MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta Transfuze a těhotenství v anamnéze dárců a dárkyň krve Bakalářská práce obor Zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Hana Lejdarová Autor: Pavla Hanušovská Brno, 2013
Jméno a příjmení autora: Pavla Hanušovská Název bakalářské práce: Transfuze a těhotenství v anamnéze dárců a dárkyň krve Pracoviště: Transfuzní a tkáňové oddělení, Fakultní nemocnice Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Hana Lejdarová Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Předmětem bakalářské práce je popsat výskyt imunizačních podnětů ve sledovaném vzorku populace dárců krve. Konkrétně práce zkoumá výskyt transfuze a těhotenství v anamnéze dárců a dárkyň krve na TTO FN Brno. Při podání transfuze mohou protilátky dárce u příjemce vyvolat nežádoucí potransfuzní reakci. Hledáním souvislostí mezi výsledkem podání transfuze a informacemi o dárci se zabývá hemovigilance. Praktická část se opírá o studii provedenou na dárcích krve podrobenou statistické analýze. Statistické metody čerpají vstupní data z informací od dárců z vyplněných anonymních dotazníků. Byl sestaven dotazník, který zodpovědělo 1000 respondentů. Dárcům účastnícím se této studie byly položeny 3 otázky zaměřené na imunizační podněty v anamnéze dárců. Klíčová slova: krev, krevní skupiny, imunologie krevních elementů, potransfuzní reakce, hemovigilance Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně, pod vedením MUDr. Hany Lejdarové a uvedla v seznamu použité literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne... (Pavla Hanušovská)
Ráda bych poděkovala MUDr. Haně Lejdarové za odborné vedení, cenné rady a připomínky, trpělivost, vstřícný přístup a čas, který mi věnovala při zpracování bakalářské práce.
Seznam použitých zkratek: AHR Akutní hemolytická reakce β 2 m β 2 -mikroglobuliny C 2 Složka komplementu C 4 Složka komplementu ČR Česká republika DNA Deoxyribonukleová kyselina EHN European haemovigilance network ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FN Fakultní nemocnice FNHTR Febrilní nehemolytická transfuzní reakce GAT Granulocytový aglutinační test GIFT Granulocytový imunofluorescenční test IgA Imunoglobin třídy A IgG Imunoglobin třídy G IgM Imunoglobin třídy M HIV- Human immunodeficiency virus HLA Human leukocyte antigens HMA Human monocyte antigens HNA Human neutrofile antigens HPA Human platelet antigens LAPS I - Leukocyte Antibody Prevalence Study LCT Lymfocytotoxický test MAIGA Monoclonal antibody-specific imobilization of granulocyte antigen MAIPA Monoclonal antibody-specific imobilization of plateles antigen MHC Major histocompatibility komplex PCR Polymerázová řetězová reakce PCR-SSP Polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými primery PCR-SSO - Polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými oligosacharidy PTP Potransfuzní trombocytární purpura SÚKL Státní ústav pro kontrolu léčiv TA-GvHD S transfuzí asociovaná reakce štěpu proti hostiteli TNF Tumor nekrosis faktor
TRALI Transfusion related acuted lung injury TSE Spongiformní encefalopatie TTO Transfuzní a tkáňové oddělení TTP Trombotická trombocytopenická purpura
Obsah 1 ÚVOD...- 9-2 KREV...- 10-2.1 Obecné vlastnosti...- 10-2.2 Funkce krve...- 10-2.3 Složení krve...- 11-2.3.1 Krevní plazma...- 11-2.3.2 Erytrocyty (Červené krvinky)...- 12-2.3.3 Leukocyty (Bílé krvinky)...- 13-2.3.4 Trombocyty (Krevní destičky)...- 14-3 KREVNÍ SKUPINY...- 15-3.1 AB0 systém...- 15-3.2 Rh systém...- 16-3.3 Ostatní systémy krevních skupin...- 18-3.4 Význam krevních skupin pro transfuzi...- 18-4 IMUNOLOGIE KREVNÍCH ELEMENTŮ...- 19-4.1 Antigeny krevních skupin...- 19-4.1.1 Antigeny AB0 systému...- 19-4.2 Protilátky proti antigenům krevních skupin protilátky...- 20-4.3 HLA systém = Human leukocyte antigens... - 21-4.3.1 HLA antigeny I. třídy...- 22-4.3.2 HLA antigeny II. třídy...- 23-4.3.3 HLA antigeny III. třídy...- 23-4.4 Imunologie leukocytů...- 24-4.4.1 Imunologie HNA = Human neutrofile antigens...- 25-4.4.2 Imunologie HMA = Human monocyte antigens...- 27-4.5 Imunologie trombocytů...- 28 -
5 POTRASFUZNÍ REAKCE...- 30-5.1 Akutní hemolytická reakce...- 32-5.2 Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce...- 33-5.3 Alergická potransfuzní reakce...- 33-5.4 Anafylaktická potransfuzní reakce...- 33-5.5 Transfusion related acuted lung injury (TRALI)...- 34-5.6 Hypotermie...- 36-5.7 Hyperkalemie...- 36-5.8 Citrátová toxicita...- 36-5.9 Pozdní hemolytická reakce...- 36-5.10 Postransfuzní trombocytární purpura...- 37-5.11 S transfuzí asociovaná reakce štěpu proti hostiteli (TA-GvHD)...- 38-5.12 Aloimunizace proti antigenům krevních buněk či plazmatických bílkovin...- 38-6 PODMÍNKY DÁRCOVSTVÍ KRVE...- 39-6.1 Kritéria pro výběr dárců...- 39-6.2 Frekvence odběru a maximální odebrané množství...- 39-6.3 Kritéria pro vyloučení dárců krve a jejich složek...- 40-6.3.1 Kritéria pro trvalé vyloučení dárců alogenních odběrů...- 40-6.3.2 Kritéria pro dočasné vyloučení dárce...- 42-6.3.3 Další důvody pro dočasné vyloučení dárce...- 44-7 HEMOVIGILANCE...- 45-8 PRAKTICKÁ ČÁST...- 47-9 ZÁVĚR...- 62-10 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ...- 63 -
