L 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 7.1.2 Detektor diodového pole Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií: a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s nepřesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává ±2 nm; b) při vlnové délce mezi 225 a 300 nm se nesmí záznam spektra ve zkoušeném vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže odchylka mezi dvěma spektry nikde nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu; c) při vlnové délce mezi 225 a 300 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku. Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena. 7.2 Opakovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 0,5 mg/kg při obsahu halofuginonu do 3 mg/kg. 7.3 Výtěžnost Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 80 %. 8. Výsledky kruhových testů Při kruhových testech ( 1 ) byly osmi laboratořemi zkoušeny tři vzorky. Výsledky Vzorek A (slepý) Vzorek B (mouka) Vzorek C (pelety) po dvou měsících po dvou měsících průměr (mg/kg) ND 2,80 2,42 2,89 2,45 S R (mg/kg) 0,45 0,43 0,40 0,42 CV R (%) 16 18 14 17 Rec. (%) 86 74 88 75 ND = nezjištěno S R = standardní odchylka reprodukovatelnosti CV R = variační koeficient reprodukovatelnosti (%) Rec. = výtěžnost (%). E. STANOVENÍ OBSAHU ROBENIDINU 1,3-bis[(4-chlorobenzyliden) amino]guanidin hydrochlorid 1. Účel a rozsah Tato metoda umožňuje stanovení obsahu robenidinu v krmivech. Mez kvantifikace je 5 mg/kg. ( 1 ) The Analyst 108, 1983, s. 1 252 1 256.
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/81 2. Princip Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi pomocí UV detektoru. 3. Chemikálie 3.1 Methanol. 3.2 Okyselený methanol. Do 500 ml odměrné baňky se odměří 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,18 g/ml), doplní se po značku methanolem (3.1) a promíchá. Tento roztok se připravuje čerstvý před použitím. 3.3 Acetonitril, pro HPLC. 3.4 Molekulární síto. Typ 3A, 8 12 mesh (1,6 2,5 mm perličky krystalického hlinitokřemičitanu, průměr pórů 0,3 mm). 3.5 Oxid hlinitý, kyselý, stupeň aktivity I pro kolonovou chromatografii. 100 g oxidu hlinitého se naváží do vhodné nádoby a přidají se 2,0 ml vody. Zazátkuje se a protřepává přibližně 20 minut. Skladuje se v dobře zazátkované nádobě. 3.6 Dihydrogenfosforečnan draselný, roztok, c = 0,025 mol/l. 3,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá. 3.7 Hydrogenfosforečnan sodný, roztok, c = 0,025 mol/l. 3,55 g bezvodého (nebo 4,45 g dihydrátu, nebo 8,95 g dodekahydrátu) hydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá. 3.8 Mobilní fáze HPLC Smíchá se: 650 ml acetonitrilu (3.3), 250 ml vody (pro HPLC), 50 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (3.6), 50 ml roztoku hydrogenfosforečnanu sodného (3.7). Přefiltruje se filtrem 0,22 μm (4.6) a roztok se odplyní (např. ultrazvukem po dobu 10 minut). 3.9 Standardní látka. Čistý robenidin: 1,3-bis[(4-chlorobenzyliden) amino]guanidin hydrochlorid. 3.9.1 Robenidin, základní standardní roztok: 300 μg/ml Naváží se 30 mg standardní látky robenidinu (3.9) s přesností na 0,1 mg. Rozpustí se v okyseleném methanolu (3.2) ve 100 ml odměrné baňce, doplní se po značku týmž rozpouštědlem a promíchá se. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.
L 54/82 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 3.9.2 Robenidin, pracovní standardní roztok: 12 μg/ml Odměří se 10,0 ml základního standardního roztoku (3.9.1) do 250 ml odměrné baňky, doplní se po značku mobilní fází (3.8) a promíchá. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě. 3.9.3 Kalibrační roztoky Do sady 50 ml odměrných baněk se odměří 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 a 25,0 ml pracovního standardního roztoku (3.9.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 a 6,0 μg/ml robenidinu. Tyto roztoky se připravují čerstvé před použitím. 3.10 Voda, pro HPLC. 4. Přístroje a pomůcky 4.1 Skleněná kolona. Vyrobená z tmavého skla, vybavená uzavíracím kohoutem a nádržkou o obsahu přibližně 150 ml. Vnitřní průměr 10 15 mm, délka 250 mm. 4.2 Mechanická třepačka nebo magnetické míchadlo. 4.3 Rotační odparka. 4.4 Zařízení na vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) vybavené ultrafialovým detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou nebo detektorem diodového pole, pracujícím v pásmu 250 400 nm. 4.4.1 Kolona pro kapalinovou chromatografii: 300 mm 4 mm, C 18, náplň 10 μm nebo obdobná. 4.5 Filtr ze skleněných vláken (Whatman GF/A nebo podobný). 4.6 Membránové filtry, 0,22 μm. 4.7 Membránové filtry, 0,45 μm. 5. Postup Poznámka: Robenidin je citlivý na světlo. Proto se při všech operacích použije vždy tmavé sklo. 5.1 Obecné pokyny 5.1.1 Provede se zkouška slepého vzorku krmiva pro kontrolu, zda neobsahuje robenidin ani jiné rušivé látky. 5.1.2 Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva (5.1.1), do kterého bylo přidáno stejné množství robenidinu, jako je ve vzorku. K dosažení obsahu 60 mg/kg se do 250 ml kónické baňky přidají 3,0 ml základního standardního roztoku (3.9.1). Roztok se odpaří asi na objem 0,5 ml v proudu dusíku. Přidá se 15 g slepého vzorku krmiva, promíchá se a po deseti minutách se může začít s extrakcí (5.2). Poznámka: Pro účely této metody je slepý vzorek krmiva podobného druhu jako vzorek a při zkoušce není zjištěn robenidin. 5.2 Extrakce Do 250 ml kónické baňky se naváží přibližně 15 g upraveného vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (3.2), zazátkuje a hodinu třepe na třepačce (4.2). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.5) a celý objem filtrátu se jímá do 150 ml kónické baňky. Přidá se 7,5 g molekulárního síta (3.4), zazátkuje a pět minut se třepe. Potom se ihned přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken. Tento roztok se použije k čištění (5.3).
