidla diferencovaných rostlinných buněk. Pokud je distribuce viru v rostlinách omezena na diferencované buňky a meristém explantátu není viry zasažen, lze takto zbavit explantát přítomnosti virů. Ultranízká teplota tedy neničí samotný vir, ale pouze rostlinou buňku, která obsahuje vir. Tím dojde k eliminaci dalšího šíření viru v rostlině a při regeneraci explantátů dochází v optimálním případě k regeneraci pouze meristematické části, která je viruprostá. Účinnost této metody je závislá na distribuci viru v rostlině a na její toleranci vůči působení kryogenních teplot. B. Materiál 1. Přístrojové vybavení Pro provedení metody kryoterapie je třeba disponovat následujícím přístrojovým vybavením: Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box laminární box Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních médií: autokláv horkovzdušný sterilizátor třepačka Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních médií: analytické váhy přesné váhy ph-metr laboratorní míchačka mikrovlnná trouba chladnička Přístroje pro ELISA diagnostiku ELISA-reader vymývačka mikrotitračních destiček 8

Nádoby na tekutý dusík: Dewarova nádoba pro uchování tekutého dusíku polystyrénová nádoba na tekutý dusík polystyrénová nádoba na kryozkumavky v lázni tekutého dusíku Záznamy a výpočty: počítač tiskárna 2. Chemikálie V následujícím seznamu jsou uvedeny všechny chemikálie potřebné pro metodu kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů: Kultivační média: destilovaná voda makroelementy dusičnan amonný, dusičnan draselný, dusičnan vápenatý, dihydrogen fosforečnan draselný, chlorid vápenatý, síran hořečnatý mikroelementy - chlorid kobaltnatý, síran měďnatý, síran draselný, síran železnatý, kyselina boritá, jodid draselný, síran manganatý, molybdenan disodný, síran zinečnatý, železito-sodná sůl kyseliny etylendiaminotetraoctové vitamíny a další účinné látky thiamin, pyridoxin, kyselina nikotinová, glycin fytohormony kyselina indolyl-3-máselná, 6-benzylaminopurin, kyselina giberelová glukosa (P.A.) agar (Sigma Aldrich) Úprava ph média: hydroxid - hydroxid draselný kyselina - kyselina chlorovodíková Kryoprotektivní roztok: destilovaná voda sacharóza (P.A.) Chladící médium: tekutý dusík ELISA: imunodiagnostické soupravy pro detekci jednotlivých virů metodou ELISA (včetně pufrů, protilátek a substrátu) 3. Drobné pomůcky Následující pomůcky jsou potřebné pro realizaci metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů: Příprava médií, roztoků a jejich dávkování: Erlenmeyerova baňka 500 ml odměrný válec 1000 ml 9

Pasteurova pipeta 3 ml střička váženky dávkovač magnetické míchadlo kopisťka jednokanálové pipety, vícekanálové pipety a špičky Práce se sterilním materiálem: skalpel nůžky pinzety stojánek na nástroje hliníková folie Kultivace rostlin: kultivační zkumavky s hliníkovým uzávěrem (rozměry 12 x 1,7 cm) stojánek na zkumavky plastové kultivační nádoby (rozměry 10 x 10 x 9 cm, Duchefa) plastové Petriho misky (průměr 6 cm) skleněné Petriho misky (průměr 15 cm) Erlenmeyerova baňka (objem 25 ml) Izolace a dehydratace vzrostných vrcholů: injekční jehly (rozměry 0,7 x 40 mm) stříkačky (objem 10 ml) filtrační papír (průměr 11 cm) skleněné Petriho misky (průměr 4, 12, 15 a 20 cm) hliníkové plíšky (rozměr 20 x 6 x 0,05 mm) nádobky na silikagel (objem 200 ml) Kryoterapie: kryozkumavky (objem 1,8 ml, NUNC) polystyrénový džbán (objem 1L) stojánek na kryozkumavky Odtání vzorků: Erlenmeyerova baňka (objem 100 ml) nerezová miska parafilm ELISA: mikrotitrační destičky stojánky a kyvety 10

