Biologie 4, 2014/2015, I. Literák pralesnička drobná Dendrobates pumilio Kostarika, 2004 GEN PROTEIN
>10 LET JE ZNÁM LIDSKÝ GENOM 2000 Bill Clinton, Tony Blair: ukončení hrubého sekvenování lidského genomu (= známo pořadí nukleotidů 83 % lidského genomu) 2003 (Nature, 2004): dokončení kompletního genomu 2010 známo pořadí 93 % nukleotidů, 100 % kódujících oblastí, odolávají některé repetitivní sekvence, centromery, telomery geny kódující proteiny 20 000 geny kódující RNA několik (málo) tisíc? počtu modifikací jednotlivých genů (alternativní sestřih) 2 lidé sdílejí 99,5 % genetické informace, 0,5 % se liší Project ENCODE: do RNA se přepisuje i cca 75 % negenové DNA (!), hlavně regulační oblasti před ale i za (!) genem a z obou (!) řetězců DNA Jen u několika lidí je známá kompletní sekvence celého genomu (např. u J.D. Watsona spoluobjevitele struktury DNA)
PAMĚŤOVÝ SYSTÉM BUŇKY BUNĚČNÁ PAMĚŤ PAMĚŤ - zaznamenání, uchování a předání informace (kniha, flash disk, DNA, lidský mozek) DĚDIČNOST = schopnost předávat soubor informací ve sledu po sobě jdoucích generací (buněk, mnohobuněčných organismů) BUNĚČNÁ PAMĚŤ (vnitřní paměť buňky) - zpracovává informaci pro - udržování buňky (struktura a funkce) - reprodukci - u jednobuněčných - u mnohobuněčných + informace o vývoji, funkci a chování celého jedince
NUTNÉ VLASTNOSTI BUNĚČNÉ PAMĚTI 1. velká kapacita 2. dlouhodobost 3. stabilita 4. snadná dostupnost a transformovatelnost do konkrétní vlastnosti buňky 5. zdvojitelnost (pro 2 dceřiné buňky) 6. schopnost doplňování (evoluce) TYPY - informace genová (genetická) nesená genofory hlavní médium... NK exprese genetické informace = kódování, vyzvedávání a vyjadřování (exprimace) do konkrétních vlastností - informace negenová (epigenetická) - část vnitřní informace buňky zprostředkovaná jinak ovlivňuje vyjádření genů (metylace DNA, acetylace histonů, sbalování chromatinu) UNIVERZÁLNOST GENETICKÉ INFORMACE každá genetická informace je zapsána v primární struktuře NK - DNA (většinou), RNA (RNA viry)
GEN MENDEL (1865) - diskrétní elementy odpovědné za vytvoření znaků JOHANSSEN (1909) - gen = jednotka dědičnosti MORGAN (1911) - geny jsou lokalizovány na lokusech chromozomů BEAGLE, TATUM (1941) - jeden gen - jeden protein (enzym) WATSON, CRICK (1953) - gen je část molekuly DNA kódující jeden protein GEN = úsek polynukleotidového řetězce obsahující genetickou informaci pro strukturu polypeptidu jako translačního produktu (gen strukturní) nebo informaci pro strukturu RNA, která nepodléhá translaci (geny pro rrna a trna) GENY STRUKTURNÍ: informace o primární struktuře polypeptidu (bílkovině strukturní, enzymové, signální) - složené: z exonů (kódující sekvence genů) z intronů (nekódující sekvence genů) primární transkript podléhá posttranskripčnímu sestřihu mrna, která se na ribosomu překládá do molekuly polypeptidu (eukaryota) -jednoduché: přepisují se celé bez sestřihu (prokaryota) GENY PRO RNA: (rrna, trna, )
NEGENOVÁ DNA: REGULAČNÍ OBLASTI (regulační sekvence) - úseky molekuly NK, které nesou informaci pro navázání specifických proteinů např. signalizace zahájení nebo ukončení transkripce (na DNA) TRANSPOZONY, RETROELEMENTY = endogenní retroviry, SINE, LINE, u člověka 42 % DNA, REPETITIVNÍ DNA (mikrosatelity, minisatelity) PROKARYOTA - jen malá část DNA je negenová EUKARYOTA - větší část DNA je negenová (u savců 90 %) GENOM soubor všech molekul DNA v buňce (genová i negenová DNA) GENOFORY: CHROMOZOMY PLAZMIDY