26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/83 5.3 Čištění 5.3.1 Příprava kolony s oxidem hlinitým Do spodního konce skleněné kolony (4.1) se vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se skleněnou tyčinkou. Naváží se 11,0 g připraveného kysličníku hlinitého (3.5) a nasype se do kolony, pokud možno s minimální časovou prodlevou v okolním prostředí. Oxid hlinitý se v naplněné koloně setřese lehkým poklepem na dolní konec kolony. 5.3.2 Čištění vzorku Na kolonu se napipetuje 5,0 ml upraveného extraktu vzorku (5.2). Špička pipety se opře o stěnu kolony a roztok se nechá absorbovat oxidem hlinitým. Robenidin se z kolony eluuje pomocí 100 ml methanolu (3.1) při rychlosti průtoku 2 3 ml za minutu a eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem. Methanolový roztok se za redukovaného tlaku a při teplotě 40 o C odpaří do sucha v rotační odparce (4.3). Odparek se znovu rozpustí ve 3 4 ml mobilní fáze (3.8) a kvantitativně se převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka se několikrát vypláchne 1 2 ml mobilní fáze a tyto roztoky se přidají do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku týmž rozpouštědlem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes 0,45 μm membránový filtr (4.7). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (5.4). 5.4 Stanovení HPLC 5.4.1 Parametry Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky. Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.4.1) Mobilní fáze HPLC (3.8) Průtok: 1,5 2 ml/min Vlnová délka detektoru: 317 nm Objem nástřiku: 20 50 μl Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.9.3), který obsahuje 3,6 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů. 5.4.2 Kalibrační křivka Pro každý kalibrační roztok (3.9.3) se provede několik nástřiků a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml. 5.4.3 Roztok vzorku Opakovaně se nastříkne stejný objem extraktu vzorku (5.3.2) jako při kalibraci a určí se průměrná hodnota výšky (plochy) píků robenidinu. 6. Výpočet a vyjádření výsledků Z průměrných hodnot výšky (plochy) robenidinových píků v roztoku vzorku se určí koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.4.2). Obsah robenidinu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce: c 200 w = m kde: c = koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml m = hmotnost navážky vzorku v gramech.
L 54/84 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 7. Ověření výsledků 7.1 Identita Identitu analytů lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem anebo využitím detektoru diodového pole, který umožňuje porovnání spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (3.9.3) obsahujícího 6 μg/ml robenidinu. 7.1.1 Opakované stanovení s přídavkem (co-chromatography) K extraktu vzorku se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.9.3). Množství přidaného robenidinu musí odpovídat předpokládanému obsahu robenidinu v extraktu vzorku. Přídavek se projeví pouze zvýšením píku robenidinu, a to úměrně k přidanému množství a ředění. Šířka píku v polovině jeho maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ±10 %. 7.1.2 Detektor diodového pole Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií: a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s nepřesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává ±2 nm; b) při vlnové délce mezi 220 a 400 nm se nesmí záznam spektra ve zkoušeném vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže odchylka mezi dvěma spektry nikde nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu; c) při vlnové délce mezi 220 a 400 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku. Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena. 7.2 Opakovatelnost 7.3 Výtěžnost Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout 10 % z hodnoty nejvyššího výsledku při obsahu robenidinu nad 15 mg/kg. Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 85 %. 8. Výsledky kruhových testů Byl proveden kruhový test ES, ve kterém dvanáct laboratoří analyzovalo čtyři vzorky krmiv pro drůbež a králíky, sypkých nebo peletovaných. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: Drůbež Králíci Sypké krmivo Pelety Sypké krmivo Pelety průměr (mg/kg) 27,00 27,99 43,6 40,1 s r (mg/kg) 1,46 1,26 1,44 1,66 CV r (%) 5,4 4,5 3,3 4,1 S R (mg/kg) 4,36 3,36 4,61 3,91 CV R (%) 16,1 12,0 10,6 9,7 Výtěžnost (%) 90,0 93,3 87,2 80,2 s r = standardní odchylka opakovatelnosti CV r = variační koeficient opakovatelnosti v % S R = standardní odchylka reprodukovatelnosti CV R = variační koeficient reprodukovatelnosti v %.