4. Rostlinný materiál a kultivační podmínky Pro metodu kryoterapie použijeme explantátové kultury chmele. Explantáty pěstujeme v aseptických podmínkách na pevném agarovém mediu v kultivačním boxu při teplotě 25 ± 1 C, hustotě světelného toku 80 µmol m -2 s -1 a fotoperiodě 16/8 h. Do kultivačních zkumavek s 5 ml média vložíme po jednom nodálním segmentu; do plastových krabiček se 100 ml media vložíme třicet nodálních segmentů. Otužování explantátů provádíme při stejném světelném režimu jako při kultivaci rostlin, ale při snížené teplotě (2 ± 1 C). 5. Kultivační media Pro kultivaci rostlin použijeme agarové kultivační medium podle Murashige a Skooga (1964) se sníženým obsahem dusíku (Tab. 1), bez rostlinných fytohormonů s 20 g l -1 glukosy a 6 g l -1 agaru (Faltus et al. 2007). Toto medium použijeme jak pro multiplikaci rostlin, tak pro otužování explantátů před kryoterapií. Pro regeneraci rostlin použijeme regenerační medium, které má shodné složení živin a vitamínů jako kultivační medium, ale obsah glukosy je zvýšený na 40 g l -1 a navíc do média přidáme směs fytohormonů (0,1 mg l -1 6- benzylaminopurinu, 0,02 mg l -1 kyseliny giberelové a 0,01 mg l -1 kyseliny indolyl-3-máselné) (Faltus et al. 2007). Tab. 1: Složení modifikovaného kultivačního média podle Murashige a Skooga (1964) Složky média Chemický vzorec/ zkratka* Zastoupení jednotlivých složek v kultivačním médiu (mg l -1 ) MAKROELEMENTY Chlorid vápenatý CaCl 2 332,02 Dihydrogenfosforečnan draselný KH 2 PO 4 170 Dusičnan draselný KNO 3 950 Síran hořečnatý MgSO 4 180,54 Dusičnan amonný NH 4 NO 3 412,5 MIKROELEMENTY Chlorid vápenatý, hexahydrát CoCl 2.6H 2 O 0,025 Síran měďnatý, pentahydrát CuSO 4.5H 2 O 0,025 Železito-sodná sůl kyseliny FeNaEDTA * 36,7 etylendiaminotetraoctové Kyselina fosforečná H 3 PO 4 6,2 Jodid draselný KI 0,83 Síran manganatý, dihydrát MnSO 4.H 2 O 16,9 Molybdenan disodný Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 Síran zinečnatý, heptahydrát ZnSO 4.7H 2 O 8,6 VITAMÍNY A DALŠÍ LÁTKY Glycin C 2 H 5 NO 2 2 Kyselina nikotinová C 6 H 5 NO 2 0,5 Myo-inositol C 6 H 12 O 6 100 Pyridoxin C 8 H 11 NO 3 0,5 Thiamin C 12 H 17 N 4 OS 0,1 11

6. Příprava sterilního silikagelu pro dehydrataci vzorků Dehydrataci explantátů chmele provádíme ve skleněných nádobkách (200 ml) s 50 g vysušeného sterilního silikagelu. Silikagel sušíme dva dny v horkovzdušném sterilizátoru při teplotě 170 C. Po vysušení silikagelu nádobky uzavřeme a sterilujeme v horkovzdušném sterilizátoru dalších 10 hodin. 7. Metody diagnostiky a kontroly virových a viroidních patogenů Diagnostiku přítomnosti virových patogenů provádíme v první fázi hodnocení imunoenzymatickou metodou ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Svoboda 1993, Svoboda 2009) a následně bezvirózní stav ověřujeme pomocí molekulární metody PCR, která je velmi citlivá a umožňuje identifikovat genetickou sekvenci, typickou pro daný testovaný patogen (Petrzik, Svoboda 1997, Komínek, Svoboda 2003). Pro identifikaci viroidů použijeme molekulárně hybridizační metodu dot blot nebo metodu RT PCR (Svoboda 2009, Svoboda et al. 2009). C. Postup metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů Postup kryoterapie explantátů chmele lze rozdělit do sedmi postupných kroků: Namnožení explantátů Předkultivace a otužování explantátů Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vystavení explantátů kryogenním teplotám Regenerace explantátů Hodnocení přítomnosti virových patogenů Postup využití metody kryoterapie pro ozdravení chmele od virových patogenů je schematicky znázorněn na Obr.1. 