Některé známé kompletní GENOMY ORGANISMUS POČET BAZÍ (Mb) POČET GENŮ bakteriofág X174 (1977) 5386 b ssdna 10 FPV (fowlpoxvirus) (2000) 0.288 dsdna min. 65 Haemophilus influenzae (1995) 4.6 1 743 Mycoplasma genitalium 0.58 516 Escherichia coli 4.6 2 350 Saccharomyces cerevisiae 13 6 420 Arabidopsis thaliana 100 25 498 Caenorhabditis elegans 100 19 099 Drosophila melanogaster 180 13 601 Homo sapiens 3 000 20 000 Triticum aestivum 17 000 (120-160 000)
EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE F. CRICK: DNA RNA PROTEIN CENTRÁLNÍ DOGMA MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 1. stupeň DNA RNA TRANSKRIPCE - na základě komplementarity bazí vznikají RNA kopie (transkripty) - postranskripční úprava 2. stupeň RNA PROTEIN TRANSLACE - nukleotidy AK - postranslační úprava přesná regulace (!!!): KVALITATIVNÍ KVANTITATIVNÍ ČASOVÁ
Od DNA k proteinu Espero Publishing, s.r.o.
TRANSKRIPCE transkripční jednotka = definovaný úsek DNA pro transkripci složení: - promotor - sekvence DNA (40 bp) pro navázání RNA-polymerázy (prostřednictvím proteinu sigma faktor) - sekvence strukturního genu (strukturních genů) - terminátor 1. INICIACE - po navázání RNA-polymerázy na promotor se rozvinou oba řetězce DNA - od místa startu (1. přístupného nukleotidu) na matricovém vláknu se přiřazují RNA nukleotidy, začíná syntéza RNA - po dosažení délky 9 nukleotidů se odštěpuje sigma faktor prokaryota eukaryota RNA-polymeráza vazby RNA-polymerázy na promotor Bacteria - 1 typ Archea - mnoho typů prostá 3 typy (I, II, III) vyžaduje transkripční faktory TF (regulační proteiny TFIID, TFIIB se váží na TATA box součást promotoru s 25 bp)
2. ELONGACE - RNA-polymeráza se posunuje podél molekuly DNA - vzniká vlákno RNA v orientaci 5 3 3. TERMINACE terminátor - sekvence DNA, po jejíž transkripci se RNA zdvojí (zdvojení je signál pro oddělení RNA polymerázy od DNA) jiná možnost terminace - vazba rho faktoru (specifický protein) na molekulu RNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE... RNA DNA pomocí reverzní transkriptázy (RNA- závislé DNA-polymerázy) u retrovirů
DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou
směry transkripce genů v krátkém úseku bakteriálního chromosomu
POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVA RNA (RNA PROCESSING) mrna prokaryota - přímo translace eukaryota: pre-mrna (hnrna heterologní nukleární RNA) mrna 1. navázání 7-metylguanozinu na 5 konec (vznik tzv. čepičky) 2. polyadenylace (připojení 100-200 adenosinnukleotidů) na 3 konec (vznik tzv. polya přívěsku) důvody 1. a 2.: - ochrana před účinkem nukleáz - nutné pro rozpoznání ribozomem - umožňuje přechod z jádra do cytoplazmy 3. splicing ponechání exonů (kódujících sekvencí k exprimování) průměrný gen má asi 1000 nukleotidů vystřižení intronů (často delších než exony) [ ribozym endonukleáza P] 4. RNA silencing (RNAi, sirna, mirna)
rrna syntéza v jadérku 70-80 % RNA pre-rrna rrna prokaryonta - 3 druhy rrna (pro ribosomální podjednotky) eukaryonta - 4 druhy rrna (pro ribosomální podjednotky) trna syntéza v jadérku pre-trna trna 1. odstranění zaváděcí sekvence 2. chemické modifikace (metylace) bazí 3. vystřižení intronů 4. přidání trojice nukleotidů CCA (u všech funkčních molekul trna)
TRANSLACE (PROTEOSYNTÉZA) = překlad z jazyka nukleotidů (4-písmenná abeceda) do jazyka AK (21-písmenná abeceda) - v cytoplazmě, - na ribosomech GENETICKÝ KÓD 1966 - Nirenberg, Khoran, Ochoa (1968 - Nobelova cena) kombinace tří nukleotidů kóduje 1 AK 64 variant (61 je využito pro AK) tripletový kód triplet nukleotidů v mrna... kodon (5 3 ) genetický kód je univerzální (stejný u všech organismů) je nepřekryvný (5 3 ) je degenerovaný, redundantní