1 ÚVOD Bakalářská práce se zabývá zmapováním výskytu transfuze a těhotenství v anamnéze dárců a dárkyň krve. Dárci s transfuzí v anamnéze a dárkyně s vícečetným těhotenstvím s sebou nesou potencionálně vyšší riziko imunizace krve ve srovnání s dárci bez těchto predispozic. Výše zmíněna riziková skupina dárců si může tvořit anti-hla protilátky, antileukocytární nebo antitrombocytární protilátky. Podáním jejich krve vzniká riziko vzniku potransfuzní reakce u příjemce. Bezpečnou hemoterapii zajišťuje systém hemovigilance. Teoretická část je rozdělena do 6 kapitol. V kapitole o krvi jsou objasněny obecné vlastnosti, funkce a složení krve. Další kapitola se věnuje krevním skupinám a jejich významu pro transfuzi, především AB0 a Rh systému. Čtvrtá kapitola vysvětluje problematiku imunologie krevních elementů. V tomto oddíle je popsána imunologie leukocytů, především HLA systému, imunologie neutrofilů, monocytů a krevních destiček a možnosti jejich vyšetření. Pátá kapitola se zabývá potransfuzními reakcemi, jejich důvod vzniku, klinickými projevy a možnostmi prevence. Šestá kapitola představuje kritéria dárcovství krve. Poslední část popisuje systém hemovigilance. Praktická část se opírá o dotazníkovou studii, která byla provedena na TTO FN Brno během ledna - února 2013. Pro dárce byl sestaven srozumitelný dotazník, který zahrnoval 3 otázky a byl rozdán anonymně 1000 dárcům. Získaná data byla staticky zpracována. Byl vyhodnocen poměr mužů a žen a výskyt jednotlivých imunizačních podnětů u dárců. Výsledky zodpověděly i otázku výskytu transfuze v anamnéze dárců. Při analýze dat u dárkyň byl statisticky zhodnocen výskyt gravidity v anamnéze, počet těhotenství a doby, za jakou se dárkyně po posledním těhotenství vracejí k darování krve. Výsledky dotazníkové studie statisticky zhodnotily aktuální situaci v lednu - únoru roku 2013 na TTO ve FN Brno a případně určily možná bezpečnostní opatření. - 9 -
2 KREV 2.1 Obecné vlastnosti Krev je vysoce vyvinutá a specializovaná tekutá tkáň tvořená formovanými krevními elementy (buněčná část) a prostředím, které umožňuje pohyb těchto buněk plazmou (tekutá část). Svým složením a funkcemi představuje životně důležitou tekutinu, která jako pohyblivé médium spojuje všechny orgány a tkáně v těle a má rozhodující homeostatický význam. Množství krve u dospělého člověka je přibližně 4,5 6,0 litrů krve (Kittnar, 2011; Trojan 2003). Objem krve činí 7 až 10 % celkové tělesné hmotnosti. Ženy mají méně krve ve vztahu k tělesné hmotnosti než muži. Za fyziologických podmínek dochází k mírnému zvětšení objemu krve u lidí, kteří se dlouhodobě pravidelně fyzicky namáhají, u osob žijících dlouhou dobu ve větší nadmořské výšce a u žen v druhé polovině těhotenství. Krev se ustavičně obnovuje, obnovují se všechny její pravidelné komponenty, avšak ne stejnou rychlostí. Např. celkové množství červených krvinek se obnoví průměrně 3 krát za rok (Trojan, 2003). 2.2 Funkce krve Základní funkcí krve je transport látek, především dýchacích plynů (kyslíku a oxidu uhličitého), mezi tkáněmi a plícemi. Krev dále přenáší látky důležité pro výživu; tuky, cukry, bílkoviny a různé biokatalyzátory, jako vitamíny a enzymy. Pomocí krve se přenáší rovněž důležité informace v podobě hormonů, které směřují od endokrinních k cílovým buňkám. Krev se podílí i na vylučování některých látek a to především tím, že je transportuje do míst, kde jsou vylučovány (játra, ledviny nebo plíce). Neméně důležitou funkcí krve je udržování acidobazické rovnováhy. Acidobazická rovnováha znamená, že si krev snaží udržet stálou hodnotu ph. Krev má i obrannou funkci, protože v ní kolují látky, které se starají o imunitní funkci krve tzv. gamaglobuliny, protein-c nebo interleukiny a další látky. Krev se podílí i na udržování tělesné teploty neboli termoregulaci (Vácha, 2004; operativa.cz). - 10 -
2.3 Složení krve Krev se skládá z tekuté a buněčné složky. Krevní plazma je tekutá součást krve. Buněčnou složku tvoří erytrocyty (červené krvinky), jejichž hlavní úkol je přenos kyslíku a oxidu uhličitého, leukocyty (bílé krvinky), které se využívají v boji proti infekcím a trombocyty (krevní destičky), které hrají důležitou roli v procesu srážení krve (Trojan, 2003). 2.3.1 Krevní plazma Krevní plazma je nažloutlý, slabě zásaditý roztok bílkovin, elektrolytů a malých organických molekul. Objem plazmy činí u dospělého člověka okolo 5 % tělesné hmotnosti (2,8-3,5 l). Zaujímá přibližně 55 % objemu krve a 25 % objemu extracelulární tekutiny. Látky rozpuštěné v krevní plazmě můžeme rozdělit na organické a anorganické. Krevní plazma obsahuje 91 % vody, 8 % rozpuštěných organických látek (především bílkoviny a glukózu) a zbylé 1 % tvoří rozpuštěné anorganické látky (sodík, draslík, chloridy, železo, jod, měď, atd.). Její ph činí 7,4 ± 0,04. Plazma se jako médium uplatňuje při přenosu výše zmíněných látek a navíc slouží k přenosu malého množství kyslíku a oxidu uhličitého. Krevní plazma funguje jako regulátor acidobazické a osmotické rovnováhy. Obsahuje bílkoviny, které ovlivňují osmotický tlak. V krevní plazmě nalezneme i látky, které se uplatňují při krevním srážení (Trojan, 2003). V plazmě jsou rozpuštěny anorganické látky, přičemž největší zastoupení má kationt sodíku. Sodík je nezbytný pro udržování stálého osmotického tlaku, objemu a ph. Hladina kationtů vápníku je poměrně nízká. Vápník je potřebný pro nervosvalový přenos, stažlivost srdečního svalu a srážení krve a velice výrazně ovlivňuje propustnost buněčných membrán. Draslík je hlavní intracelulární kationt, ale jeho určitá stálá koncentrace v plazmě má velký význam pro řadu enzymů. Dále se v plazmě vyskytuje hořčík, který má tlumivé účinky na nervovou dráždivost a je podstatný pro aktivitu některých enzymů. Součástí plazmy jsou i ionty chloridu, které se podílejí spolu s Na + na udržování osmolarity, stálého objemu a ph. V plazmě nalezne i další látky jako železo, měď a jód. Železo je nutné pro tvorbu hemoglobinu v kostní dřeni. Jód se podílí na tvorbě hormonů štítné žlázy a měď má důležitý význam v krvetvorbě a je součástí některých enzymů (Trojan, 2003; Vácha, 2004). - 11 -
Podstatnou roli ve složení plazmy mají i organické látky. Mezi tyto látky řadíme především bílkoviny, které se podílejí na udržování objemu plazmy, transportu látek, ovlivňují krevní tlak a mají významnou imunitní funkci. Nejvíce zastoupenou bílkovinou v plazmě je albumin, který ovlivňuje onkotický tlak, přenáší mastné kyseliny, bilirubin, léky a působí jako sekundární nosič hemu. Dalšími bílkovinami zastoupenými v krevní plazmě jsou globuliny, které jsou významné svou imunologickou funkcí. Nepostradatelnou bílkovinou krevní plazmy je fibrinogen, který se účastní srážení krve. Ostatní organické látky vyskytující se v krevní plazmě jsou aminokyseliny, močovina, kreatin, kreatinin, amoniak, bilirubin, glukóza, aj. (Trojan, 2003). 2.3.2 Erytrocyty (Červené krvinky) Jedná se o jedny z nejjednodušších, ale zároveň nejspecializovanějších buněk lidského těla. Erytrocyt je bezjaderná buňka, která při svém dozrávání pozbyla i ostatních cytoplazmatických organel. Erytrocyty mají bikonkávní a jedinečný tvar buňky. Velikost erytrocytu je 6,7-7,7 μm. Erytrocyty žijí 120 dní. Vznikají v kostní dřeni a zanikají ve slezině. Muži mají 4,3-5,3 10 12 erytrocytů/l a ženy kolem 3,8-4,8 10 12 erytrocytů/l krve. Červené krvinky obsahují hemoglobin (Trojan, 2003; Penka, Slavíčková, 2011). Hemoglobin (červené barvivo) obsahuje atom Fe 2+, který uskutečňuje vazbu molekul kyslíku. Jedná se o bílkovinu složenou z bílkovinné části (globinu) a hemu. Mnohem pevněji se na hemoglobin váže oxid uhelnatý. V případě navázání většího množství oxidu uhelnatého na hemoglobin dochází u lidí k otravám. Erytrocyty přenáší i oxid uhličitý (karbaminohemoglobin) a účastní se acidobazické rovnováhy (Trojan, 2003). - 12 -