1. Namnožení explantátů Explantáty chmele ve stáří 6 až 8 týdnů použijeme pro přípravu jedno-nodálních segmentů. Nodální segmenty kultivujeme v počtu 30-ti kusů v krabičkách se 100 ml multiplikačního media. Při první multiplikaci vysadíme jednu krabičku s třiceti nodálními segmenty a při druhé multiplikaci z třiceti explantátů odvodíme sto nodálních segmentů a vysadíme je do třech krabiček. 2. Předkultivace a otužování explantátů Nodální segmenty v počtu 100 kusů vysadíme do krabiček s 50 ml multiplikačního media. Od každého genotypu vysadíme 300 nodálních segmentů. Po 7 až 10 dnech kultivace při 25 C krabičky s nodálními segmenty přeneseme do kultivačního boxu s teplotou 2 C. Po 7 až 10 dnech otužování nízkou teplotou aplikujeme do krabiček s nodálními segmenty 25 ml 0,7 M roztoku sacharosy, který necháme působit dalších 7 až 10 dní. 12

Namnožení explantátů Předkultivace nodálních segmentů Otužování nízkou teplotou Aplikace 0,7 M sacharosy Umístění vrcholů na plíšky Sycení vrcholů 0,7 M sacharosou Izolace vzrostných vrcholů Dehydratace vrcholů nad silikagelem Vystavení explantátů kryogenním teplotám (vlastní kryoterapie) Odtátí vzorků ve vodní lázni Regenerace explantátů pro testy zdravotního stavu Vysázení na regenerační medium Obr. 1. Postup kryoterapie explantátových kultur chmele. 13

3. Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou Vzrostné vrcholy (o velikosti 1 až 2 mm) izolujeme z nodálních segmentů pomocí injekční jehly, kterou použijeme jako mikroskalpel. Vrcholy chmele umístíme do Petriho miskek (12 cm) na sterilní filtrační papír nasycený 0,7 M roztokem sacharosy (14 ml) s fytohormony (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl-3-máselné, 0,01 mg l -1 6- benzylaminopurinu) po dobu 20 hodin při teplotě 22 C. 4. Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vrcholy chmele nasycené sacharosou umístíme na hliníkové plíšky po deseti kusech a vždy dva plíšky umístíme do jedné Petriho misky (4 cm). Spodní díl Petriho misky s plíšky a explantáty umístíme pomocí sterilní pinzety do nádoby se silikagelem. Dehydrataci vzrostných vrcholů chmele provádíme při teplotě 22-23 C. Po 1,5 až 2 hodinách dehydratace explantátů vysušíme materiál přibližně na obsah vody 0,4 g v 1 g sušiny. Uvedená doba dehydratace platí pouze pro nádoby a množství silikagelu a rostlinného materiálu, které jsou uvedeny v této metodice; jakákoliv změna způsobuje změnu doby dehydratace vzrostných vrcholů. Obsah vody ve vzorcích stanovíme vážením u kontrolních vzorků, které vysušíme v sušárně. Nejprve stanovíme hmotnost vzorků před dehydratací, poté hmotnost vzorků po dehydrataci a nakonec hmotnost sušiny po dosušení vzorků v sušárně při 105 C po dobu 72 hodin. 5. Vystavení explantátů kryogenním teplotám Po vysušení jsou explantáty přilepeny k plíškům zaschlým přebytkem roztoku sacharosy. Díky tomu můžeme s plíšky manipulovat, aniž by došlo k náhodnému odpadnutí explantátu. Nejprve si připravíme polystyrenovou nádobu, která slouží jako stojánek pro kryozkumavky a zároveň jako nádoba na tekutý dusík. Tuto nádobu naplníme tekutým dusíkem a pak do ní umístíme kryozkumavky a i ty naplníme tekutým dusíkem. Plíšky s explantáty pomocí pinzety co nejrychleji ponoříme do tekutého dusíku v polystyrenové nádobě. Po ochlazení explantátů na teplotu tekutého dusíku (-196 C) plíšky umístíme do kryozkumavky a uzavřeme je víčkem. Víčko kryozkumavky nedotahujeme, ale mohl tekutý dusík pronikat přes závit do kryozkumavky. 