Degenerovaný genetický kód Genetický kód je degenerovaný, resp. redundantní, což znamená, že dva či více kodónů může kódovat jednu a tutéž aminokyselinu. Degenerované kodóny se obvykle liší ve své třetí pozici, viz kodony GAA a GAG, které oba kódují glutamin. Tato degenerace genetického kódu umožňuje existenci tzv. tichých mutací. Degenerovanost genetického kódu a z ní plynoucí existence tichých mutací značně zvyšuje toleranci substitučních mutací v degenerovaných kodonech. Např. kodony kódující alanin (GCG, GCA, GCU, GCC) mohou po libosti mutovat na své třetí pozici, aniž by došlo k záměně aminokyseliny, kterou kódují. Naproti tomu aminokyselina histidin je kódována pouze dvěma kodony, takže bez změny aminokyseliny je pouze jedna z možných tří mutací na třetí pozici.
PROTEOSYNTETICKÝ APARÁT mrna ribosomy - místa syntézy proteinů trna - řadí AK podle tripletů volné AK ATP, GTP (zdroje energie) řada enzymů a tzv. pomocných faktorů mrna prokaryota - nese informaci pro několik polypeptidů (polycistronická RNA) operon = skupina genů přepisovaných do 1 molekuly RNA eukaryota - nese informaci 1 genu
RIBOSOMY tělíska z rrna a bílkoviny (1:1) v cytoplazmě prokaryotních i eukaryotních buněk v matrix mitochondrií a stromatu chloroplastů - volné - vázané na membrány (ER, vnější membrána jaderného obalu) v buňce 10 4-10 5 ribosomů velikost ribozomů v Svedbergových sedimentačních jednotkách prokaryota (+ mitochondrie a chloroplasty) Celý ribosom 70 80 Větší podjednotka 50 60 Menší podjednotka 30 40 eukaryota 4 specifická vazebná místa: - místo pro vazbu mrna - A (aminoacyl) místo vazba trna s AK (aminoacyl-trna) - P (peptidyl) místo (vazba peptidyl-trna) - E (exit) místo (místo, kde t-rna opouští ribosom) polysom - řetízek ribosomů, na nichž probíhá translace proteinů (prokaryota i eukaryota)
komponenty eukaryontního ribosomu
RIBOZOMY VELIKOST VE SVEDBERGOVÝCH SEDIMENTAČNÍCH JEDNOTKÁCH S celý ribozom LSU rdna SSU rdna EUKARYOTA 80 60 28 5.8 5 40 18 PROKARYOTA 70 50 23 5 30 16 CHLOROPLASTY 70 50 23 5 4.5 30 16 MITOCHONDRIE 60 45 16 35 12
vazebná místa pro RNA na ribosomu
polyribosom
trna rameno antikodonové rameno aminokyselinové vazbu trna a AK zajištuje specifická aminoacyl-trna-syntetáza 20 syntetáz pro 20 AK (21. AK selenocystein vzniká kotranslační modifikací až po navázání AK na trna) energie uvolněná rozštěpením této vazby se použije k tvorbě peptidové vazby nového polypeptidu Izoakceptorové t-rna - stejná AK/jiný antikodon
PRŮBĚH TRANSLACE 1. INICIACE - připojení iniciačních faktorů na menší podjednotku ribosomu - vazba iniciační trna (trna f-met formylmethionin -eubakterie, trnamet methionin archea, eukaryota) na menší podjednotku ribosomu - vazba mrna na menší podjednotku ribosomu - připojení větší podjednotky ribosomu tj. vznik translačního komplexu energie z GTP (GTP GDP) 2. ELONGACE - na startovací kodon mrna se váže antikodon trna a další trna (A místo P místo E místo, tzv. translokace) nutné elongační faktory (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) + energie z GTP spojování AK je katalyzováno peptidyltransferázovou aktivitou 23S rrna (RNA s enzymovou aktivitou, ribozym)
3. TERMINACE - elongace končí dosažením stop kodonu: UAA, UAG, UGA stop kodony - nejsou rozeznávány trna - jsou rozeznávány proteiny (uvolňovací faktory, terminační faktory), které se na tyto stop kodony váží - oddělení polypeptidu - rozpad translačního komplexu
POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE PROTEINŮ k zajištění biologické funkčnosti polypeptidů postranslační modifikace kotranslační (začínající již během translace) modifikace - deformylace (odstranění formylové skupiny z methioninu) - odštěpení AK - vyštěpení peptidů - chemické modifikace AK (metylace, fosforylace) - tvorba disulfidových můstků - připojení cukerných zbytků (glykoproteiny) - odstranění signálních sekvencí řada postranslačních modifikací se uskutečňuje specifickými enzymy (peptidázy, deformylázy,...) tj. produkty jiných strukturních genů vznik SEK., TERC. a KVART. STRUKTURY - spontánně - asistovanou autoagregací pomocí chaperonových proteinů (chaperonů), které se vážou na některé funkční skupiny vznikajících proteinů a nedovolí vznik nežádoucích vazeb (např. HSP heat shock proteins)
REGULACE GENOVÉ EXPRESE důvody pro regulaci genové exprese genové produkty - proteiny - jsou pro buňku potřebné: - v určité koncentraci - v určitém čase - na určitém místě A. PROKARYOTA B. EUKARYOTA
A. PROKARYOTA GENY KONSTITUTIVNÍ - produkce konstitutivních (trvale potřebných) proteinů - bez regulace GENY ADAPTIVNÍ - produkce adaptivních proteinů regulace na úrovni transkripce (geny zapínány a vypínány) katabolické enzymy - indukce substrátem anabolické enzymy - represe konečným produktem OPERONOVÉ GENY- skupina genů řízených promotorem a operátorem operátor je sekvence nukleotidů, na kterou se váže represor (protein kódovaný regulačním genem) tj. alosterický protein represor zastavuje transkripci genu, po jeho uvolnění transkripce probíhá Nedávné objevy: mrna může vázat různé nízkomolekulární látky (aptamerová funkce) a regulavat genovou expresi - s ribozymovým zprostředkovatelem (regulace enzymovou aktivitou ribozymu - bez ribozymového zprostředkovatele (regulace změnou konformace mrna)
B. EUKARYOTA mnohem složitější regulační mechanismy na více úrovních 1. regulace na úrovni genomu - dekondenzace a kondenzace chromozomů EPIGENETICKÁ - acetylace (a deacetylace) histonů AKTIVACE - metylace (a demetylace) DNA (geny s metylovanými nukleotidy nejsou transkribovány) INHIBICE - přestavba genomu pomocí transpozonů (zkopírování určitých sekvencí a jejich včlenění do určitých lokusů, např. spuštění odlišných diferenciačních programů u kvasinek) - amplifikace určitých úseků genomu - genově specifické regulátory diferencující mezi transkripcí a replikací 2. regulace na úrovni transkripce - působení transkripčních faktorů: TFIID, TFIIB (vazba na promotorové části sekvence inr, TATA box) zesilovače transkripce - enhancery tlumiče transkripce - silencery
Regulace prostřednictvím RNA (RNAi, sirna, mirna) RNA SILENCING 90. léta 20. st. shutting down genes (= SILENCERs) = tlumicí postranskripční geny (PTGS) houby, rostliny, živočichové RNAi RNA interference = proces sekvenčně specifického umlčování genů pomocí homologní dsrna (nekódující úseky z 21-23 nukleotidů) sirna (short interferring RNA) - malé interferující duplexy uplatňují se v obranném procesu proti transkripci cizorodé RNA (evolučně starobylý obranný mechanismus proti virům a transpozonům) mirna (microrna) uplatňují se v regulaci běžné genové výbavy buňky (platí odhadem pro 1/3 lidských genů)