2.3.3 Leukocyty (Bílé krvinky) Představují mobilní jednotky imunitního systému. Leukocyty využívají krev jako transportního média, které je dovede do oblasti jejich potřeby. Podle obsahu zrníček (granul) rozdělujeme bílé krvinky do dvou skupin: granulocyty a agranulocyty. Všechny leukocyty se uplatňují v boji proti infekci. Bílé krvinky vznikají v kostní dřeni nebo v thymu. Za fyziologických podmínek se v krvi vyskytuje 4-9 10 9 leukocytů v litru krve. Počet leukocytů může kolísat. Leukocyty v krvi přežívají různou dobu. Délka života se pohybuje od několika hodin až po 300 dní (Wilhelm, 2010; Trojan, 2003). Mezi granulocytární leukocyty patří neutrofilní segmenty, eozinofilní segmenty a bazofily. Neutrofily jsou velmi pohyblivé a jejich hlavní funkcí je fagocytóza. Považujeme je za nejdůležitější nástroje nespecifického obranného systému. K likvidaci pohlcených látek využívají granul obsažených v jejich cytoplazmě. Eozinofily se projevují při alergických a parazitárních onemocněních. Bazofily uvolňují obsah svých granul v zanícených tkáních nebo se projevují u některého z typů alergické reakce, kde produkují histamin (Penka, Slavíčková, 2011; Trojan, 2003). Lymfocyty patří mezi agranulocyty a najdeme je v krvi, lymfě i lymfatických tkáních. Podle místa vzniku je můžeme rozdělit do dvou skupin. T-lymfocyty, které vznikají v thymu a B-lymfocyty vznikající v kostní dřeni. Jedná se o jediné buňky schopné rozpoznat antigen. Zralé lymfocyty si zachovávají proliferační potenciál. Patří mezi efektorové buňky specifické imunity. Dalším zástupcem agranulocytů jsou monocyty. Monocyty umožňují remodelaci tkání a způsobují destrukci starých nebo poškozených erytrocytů. Buňky, které působí na řadu biologicky aktivních látek - cytokiny, složky komplementu, aj. (Trojan, 2003; Šípek, 2010-2013). - 13 -
2.3.4 Trombocyty (Krevní destičky) Krevní destičky jsou nejmenší formované struktury krve. Trombocyty jsou bezjaderné a bezbarvé buňky s nepravidelným tvarem. Velikost trombocytů je 1 4 μm. Počet destiček činí 150-300 10 9 v litru krve. Jedna třetina destiček se vyskytuje volně nebo ve slezině, zbylé 2/3 cirkulují v krvi. Trombocyty v krvi přežívají asi 9 až 12 dní. Vznikají v kostní dřeni doškrcováním cytoplazmy megakaryocytů. Trombocyty hrají důležitou roli v primární homeostáze (Trojan, 2003; Penka, Slavíčková, 2011). - 14 -
3 KREVNÍ SKUPINY Na povrchu membrán červených krvinek najdeme antigenní znaky, stejně jako u ostatních buněk lidského těla. Tento fakt má zásadní význam pro transfuzi krve i pro transplantace orgánů. Krevní systémy můžeme definovat jako antigenní systémy na membránách erytrocytů. Antigenní struktury na povrchu erytrocytu nazýváme aglutinogeny a protilátky v krevním séru aglutininy. Pojmenování jednotlivých složek vzniklo podle jejich vzájemné reakce. Každý krevní systém může být zastoupen několika skupinami, podle přítomnosti antigenů tohoto systému u daného jedince (Mourek, 2005). 3.1 AB0 systém Roku 1901 byl objeven krevní systém (přesněji krevní skupiny AB0) zásluhou Karla Landsteinera (Karl Landsteiner, 1868 1943 významný rakouský fyzik a biolog, nositel Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství. Později se podílel spolu s Alexandrem Wienerem na objevu Rh systému.) S objevením krevních skupin je spjato i jméno českého vědce Jana Jánského. Jan Jánský jako první zjistil, že člověk má jednu ze 4 krevních skupin, tedy jako první popsal všechny 4 krevní skupiny. Pokusy, které vedly k tomuto objevu, byly provedeny na základě křížení krevních sér. Postupem času došlo k objevení chemického složení AB0 antigenů a způsobů jejich dědičnosti. Antigeny AB0 se staly posléze nejvýznamnějším systémem krevních skupin. Jedná se o jediný systém, u kterého se v séru zdravého jedince nachází protilátky proti antigenu, který chybí na erytrocytech (Šípek, 2010-2013a; McCullough, 2011). Gen pro AB0 systém nalezneme na 9. chromozomu a tvoří ho 3 základní alely: A, B, 0. Alely se mezi sebou navzájem kombinují a dávají tak vznik čtyř primárním fenotypům A, B, 0, AB. Gen 0 se projevuje vůči A, B genům v ustupující formě a vyskytuje se v homozygotní kombinaci, viz tab. 1. (McCullough, 2011; Šípek, 2010-2013a). - 15 -
Tab. 1: Krevní skupiny systému AB0 (Kittnar, 2011) Genotyp Fenotyp Aglutinogen na membráně erytrocytů 00 0 (H) A0 A A AA A A B0 B B BB B B AB AB A a B Krevní skupiny vyskytující se u jedné rasy na jednom území se moc nemění. Rozdíly nastávají mezi rasami a národnostmi nebo mezi oblastmi na zeměkouli. V České republice (ČR) má největší zastoupení skupina A s 42 % lidí, skupina B čítá 18 %, skupina 0 je zastoupena 32 % a skupina AB má 8 % zastoupení mezi lidmi (Štefan, 2012). 3.2 Rh systém V systému Rh bylo popsáno šest typů antigenů (C, D, E, c, d, e). Dědičnost Rh antigenů závisí na dvou genech: RHD, který určuje přítomnost nebo nepřítomnost antigenu D a RHC, který určuje antigeny C/c a E/e. Člověk, který má ve své krvi přítomný antigen označený velkým písmenem, nevlastní antigen označený malým písmenem. Nejvýznamnějším antigenem v Rh systému je antigen D/d, protože je nejrozšířenějším v populaci a zároveň vykazuje nejvyšší antigenicitu. Zásadní rozdíl mezi AB0 a Rh systémem je ve výskytu protilátek. V případě AB0 systému se protilátky proti antigenu, který není přítomen na membráně červené krvinky, vyskytují přirozeně. V systému Rh se nikdy přirozeně nevyskytují. Člověk nesoucí antigen d je označován za Rh-negativní. V jeho plazmě nejsou přítomny protilátky proti antigenu D. Jedinec, který nese antigen D je označován za Rhpozitivního (Kittnar, 2011). - 16 -