6. Regenerace explantátů Standardní doba pobytu vzorků v tekutém dusíku je 60 minut. Po otevření víčka hliníkové plíšky rychle vytáhneme pinzetou z kryozkumavek a i s vrcholy je ponoříme do vodní lázně o laboratorní teplotě. Explantáty, po jejich odlepení z plíšků, vyjmeme z vody a přeneseme je na regenerační medium s fytohormony (0,1 mg l -1 6-benzylaminopurinu, 0,02 mg l -1 kyseliny giberelové a 0,01 mg l -1 kyseliny indolyl-3-máselné). Hodnocení životnosti rostlin provedeme po dvou týdnech a hodnocení regenerace po osmi týdnech od vysazení. Za živé považujeme explantáty, u nichž je patrný růst a nedochází u nich ke ztrátě chlorofylu. Apikální růst spojený s tvorbou stonku označujeme jako regeneraci. 7. Testování zdravotního stavu Rostliny chmele in vitro, které zregenerovaly po kryoterapii otestujeme pomocí testu ELISA na konkrétní vir. Toto hodnocení, které považujeme jen za předběžné, umožňuje provést první selekci ozdravených a neozdravených materiálů. Koncentrace viru může být v důsledku 14

terapie dočasně snížena až pod hranici detekčního limitu a je zde vážné nebezpečí zpětné reinfekce, tzn., že vzniká falešný negativní výsledek, který může být pro další rozhodování a práci velmi nebezpečný. Vlastní diagnostiku provádíme pomocí metody ELISA podle Svobody (2009) a Svobody et al. (2010). U materiálů, u nichž jsme neprokázali virovou infekci při orientačním prvním hodnocení přímo z rostlinek in vitro, provedeme komplexní hodnocení zdravotního stavu rostlin po následujících 8-12 týdnech pěstování ve skleníku v izolované kóji. Hodnocení provádíme opět pomocí metody ELISA na konkrétní viry, přičemž u materiálů, které jsou i po druhém hodnocení negativní, provedeme hodnocení pomocí molekulárně-genetické metody PCR (Petrzik, Svoboda 1997, Komínek, Svoboda 2003, Svoboda et al. 2010). Materiály, které jsou opakovaně negativní, přeneseme do technického izolátu a zahájíme jejich množení pro kontrolní výsadbu ve chmelnici, kde bude provedeno komplexní sledování a hodnocení z pohledu fenologicko-genetického, zdravotního stavu a výnosových parametrů. III. Srovnání novosti postupů Zdravotní stav má rozhodující úlohu v systému pěstování dané plodiny. Chmel množený vegetativním způsobem a pěstovaný mnoho let na jednom stanovišti je silně vystaven infekci ze strany virových a viroidních patogenů. Proto byla vždy jeho zdravotnímu stavu věnována značná pozornost. V České republice je tato problematika velmi významná, protože na rozdíl od jiných zemí pěstujících chmel, v České republice z celkové plochy chmele 4 435 ha zaujímá 3 854 ha tj. 86.8 % (stav k 30.4. 2012) pouze jedna odrůda a to světově proslavený Žatecký poloraný červeňák. Získání zdravé sadby a její pěstování má proto mimořádný hospodářský význam pro celé české chmelařství. Žatecký poloraný červeňák jako stará původní odrůda, je plně infikován viry a viroidy. Nové moderní odrůdy získané křížením jsou již relativně zdravé, protože většina těchto patogenů se nepřenáší semeny. Proto také v ostatních zemích, kde se takové odrůdy ve zvýšené míře pěstují, nemá ozdravování takový význam, nebo se provádí pouze v omezené míře. Všeobecné podmínky pro přípravu výchozího sadbového materiálu a systému hodnocení zdravotního stavu uvádí schémata Evropské