NEDÁVNÉ OBJEVY další krátké RNA pirna (Piwi-interacting RNA) snorna (small nucleolar RNA) dlouhé nekódující RNA lncrna (long non-coding RNA, 200 nukleotidů) (u savců desítky až tisíce,? funkce) cirkulární cirkulární RNA (mir-7) váže na sebe mirna, sirna (má regulační a ochrannou funkci)
EFEKT: degradace mrna, tj. ukončení genové aktivity knockdown efekt obvykle: ds DNA ss mrna translace s si(mi)rna: ds DNA ss mrna + komplementární si(mi)rna s nukleázou (RISC komplex) degradace mrna blokace translace výhledově velké terapeutické využití: ovlivnění genetických chorob, kontrola virových infekcí: specifická dsrna se dá se vyrobit in vitro a použít in vivo 2004 - poprvé využití v PRAXI: spinocerebelární ataxie myší je vyvolávaná toxinem produkovaným mutovanou alelou genu SCA1, nemocná myš byla vyléčena umlčením mutovaného genu po podání specifické sirna
RNA - SILENCING dsrna DICER = specifická RNA endonukleáza sirna RISC (RNA-induced silencing complex) = sirna + endonukleáza RISC degraduje mrna
3. regulace na úrovni postranskripčních modifikací - alternativní sestřih RNA (např. produkce IgM) 4. regulace na úrovni translokace - přechod mrna z jádra do cytoplazmy 5. regulace na úrovni translace - působení iniciačních translačních faktorů 6. postranslační regulace - modulace chemické modifikace proteinů - modulace proteolýzy PROTEASOMY - komplexy proteáz, které degradují bílkoviny (s pomocí ATP jako zdroje energie) molekulární značka - rozeznávající komplex specifických enzymů připojí k bílkovině v místě lyzinu malý protein - ubikvitin (terč pro proteasomy)
UBIKVITINACE proces degradace nepotřebných, nadbytečných, poškozených bílkovin v buňce princip: na bílkovinu, která má být zničena, jsou navázány min. 4 molekuly UBIKVITINU a tím je cílová bílkovina předurčena k likvidaci v PROTEASOMU - probíhá aktivně (za spotřeby ATP), rychle, účinně a regulovaně UBIKVITIN je aktivován enzymem E1(UBA, ubikvitin aktivující) AKTIVOVANÝ UBIKVITIN je připojen enzymem E2 (UBC, ubikvitin konjugující) na cílovou bílkovinu enzym E3 (ubikvitin-ligáza) připojí min. další 3 ubikvitiny E1 1 typ E2 10 typů Degradace bílkoviny v PROTEAZOMU: - proteázy odštěpí ubikvitiny pro další použití - proteázy štěpí bílkoviny na krátké úseky AK pro další použití E3 stovky typů zajišťují specifitu PROTEASOMY u všech organismů UBIKVITINACE jen u eukaryot Existují další malé proteiny (např. SUMO proteiny) ovlivňující aktivitu cílových bílkovin (nezpůsobují ale degradaci), někdy soutěží o vazebná místa pro ubikvitin.
INHIBITORY PROTEAZOMU objeveny v 90. létech 20. st. různá struktura, síla účinku a specifita (hl. přes inhibici nukleárního faktoru kappa B) potenciální využití v medicíně: - léčba nádorů (potlačit růst nádorů, neničit zdravé buňky) - regulace zánětlivých procesů - léčba negativní proteinové bilance (průvodní jev řady patologických stavů) KONTROLA SPRÁVNÉHO OZNAČENÍ při nesprávném označení se mohou uplatnit DUB deubikvitinizující enzymy (uchrání protein před destrukcí)
TRANSKRIPTOSOM multienzymový komplex zajišťující transkripci SPLICEOSOM multienzymový komplex zajišťující posttranskripční sestřih snrnp small nuclear ribonucleoprotein particles umožňují vystřižení intronu = ribozymová ribonukleáza P PROCESOM komplex v jádře zajišťující vyzrávání rrna
Geny mohou být exprimovány s různou účinností Espero Publishing, s.r.o.
Bakteriální a eukaryontní gen Espero Publishing, s.r.o.
Struktura dvou lidských genů ukazující uspořádání exonů a intronů Espero Publishing, s.r.o.
Alternativní sestřih α-tropomyosinového genu u krys
Souhrn procesů vedoucích od genu k proteinu Espero Publishing, s.r.o.