K vyšetření antigenu D se využívá sérologických metod s kombinací vyšetření DNA. K vyšetření se využívají monoklonální protilátky. Každá protilátka detekuje pouze jeden určitý epitop. V dnešní době jsme schopni rozlišit přibližně 30 epitopů. Rutinně vyšetřujeme antigen D dvojím vyšetřením erytrocytů pomocí IgM (imunoglobulin třídy M) monoklonálních anti-d diagnostických protilátek. V tomto případě se využívá dvou diagnostických sér obsahujících různé klony protilátek proti odlišným epitopům. Vyšetření se provádí při pokojové teplotě v solném testu (Penka, Tesařová, 2012). Rh protilátky jsou klinicky významné protilátky. U jedince se začnou tvořit jako odpověď na imunizaci transfuzí. K imunizaci dochází v případě, že se Rh-negativnímu jedinci podá Rh-pozitivní krev. V tomto případě si Rh-negativní jedinec začne vytvářet protilátky proti antigenu D. Titr dosáhne maxima během 2 3 měsíců. Po podání opakované inkompatibilní krve narůstá riziko rychlejší a robustnější imunologické odpovědi. Riziko tedy spočívá při opakovaném podání transfuze s inkompatibilní krví. U prvního podání nekompatibilní krve nejsou důsledky tak fatální (Kittnar, 2011). Zvláštním projevem Rh systému je inkompatibilita matky a plodu. V případě, že otěhotní Rh-negativní žena s Rh-pozitivním mužem a dítě zdědí pozitivní faktor od otce, dojde mezi matkou a dítětem k nesourodosti těchto faktorů se závažnými důsledky. V případě prvního těhotenství u ženy se zejména během porodu dostanou Rh-pozitivní krvinky dítěte do Rhnegativní krve matky a ta si proti nim vytvoří protilátky. První těhotenství zpravidla neprovází výrazné komplikace, protože si imunitní systém matky nestihl vytvořit dostatečné množství protilátek. Riziko stoupá s dalším těhotenstvím, pokud dítě opět získalo pozitivní faktor od otce. Matčiny protilátky pronikají do krevního oběhu plodu, napadají červené krvinky a dochází k imunologické hemolýze. Při druhém těhotenství jsou postižena 3 % dětí, při třetím až 10 % dětí, s každým dalším těhotenstvím incidence stoupá. Významná je především prevence, proto se Rh-negativním matkám nesoucím Rh-pozitivní plod podává na počátku 30. týdne těhotenství specifická protilátka. Mechanismus, kterým tato protilátka brání, není doposud zcela objasněn, ale předpokládá se, že inhibuje tvorbu anti-d protilátek B-lymfocyty (Kittnar, 2011). Rh-protilátky prokazujeme pomocí enzymového nebo nepřímého antiglobulinového testu. Optimálně reagují při 37 C a k zvýšení průkaznosti se využívají erytrocyty upravené proteázami nebo testy s přidaným enzymem (Penka, Tesařová, 2012). - 17 -
3.3 Ostatní systémy krevních skupin Na membráně erytrocytů existuje kromě antigenů krevní systému AB0 a Rh ještě celá řada dalších antigenních nebo krevněskupinových systémů. Např. se jedná o systémy Lewis, MNSs, Lutheran, Kell (Penka, Tesařová, 2012). 3.4 Význam krevních skupin pro transfuzi V systému AB0 najdeme v krevní plazmě přítomné přirozené protilátky. Přítomnost odpovídajících přirozených pravidelných aglutininů anti-a a anti-b a jim odpovídajících antigenů má zásadní význam pro kompatibilitu. V případě, že je jedinci krevní skupiny A (antigen A, protilátka anti-b) podána transfuze s krevní skupinou B, si příjemce začne tvořit protilátky proti erytrocytům dárce. Protilátky se navazují na membránu erytrocytů dárce. U těchto erytrocytů se mění povrchový náboj, což vede ke shlukování erytrocytů (aglutinaci). Při podání inkompatibilní krve dárce příjemci, dochází u příjemce k závažnému poškození zdraví s možnými fatálními následky. Lidé nesoucí krevní skupinu 0 jsou označováni jako univerzální dárci erytrocytů, protože nemají antigeny A a B na povrchu erytrocytů. Nositel krevní skupiny AB je považován za univerzálního příjemce erytrocytů, protože jeho sérum neobsahuje aglutininy anti-a a anti-b (Langmeier, 2009; Kittnar, 2011). - 18 -
4 IMUNOLOGIE KREVNÍCH ELEMENTŮ Všechny buňky lidského těla mají na svém povrchu antigenní znaky, které jsou uspořádané do systému. Nejdříve byly zjištěny antigenní znaky na erytrocytech, postupem času došlo k objevu těchto znaků i na leukocytech a trombocytech. Antigeny mají specifickou funkci v organismu. Umí zpracovat detekovatelnou odpověď a reagovat pomocí specifických produktů této odpovědi tj. protilátkami nebo ejektorovými buňkami (Penka, Tesařová, 2012). 4.1 Antigeny krevních skupin Antigen (Ag), struktura membrány je definovaná lidskou aloprotilátkou tedy protilátkou, produkovanou imunizovanou osobou, které daný znak na membráně chybí. Z biochemického hlediska se jedná o protein, glykoprotein nebo jde o terminální sacharidové, popř. karbohydrátové oblasti glykoproteinů a glykolipidů. V současnosti je pojmenováno 329 antigenů, z nichž je 292 řazených do 33 systémů krevních skupin, dále do kolekcí a sérií antigenů s nízkou, resp. vysokou frekvencí výskytu (Řeháček, 2013). 4.1.1 Antigeny AB0 systému V antigenním krevním systému AB0 rozeznáváme čtyři základní antigeny A, B, AB a 0. Antigeny AB0 systému jsou terminální oligosacharidy široké palety glykosylačních řetězců glykoproteinů a glykolipidů, přítomných na membráně erytrocytů. Antigeny AB0 systému nalezneme i na jiných krevních buňkách, na většině epitelových a endotelových buněk aj. Erytrocytární antigeny A a B jsou projevem exprese genů A a B. Podstatou genové aktivity je syntéza enzymu (glykosyltransferázy), který přenáší a připojuje cukernou složku specifickou pro danou krevní skupinu ke galaktóze k tzv. H antigenu. Syntéza ABH antigenů převažuje především na prekurzorech erytrocytů v hematopoetické tkáni. Jen malá část (asi 1 %) antigenů se absorbuje z plazmy na erytrocyty (Řeháček, 2013; Penka, Tesařová, 2012). - 19 -