organizace pro ochranu rostlin (European and Mediterranean Plant Protection Organization - EPPO). Ta uvádí přehled jednotlivých nežádoucích patogenů, metody jejich diagnostiky a limity jejich možného výskytu v sadbovém materiálu. Na základě hodnocení zdravotního stavu proto rozlišujeme tzv. zdravotní třídu VF (virus free) rostlinný materiál prostý všech známých patogenů pro danou plodinu a třídu VT (virus tested) rostlinný materiál bez přítomnosti vybraných závažných patogenů, které schémata EPPO uvádí. Na tyto všeobecné a závazné předpisy navazuje národní legislativa. Zákon o osivu a sadbě č. 316/2006 Sb. a dále vyhláška č. 332/2006 Sb. o množitelských porostech a rozmnožovacím materiálu chmele, révy, ovocných rodů a druhů a okrasných druhů a jejich uvádění do oběhu, stanoví základní podmínky pro množení sadby chmele a její uvádění do pěstitelské praxe. V minulosti byla u chmele popsána celá řada chorob virového původu (Blatný a Osvald, 1950). Název chorob vycházel ze symptomatologického hodnocení. Jejich výskyt byl dán původem pěstovaného chmele a způsobem rozmnožování sadby chmele. Jednalo se především o choroby mosaikového typu, které bylo možno postihnout na základě vizuálních symptomů. Proto bylo v padesátých letech minulého století zavedeno uznávací řízení matečných chmelnic, z kterých byla odebírána sadba pro množení. Byl prováděn tzv. 15

negativní výběr, což znamenalo fyzickou likvidaci napadených nebo podezřelých rostlin z porostu, který byl určen pro odběr sadbového materiálu. Prakticky to znamenalo soustavné ozdravování, protože sadba byla odebírána z chmelnic, které neobsahovaly viditelně napadené rostliny. Tím byla celá řada onemocnění prakticky zlikvidována a v porostech chmele zůstaly pouze rostliny bez příznaků, vizuálně zdravé. Bylo to na svou dobu velmi účinné řešení, ale na druhou stranu to ale znamenalo, že nadále byl odbírán sadbový materiál z rostlin latentně infikovaných tj. bez vizuálních příznaků a virové infekce byly dále šířeny pomocí sadby. Nástup moderních a objektivních diagnostických metod v 80. letech umožnil v praxi rychle a spolehlivě identifikovat původce skrytých infekcí tj. viry a dále také viroidy a zahájit jejich eliminaci. U chmele na území České republiky byly identifikovány následující viry a viroidy, viz. Tab.2. Tab.2. Přehled virových chorob chmele Český název Vědecký název Označení Viry Virus mozaiky jabloně Apple mosaic virus ApMV Virus nekrotické kroužkovitosti Prunus necrotic ringspot virus PNRSV slivoně Virus mozaiky chmele Hop mosaic virus HpMV Latentní virus chmele Hop latent virus HpLV Viroidy Latentní viroid chmele Hop latent viroid HLVd Na základě vědeckého rozvoje v oblasti diagnostiky a biotechnologických metod bylo možné přistoupit k odstranění patogenů, které latentně infikují chmel a nevytváří viditelné příznaky. Proto bylo přistoupeno v 80. letech minulého století k ozdravovacímu procesu českého chmele. Vrcholová pletiva rostlin, která obsahují aktivní dělicí buňky tzv. meristémy, neobsahují viry a je z nich možné kultivací ve zkumavkách získat ozdravené rostliny bez virů. Pro zdokonalení ozdravení a zvýšení úspěšnosti se tato technika kombinuje s termoterapií, kdy ve speciálním zařízení tzv. termokomoře, jsou rostliny udržovány při teplotách nad 35 C a vlivem působení tepla dojde k omezení množení termolabilních virů a jejich následnému odstranění, v našem případě viru mozaiky jabloně ApMV (Svoboda 2003). Další metodou, která využívá speciálních chemických látek omezujících množení viru, je tzv. chemoterapie. K získání ozdravených materiálů chmele je dnes v ČR nejčastěji využíván odběr vrcholových meristematických pletiv a jejich kultivace v in vitro podmínkách kombinovaná s termoterapií, při které však dochází v důsledku teplotního stresu k vysokému úhynu ozdravovaného materiálů. Nově navržená metoda kryoterapie zvyšuje efektivnost procesu ozdravování chmele ve srovnání s tradičními metodami ozdravování u vybraných virů. Tato metoda je účinná pro eliminaci virů ApMV a HpMV (15 až 88 %). Hlavní předností metody je však zkrácení doby ozdravování, protože pro ozdravení stačí pouze jeden cyklus působení kryogenních teplot. 16

IV. Popis uplatnění metodiky Uživatelem metodiky Kryoterapie je Svaz pěstitelů chmele. Využitím této metodiky pro ozdravení chmele od virových patogenů dojde ke zkrácení a zefektivnění procesu ozdravování sadbového materiálu chmele. V. Ekonomické aspekty Náklady na zavedení metody Náklady na zavedení postupů uvedených v metodice závisí na tom, jestli se zavádí nově celý provoz pro práci s rostlinami v aseptických podmínkách nebo se pouze implementuje metodika ozdravování explantátů pomocí kryoterapie do stávajících provozů tkáňových kultur. V případě, že laboratoř již postup kultivace explantátů používá, jsou náklady na zavedení postupu dané pouze nákupem chemikálií a pomůcek pro kryoterapii, pokud nejsou již k dispozici. Náklady na zavedení celého aseptického provozu jsou následující: Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních médií: autokláv od 105 tis. Kč (repasovaný do 40 tis. Kč) horkovzdušný sterilizátor od 34 tis. Kč třepačka od 38 tis. Kč Celkem od 177 tis. Kč (112 tis. Kč) Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box od 300 tis. Kč (repasovaný od 200 tis. Kč) laminární box od 150 tis. Kč Celkem od 450 tis. Kč (350 tis. Kč) Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních médií: analytické váhy od 43 tis. Kč (bez interní kalibrace od 23 tis. Kč) přesné váhy od 7,5 tis. Kč stolní ph-metr od 25 tis. Kč laboratorní míchačka od 5 tis. Kč chladnička cca 4 tis. Kč mikrovlnná trouba cca 1 tis. Kč dávkovač od 4 tis. Kč pipety (3 ks) od 7 tis. Kč Celkem od 96,5 tis. Kč (76,5 tis. Kč) Přístroje pro ELISA diagnostiku ELISA reader Vymývačka mikrotitr. destiček Vícekanálové pipety Celkem od 200 tis. Kč od150 tis. Kč od 20 tis. Kč od 370 tis. Kč 17

Spotřební materiál Sklo Plasty Chemikálie Pinzety, nůžky, skalpely Celkem Cena za zavedení celého provozu cca 10 tis. Kč cca 12 tis. Kč cca 35 tis. Kč cca 5 tis. Kč cca 62 tis. Kč 1156 tis. Kč (971 tis. Kč) Z uvedeného přehledu je patrné, že zavedení celého provozu ozdravování explantátů chmele v in vitro podmínkách začíná na částce přibližně 970 tis. Kč, která je odvozena od nákladů za vybavení laboratoře přístroji pro práci s materiálem v aseptických podmínkách a ELISA diagnostiky. Protože se předpokládá, že nová metodika nahradí stávající postupy eliminace některých patogenů chmele, lze konstatovat, že náklady na zavedení celého provozu nepřekročí náklady na spotřební materiál potřebný pro metodu kryoterapie bez diagnostiky virů, tedy přibližně do 40 tis. Kč. Ekonomický přínos pro uživatele Rozsah uplatnění metodiky je daný efektivitou metody pro jednotlivé druhy virů chmele. Bylo zjištěno, že metoda kryoterapie je účinná na eliminaci viru mozaiky jabloně (ApMV) a viru mozaiky chmele (HpMV). Tyto viry se vyskytují v ozdravované