Antigen H H antigen je imunodominantní monosacharid pro skupinu 0, který nevykazuje žádnou antigenicitu. Historický název, který nahradil původní substanci 0, vzniklý z heterogenní tj. prokazovaný u více skupin: 0, A 2, B aj. Pro skupinu 0 zůstává tento prekurzorový řetězec nepokrytý. Na výstavbě prekurzorového H řetězce se podílí geny kódující fukosyltransferázy. Přidáním terminální L-fukózy na disacharidové řetězce tzv. peripheral core struktur vzniká H prekurzorový řetězec. Tyto struktury se vyskytují ve více formách. Pro erytrocyty jsou známé 4 typy lišící se v typu karboxylových vazeb a typu preterminálního řetězce (Řeháček, 2013). Antigen A A antigen je složený z 0 antigenu modifikovaného jedním zbytkem N acetylgalaktosaminu. U antigenu A rozlišujeme 4 základní podskupiny: A 1, A 2, A 3, A x, aj. Rozdělujeme je na základě kvalitativních a kvantitativních rozdílů mezi jednotlivými antigeny a na kvantitativním poměru k antigenu H. V podskupině A1 nalezneme nejvíce A antigenu a prakticky žádný antigen H. U zbylých antigenních podskupin je tomu přesně naopak, zvyšuje se poměr antigenu H k antigenu A (Penka, Tesařová, 2012). Antigen B B antigen se skládá z H antigenu modifikovaného jedním zbytkem galaktosy připojený na některé proteiny a lipidy. B antigen obsahuje také podskupiny, ale jejich výskyt je méně častý (Šípek, 2010-2013a). 4.2 Protilátky proti antigenům krevních skupin protilátky Protilátky jsou látky bílkovinné povahy, které nalezneme v plazmě. Tvoří globulární terciální struktury. Vyznačují se svou protilátkovou aktivitou, tj. specificky se váží na určité látky (antigeny), které bývají pro organismus cizí. Protilátky zajišťují tzv. humorální imunitu. V séru najdeme protilátky, které nazýváme imunoglobuliny (Ig) a řadíme je do 5 skupin: G, M, A, D, E. U každého jedince rozeznáváme dva základní druhy protilátek. První skupinu tvoří přirozené protilátky. Povahou se řadí mezi IgM protilátky, méně časté jsou povahou IgG. Jejich tvorba není poznamenána chorobnými projevy. Přirozené protilátky můžeme - 20 -
rozdělit na pravidelné a nepravidelné protilátky. K pravidelným přirozeným protilátkám řadíme: anti A, anti B nebo anti AB, vyskytující se v krvi u každého jedince v závislosti na tom, který antigen je umístěn na jeho erytrocytech a v jeho tělních tekutinách. Nepravidelné přirozené protilátky se vyskytují nejčastěji ve formě IgM. Příkladem takových protilátek jsou anti A 1, anti H. Druhou skupinu tvoří imunizované (získané) protilátky. Vznikají po prodělané nemoci nebo po očkování. Svou povahou se řadí mezi IgG protilátky (McCullough, 2011; Penka, Tesařová, 2012; Šípek, 2010-2013). 4.3 HLA systém = Human leukocyte antigens MHC (Major histocompatibility complex) je složitý systém genů, jehož produkty hrají důležitou roli při zprostředkování imunitní odpovědi organismu. U člověka byl označen jako HLA systém. Dausset, Payne a van Rooda v roce 1950 provedli první studii HLA systému, zaměřenou na leukocytární antigeny, které považovali za možné zdroje autoimunitních onemocnění a febrilních potransfuzních reakcí. Hlavní funkcí HLA molekul je předložit endogenní nebo exogenní cizorodé antigenní fragmenty, pro zpracování v buněčném kompartmentu T- lymfocytům. HLA systém hraje důležitou roli při transplantacích (Řeháček, 2013; McCullough, 2011). Jedná se o vysoce polymorfní systém. Každý jedinec nese na povrchu svých buněk unikátní sestavu molekul HLA I. a II. třídy. Výjimku tvoří monozygotní dvojčata, která mají HLA antigeny stejné. HLA polymorfismus má tedy z hlediska evoluce ochranný význam na úrovni jedince i populace (Řeháček, 2013). Systém HLA dělíme na základě místa výskytu antigenů. První skupinu nazýváme HLA I. třídy. Patřím sem HLA A, HLA B, HLA C, které najdeme na všech jaderných buňkách organismu včetně červených krvinek a krevních destiček. Druhou skupinu tvoří HLA II. třídy a patří sem HLA DRB1, HLA DQB1, HLA DP. HLA II. třídy nalezneme na buňkách, které se výhradně zapojují do imunitních procesů (monocyty, makrofágy, dendritické buňky, B-lymfocyty, aktivované T-lymfocyty). K HLA systému ještě řadíme HLA III. třídy, které s komplexem souvisí nepřímo. Základní funkcí HLA systému je umět rozpoznat vlastní buňky od cizích (Penka, Tesařová, 2012). Produkty HLA jsou lokalizované na krátkém raménku 6. chromozom v oblasti 6p21, přibližně o velikosti 3600 kilobazí DNA. (Shiina, 2009). - 21 -
4.3.1 HLA antigeny I. třídy HLA antigeny I. třídy rozdělujeme podle funkce, exprese a struktury do dvou skupin tzv. klasické a neklasické. Mezi klasické prvky HLA I. třídy řadíme HLA A, HLA B, HLA C. Zástupci skupiny neklasických, neboli vzácných HLA nazýváme HLA E, HLA F, HLA G. HLA I. třídy se skládá z transmembránového α řetězce a nekovalentně asociovaných β 2 mikroglobulinu. Řetězec α se může rozdělit na 3 oblasti: transmembránovou, extracelulární a cytoplazmatickou. Extracelulární oblast je složena ze tří domén α 1, α 2, α 3. Porovnáním α řetězců HLA I. třídy se ukázalo, že největší změny nastávají mezi doménami α 1 a α 2. Doména α 3 je čistě konzervativní. Řetězec β tvoří β 2 mikroglobuliny (β 2 m). Netransmembránové proteiny, které se váží na těžký řetězec nekovalentními vazbami. Pro svou strukturu je α řetězec i β 2 m řazen do skupiny imunoglobulinu. Struktura antigenu HLA I. třídy je zobrazena na obr. 1.1. Gen kódující β 2 m je lokalizován na 15. chromozomu. (McCullough, 2011; Shiina, 2009). Obr. 1: Molekula HLA I. třídy - 22 -
4.3.2 HLA antigeny II. třídy Patří stejně jako HLA I. třídy do imunoglobulinové rodiny. K této skupině řadíme HLA DRB1, HLA DQB1, HLA DP. Struktura je tvořena 2 nekovalentně asociovanými transmembránovými podjednotkami α a β. Vyskytují se pouze na buňkách prezentujících antigen. HLA II. třídy obsahuje těžký řetězec α a lehký řetězec β nekovalentně vázaný. Významnou funkcí této třídy je vazba peptidových fragmentů. Jedná se o důležitý ochranný význam, jak na úrovni jedince tak i celé populace. HLA II. třídy je graficky znázorněn na obr. 1.2 (McCullough, 2011). Obr. 2: Molekula HLA II. třídy 4.3.3 HLA antigeny III. třídy Geny nalezené v oblasti mezi HLA I. a II. třídy nazýváme HLA III. třídy. Produkty této skupiny se morfologický liší od HLA antigenů I. a II. třídy a bezprostředně se nepodílejí na funkční aktivitě HLA systému. Patří sem některé cytokiny TNF-α (tumor nekrosis faktor α), lymfocytoxin, složky komplementu např. C 2, C 4 nebo faktor B, jak ukazuje obrázek 1.3. Téměř 50 genů zahrnuje tento genový komplex (Penka, Tesařová, 2012). - 23 -