sadbě; tím je podmíněna i míra rozsahu uplatnění metodiky kryoterapie pro eliminaci virů chmele. Předpokládané ekonomické přínosy a další přínosy jsou odvozeny od zkrácení doby vedení explantátů ve specifikovaných podmínkách in vitro o cca 50% oproti původním postupům (zejména termoterapie v kombinaci s kulturou vrcholových meristémů). Kalkulované náklady na ozdravování lze tak snížit v rozsahu odpovídajícímu zkrácení doby vedení a pasážování v podmínkách in vitro. Vzhledem k tomu, že nová metodika povede ke zkrácení postupu ozdravování sadby, předpokládá se úspora nákladů ve výši 1 tis. Kč na jeden ozdravovaný genotyp. Další ekonomické přínosy se předpokládají po předání ozdravené sadby odrůdy Kazbek pěstitelům. Jedná se o novou odrůdu, s jejímž pěstováním se začíná. Při roční výměře 2 ha a průměrném výnosu 2t/ha suchého chmele s průměrnou cenou 90 tis. Kč na tunu lze očekávat počáteční tržby u pěstitelů na úrovni 360 tis. Kč, což za 10 let užívání porostu v chmelnici představuje přínos 3 600 tis Kč. VI. Seznam použité související literatury Blattný, C., Osvald, V., 1950: Jen zdravý a jakostní chmel. Praha nakl. Brázda, 366 s. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., Svoboda P., 2007: Effect of phytohormone composition of nutrient medium on in vitro plant regeneration in hop clones with different sensitivity to indole-3-butyric acid, Advances in Horticultural Science, 21(4), 219-224. Murashige T., Skoog F.A., 1962: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, 473 497. 18

VII. Seznam publikací, které předcházely metodice Komínek, P., Svoboda, P., Ghanem-Sabanadzovic, N, 2003: Improved detection of Arabis mosaic virus in grapevine and hop plants, Acta virologica 47, 199-200. Petrzik, K., Svoboda, P., 1997: Screening of Apple mosaic virus in hop cultivars in the Czech republic by reverse transcription polymerase chain reaction. Acta virologica 41, 1997, 101 103 Svoboda P., 1993: Zjištění přítomnosti carlavirů a ilarvirů u českých odrůd chmele, Ochrana rostlin, 4, 259 264 Svoboda, P. Patzak, J., Matoušek J., 2009: Metodika diagnostiky latentního viroidu chmele HLVd (Hop latent viroid), Metodika pro praxi 04/2009 b, ISBN 978-80-87357-02-6 Svoboda, P., Brynda, M., 2010: Technologie množení chmele. Metodika pro praxi, 6/2010, IBSN 978-80-87357-09-5 Svoboda, P., 2009: Metodika diagnostiky virů chmele a ochrana proti virovým chorobám. Metodika pro praxi 3/2009 a, ISBN 978-80-87357 Svoboda, P., 2003: Ozdravovací proces českého chmele. Mezinárodní vydání Český chmel 2003 Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2007: Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 247-250. Zámečník J., Bilavčík A., Faltus M., 2007: Metody dehydratace vzrostných vrcholů pro kryoprezervaci vegetativně množených plodin, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 573-576. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2006: Conservation of biodiversity of vegetative propagated crops by cryopreservation methods, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 493-495. VIII. Dedikace Metodika je výstupem řešení výzkumného projektu NAZV QH91164 Využití kryoterapie k ozdravení bramboru a chmele od vybraných patogenů. IX. Jména oponentů: Odborný oponent: Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta, Valtická 337, 691 44 Lednice Oponent ze státní správy: Ing. Vladimír Barborka ÚKZÚZ - Sekce rostlinné výroby, Oddělení chmele, Chmelařské náměstí 1612, 438 43 Žatec 19