Obr. 3: Zjednodušená mapa HLA systému na chromozómu 6 4.4 Imunologie leukocytů HLA antigeny leukocytů Antigeny vyskytující se na leukocytech, dělíme do dvou skupin: Antigeny společné s antigeny erytrocytů (AB0, Rh, Kell, aj.) Antigeny specifické pro leukocyty (specifické antigeny lymfocytů HLA antigeny, specifické antigeny granulocytů HNA antigeny, specifické antigeny monocytů HMA) K vyšetření HLA antigenů využíváme lymfocytotoxický test (LCT) nebo molekulárně genetické metody. LCT je test založený na reakci specifických HLA antisér s HLA antigeny přítomnými na vyšetřovaných lymfocytech. Ke specifickým antisérům v jamkách mikrotitrační destičky se přidají lymfocyty testovaného jedince. Během inkubace dochází k navázání specifické protilátky na HLA antigen lymfocytů, pokud je tento antigen na povrchu buňky přítomný. Vazba mezi antigenem a protilátkou se zviditelňuje přidáním králičího komplementu do reakce. Pokud dojde k lýze buněk - pozitivní reakce, v reakci byl přítomen komplex antigen-protilátka, na který se komplement navázal. V opačném případě negativní reakce k lýze buněk nedochází. K vyšetření HLA antigenů pomocí molekulárně genetických metod využíváme polymerázovou řetězovou reakci (PCR) se sekvenčně - 24 -
specifickými primery = PCR-SSP, PCR se sekvenčně specifickými oligosacharidy = PCR- SSO nebo využíváme metody přímého sekvenování (Řeháček, 2013). Protilátky leukocytů Protilátky vznikají tehdy, obsahuje-li imunizační faktor HLA antigeny odlišné od osoby vystavené jeho účinku. Anti-HLA protilátky se u člověka vytváří po imunizaci podnětu (senzibilizaci), který představuje opakované těhotenství, transfuze nebo transplantace. Cytotoxické HLA protilátky mohou být trvale přítomny až u 20 % žen po opakovaném těhotenství. HLA protilátky patří do třídy IgM nebo IgG. Vznik a výskyt přirozených cytotoxinů HLA je vzácný (Penka, Tesařová, 2012; Řeháček, 2013). Anti-HLA protilátky se vyšetřují prostřednictvím lymfocytotoxického testu. Princip testu je podobný jako u vyšetření antigenů. Rozdíl je v tom, že vyšetřujeme sérum nebo plazmu pacientů s panelem buněk od dárců se známými HLA antigeny. Další metodou je ELISA umožňující screening a identifikaci protilátek proti HLA antigenům I. a II. třídy. Výhodou této metody je větší citlivost než lymfocytotoxický test. Mnohem lépe zachycuje i na komplementu nezávislé HLA protilátky. Průtoková cytometrie, další metoda využívající se k detekci anti-hla protilátek, patří k nejcitlivějším metodám pro záchyt a identifikaci anti- HLA protilátek I. a II. třídy. Dokáže detekovat komplement nezávislé protilátky i jiné s lymfocyty reagující protilátky, u kterých je prozatím klinický význam nejasný (Řeháček, 2013). Protilátky proti leukocytům mohou u imunokompromitovaných pacientů (novorozenci, pacienti s hematoonkologickým onemocněním aj.) způsobit potransfuzní reakce např. Ta- GvHD, febrilní nehemolytické potransfuzní onemocnění (Řeháček, 2013). 4.4.1 Imunologie HNA = Human neutrofile antigens HNA antigeny Na cytoplazmatické membráně granulocytů nalezneme 2 typy antigenů: Antigeny společné s buňkami ostatních tkání (AB0 a Rh systém, HLA antigeny I. třídy) Specifické antigeny granulocytů (HNA antigeny) Doposud bylo objeveno a popsáno 5 systémů HNA antigenů. Číslování antigenů odpovídá pořadí, v jakém byly objeveny. Inkompatibilita v HNA antigenech mezi dárcem a příjemcem - 25 -
může vyvolat tvorbu aloprotilátek proti neutrofilům, které mají klinický význam (Penka, Tesařová, 2012; Řeháček, 2013). První systém HNA 1 obsahuje 3 antigeny HNA 1a, HNA 1b, HNA 1c. Celkově jsou tyto antigeny exprimovány pouze na neutrofilech. Druhý systém HNA 2 má 2 antigeny HNA 2a, HNA 2b. Objevují se pouze na neutrofilech a jejich prekurzorech. Je známo, že se antigen HNA 2a tvoří ve větším množství na neutrofilech u žen než u mužů a je také mnohem více zastoupen u těhotných žen než u zbytku zdravé populace. Třetí systém HNA 3 obsahuje pouze jeden antigen HNA 3a, který se vyskytuje na neutrofilech, lymfocytech, trombocytech, endotelových buňkách, v ledvině a slezině a na placentárních buňkách. Čtvrtý i pátý systém (HNA 4, HNA 5) obsahuje po jednom antigenu resp. HNA 4a, HNA 5a. HNA 4a nalezneme na granulocytech, monocytech, lymfocytech. Antigen HNA 5a nalezneme na leukocytech (Penka, Tesařová, 2012). Protilátky HNA Protilátky vzniklé působením HNA antigenů dělíme podle způsobu vzniku. Jedná se o aloimunitní protilátky vznikající v průběhu těhotenství a po transfuzích (granulocyty, erytrocyty, trombocyty), kontaminací leukocyty, po transplantaci kostní dřeně. Dále pak autoimunitní protilátky způsobující zánik zralých granulocytů v periferní krvi (autoimunitní neutropenie) a nakonec na protilátky, jejichž tvorba je indukovaná léky např. antibiotiky, nesteroidními antirevmatiky (Penka, Tesařová, 2012). Specifické protilátky proti HNA můžeme rozdělit podle jejich chování: Protilátky způsobující přímou aglutinaci. Převažují protilátky třídy IgG, někdy směsi IgG, IgM a IgA imunoglobulinů Protilátky potahující buňky imunoglobulinem třídy IgG a IgM Protilátky vázající komplement (cytotoxiny) Anti-HNA specifické protilátky jsou klinicky významné, protože se podílejí na vznik TRALI, neonatalní aloimunitní neutropenie, autoimunitní neutropenie, febrilní nehemolytické potransfuzní reakce atd. V séru pacienta postiženého granulocytárními protilátkami často nalezneme i protilátky proti HLA a trombocytům (Penka, Tesařová, 2012; Řeháček, 2013). K vyšetření HNA protilátek se využívá řada metod. Granulocytový aglutinační test (GAT) se provádí na mikrotitračních destičkách, kde se pacientovo sérum (plazma) inkubuje se suspenzí granulocytů. Po následné inkubaci a obarvení vitálním barvivem se hodnotí aglutinace buněk. GAT především zachycuje IgM a IgG specifické protilátky proti granulocytům. Další metodou je granulocytový imunofluorescenční test (GIFT). Test se - 26 -
zakládá na stabilizaci membrány vyšetřovaných granulocytů pomocí paraformaldehydu a omezení vazeb nespecifických protilátek na Fc receptory neutrofilů před inkubací. Následně dojde k detekci specifických protilátek navázaných na granulocytech pomocí fluoresceinu značeným sekundární protilátkou proti lidské Ig. Výsledky se hodnotí mikroskopicky nebo pomocí průtokové cytometrie. Dochází zde k detekci IgG a IgM specifických protilátek proti granulocytům i anti-hla protilátek. GIFT je citlivější pro detekci IgG protilátek než GAT. Monoclonal antibody-specific imobilization of granulocyte antigen (MAIGA) je test určený pro zjištění specifických protilátek proti granulocytům. Pro svou náročnost na čas, personál a nutnosti zpracovat granulocyty velmi rychle se v praxi moc nevyužívá (Řeháček, 2013). 4.4.2 Imunologie HMA = Human monocyte antigens HMA antigeny Na povrchu monocytů najdeme 2 typy antigenů. Antigeny společné s ostatními buňkami (HLA antigeny I. A II. třídy). Antigeny, které jsou specifické pro monocyty (HMA antigeny). HMA antigeny mají podobnou strukturu jako HLA antigeny I. třídy. Lehký řetězec tvoří β 2 mikroglobulin. Nachází se na 6. chromozomu v blízko HLA B. Mezi HLA a HMA byl prokázán určitý vztah, který byl potvrzen vzájemnou vazbou při dědičnosti. HMA antigeny dělíme do 2 lokusů, HMA A, HMA B (Penka, Tesařová, 2012). HMA protilátky Vzniklé protilátky proti HMA jsou převážně cytotoxického charakteru, slabé s nízkým titrem. HMA protilátky se vyskytují současně s HLA protilátkami především anti-hla-dr. Monocytární protilátky najdeme u pacientů po provedené transfuzi, kde mohou způsobovat potransfuzní reakce. Dále je nalezneme u těhotných žen nebo u pacientů po transplantaci. Průkaz monocytárních protilátek je umožněn pomocí monocytotoxického testu (Penka, Tesařová, 2012). - 27 -
4.5 Imunologie trombocytů HPA antigeny Trombocytární antigeny dělíme do tří skupin podle místa výskytu. Na antigeny, které jsou společné s buňkami ostatních tkání např. pro erytrocytární systém (AB0,Kell,Duffy) nebo pro HLA systém (systém I. třídy) a granulocytární systém (HNA-3) a na antigeny specifické jenom pro trombocyty - HPA antigeny (Řeháček, 2013). Trombotický antigenní systém obsahuje 6 prokazatelných skupin: HPA 1, HPA 2, HPA 3, HPA 4, HPA 5 a HPA 15. Známé jsou i další HPA skupiny (HPA 6w až HPA 10w), tvoří je jedna alela a jejich výskyt je velice nízký. Většina skupin je lokalizována na glykoproteinovém komplexu IIb-IIIa, který je jako ligand nezbytný pro adhezivní proteiny při agregaci a adhezi destiček. Glykoproteiny přítomné na povrchu trombocytů se vyznačují charakteristickou strukturou a funkcí (Penka, Tesařová, 2012; Řeháček, 2013). HPA 1a antigen se v kavkazské populaci vyskytuje více než z 80 %. Znalost těchto antigenů nabývá významu u potransfuzních reakcí nebo u některých krevních chorob. Protilátka proti tomuto antigenu dává nejčastěji vznik feromaternální aloimuninní trombocytopenii (Penka, Tesařová, 2012; Řeháček, 2013). HPA protilátky Antitrombocytární protilátky vznikají jako odpověď imunitního systému na HPA antigen. V lidském těle nalezneme tři typy protilátek proti HPA. Aloprotilátky, které se objeví u člověka po transfuzi, po transplantaci nebo v průběhu těhotenství. Dalším typem protilátek jsou autoprotilátky, které způsobují destrukci trombocytů (autoimunitní trombocytopenie) nebo se objeví jako léky indukované protilátky. Antitrombocytární protilátky patří do třídy IgG, často také IgM a zřídka IgA (Penka, Tesařová, 2012). Vyšetření trombocytárních protilátek se provádí pomocí DIFT, ELISA nebo MAIPA. DIFT (destičkový imunofluorescenční test) zachytává anti-hla i anti-hpa specializované protilátky. Jedná se o screeningový test, při kterém se inkubuje vyšetřované sérum se směsí trombocytů dárců skupiny 0 (Rh-negativních). Následně dochází k promytí směsi a inkubaci s protilátkou proti lidským Ig značenými fluoresceinem. Poté dojde k opětovnému promytí, roztřepání s ředěným glycerolem a vytřepání na podložní sklo. Výsledný vzorek se odečítá pod fluorescenčním mikroskopem nebo pomocí průtokové cytometrie. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) zachytává anti-hla protilátky a řadu nespecifických protilátek - 28 -
vázaných na trombocyty. Princip je stejný jako u záchytu protilátek proti leukocytům. Výsledek se stanovuje na spektrofotometru. MAIPA (monoclonal antibody-specific imobilization of plateles antigen) vysoce specifický test určený pro detekci aloprotilátek i autoprotilátek proti trombocytům. Vysoce citlivý, avšak velice časově náročný a pracný test, na který je potřeba panel trombocytů se známými znaky HPA (Řeháček, 2013). Protilátky proti trombocytům jsou zodpovědné za onemocnění: imunitní trombocytopenická purpura, léky indukovaná imunitní trombocytopenie nebo pasivní aloimunitní trombocytopenie (McCullough, 2011). - 29 -
5 POTRASFUZNÍ REAKCE Pojmem potransfuzní reakce jsou označovány všechny neočekávané nežádoucí účinky související s podáním transfuzního přípravku. Můžeme je rozdělit dle mechanismu, příčiny, časového průběhu, symptomů, dle průběhu aj. Podle časového průběhu je dělíme na akutní a pozdní. Akutní potransfuzní reakce se objevuje nejdéle do 24 hodin po podání transfuze. Klinické příznaky pozdní potransfuzní reakce se objevuji do několika dnů či týdnů od podání transfuze. Podle etiologie rozdělujeme potransfuzní reakce na imunologické a neimunologické. European Haemovigilance (EHN) Network Working party řadí potransfuzní reakce podle příčiny do čtyř skupin: transfuzí přenosné infekce; imunitní komplikace; kardiovaskulární a metabolické komplikace; neznámé komplikace. Z hlediska klinického průběhu můžeme potransfuzní reakce rozdělit na lehké a závažné. U lehkých odezní klinické účinky po zastavení transfuze a následné jednoduché léčbě. V případě závažných potransfuzních reakcí dochází u postiženého k orgánovým poruchám (Řeháček, 2013). Mezi nejčastější klinické projevy potransfuzní reakce patří horečka, třesavka a kopřivka. Riziko některých potransfuzních reakcí je možné snížit zavedením správné výrobní praxe nebo použitím správného postupu v klinické části (odběr a značení vzorku, vyplnění žádanky, zacházení s transfuzním přípravkem na klinickém oddělení včetně jeho aplikace pacientovi). Některé potransfuzní reakce můžeme redukovat pomocí preventivních opatření např. deleukotizací nebo ozářením (Penka, Tesařová, 2012; Kubešová, Tesařová, 2005). - 30 -
Dělení potransfuzních reakcí podle charakteru a rozsahu klinických projevů: 1) AKUTNÍ a) Akutní hemolytická reakce b) Febrilní nehemolytická transfuzní reakce c) Alergická potransfuzní reakce d) Anafylaktická potransfuzní reakce e) Transfusion related acuted lung injury (TRALI) f) Další i) hypotermie ii) hyperkalémie iii) citrátová toxicita 2) POZDNÍ a) Pozdní hemolytická reakce b) Potransfuzní purpura c) TA GvHD (s transfuzí asociovaná reakce štěpu proti hostiteli) d) Přenos virové infekce e) Přenos parazitů f) Přenos prionů g) Potransfuzní hemosideroza h) Tvorba inhibitoru i) Toxické účinky plastů (Penka, Tesařová, 2012) - 31 -
5.1 Akutní hemolytická reakce Klinické projevy akutní hemolytické reakce (AHR) se objevují do 24 hodin od počátku podání transfuze. Podle převládajícího místa destrukce rozlišujeme AHR intvaskulární a extravaskulární. AHR intravaskulární se vyznačuje velkou hemoglobinurií a hemoglobinemií. Při extravaskulární AHR pacientům klesá hladina hemoglobinu. AHR vzniká nejčastěji při podání inkompatibilních erytrocytů v AB0 systému. U příjemce transfuze dochází k intravaskulární hemolýze, za kterou jsou odpovědny protilátky anti-a, popř. anti-b, třídy IgM, které se navazují na antigeny erytrocytů a cestou aktivace komplementu způsobují poškození membrány erytrocytů a jejich lýzu. Za klinické projevy u AHR jsou zodpovědné anafylatoxiny. Při aktivaci komplementu se anafylatoxiny uvolní z granulí žírných buněk. Mezi nejčastější klinické projevy AHR patří třesavka, zvýšená teplota, bolest v místě vpichu, bolest v břiše nebo v zádech, úzkost, neklid, tachykardie atd. Erytrocyty senzibilizované protilátkou dále interagují s aktivovanými fagocyty, které produkují mediátory zánětu. Tento stav se klinicky projeví poklesem krevního tlaku s následnými projevy šokové plíce, ledviny a ostatních vnitřních orgánů. Chyby vedoucí k podání inkompatibilní krve vznikají na klinickém oddělení i v laboratorní části. Nejčastější chyby souvisí s administrativními nedostatky nebo nedodržením předepsaného postupu. Jedná se především o chybnou identifikaci krevního vzorku, chybnou identifikaci pacienta nebo špatnou interpretaci výsledků. AHR může vzniknout i z neimunologických příčin, vlivem poškození erytrocytů v transfuzi. K poškození erytrocytů může dojít např. bakteriální kontaminací přípravku nebo jeho nadměrným zahřátím či poškozením chladem. Četnost výskytu AHR je udávána na 1:20 000 nebo 1:40 000 příjemců krve s úmrtností méně než 10 % (Penka, Tesařová, 2012; Kubešová, Tesařová, 2005). - 32 -
5.2 Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce (FNHTR) vzniká prostřednictvím mediátorů a cytokinů (IL-1, IL-6 nebo TNF) z leukocytů, které se uvolní z buněk v průběhu zpracování a skladování transfuzních přípravků, pokud leukocyty obsahují. FNHTR se může objevit i v případě, že se v podané plazmě vyskytnou antileukocytární protilátky, anti-hla protilátky, trombocyty nebo granulocyty. Klinickými příznaky jsou horečka (zvýšení teploty o více než o 1 C), bolest hlavy, nauzea, zarudnutí a bolest zad a krku. Projevy FNHTR se objevují většinou během transfuze nebo do 4 hodin od podání transfuze. Negativní výsledky ukazuje bakteriologické vyšetření krve dárce i příjemce. Deleukotizace transfuzních přípravků před skladováním je vhodným řešením jak předcházet FNHTR. V zemích, kde došlo k zavedení univerzální deleukotizace poklesl výskyt FNHTR na 0,1 % (Kubešová, Tesařová, 2005; Řeháček, 2013). 5.3 Alergická potransfuzní reakce Alergická reakce se nejčastěji vyskytuje po podání trombocytových přípravků nebo plazmy, méně často se objevuje po podání erytrocytových přípravků. Vyskytuje se u 1 až 2 % podaných transfuzí. Krevní příjemce má vytvořenou protilátku proti transfundovaným antigenům nebo mu chybí některá z bílkovin, složek plazmy nebo se mu tvoří protilátka proti ní. Vzácnou vadou je vrozený deficit IgA, kde si příjemce transfuze vytvoří vysokou hladinu protilátek proti imunoglobulinu IgA, které pak mohou způsobit alergickou reakci. Klinicky se projeví zarudnutím kůže, kopřivkou, místními otoky nebo puchýři. Prevencí před vznikem alergické potransfuzní reakce je odstranění bílkovin z plazmy, kdy dochází k promytí buněčných transfuzních přípravků (Kubešová, Tesařová, 2005; McCullough, 2011; Řeháček, 2013). 5.4 Anafylaktická potransfuzní reakce Reakce, která je zapříčiněna deficitem IgA, protilátkami anti-iga, komplementem C 4, haptoglobinem nebo další neznámou bílkovinnou plazmy. Po podání běžného transfuzního - 33 -
přípravku se pacientovi začnou tvořit IgG/IgA-imunokomplexy a dojde k aktivaci komplementu. Vzniklé anafylatoxiny se váží na receptory žírných buněk. Dojde k jejich degranulaci a ke spuštění anafylaktické reakce. Klinické projevy anafylaktické potransfuzní reakce se objevují ihned po podání transfuze a patří mezi ně kopřivka, zčervenání obličeje a trupu, svědění, cyanóza, hypotenze až šokový stav (anafylaktický šok). Anafylaktická reakce se vyskytuje s frekvencí zhruba 1:50 000 běžných transfuzí. Prevencí anafylaktické reakce je odstranění veškeré plazmy promytím transfuzního přípravku (Kubešová, Tesařová, 2005; McCullough, 2011). 5.5 Transfusion related acuted lung injury (TRALI) Transfusion related acuted lung injury (TRALI) představuje akutní poškození plic transfuzí. Jedná se o závažnou až život ohrožující potransfuzní reakci, která se projevuje těžkou dušností nastupující v průběhu šesti hodin od podání transfuze, těžkým oboustranným otokem plic a hypoxii. Občas se u pacientů objevuje hypotenze a horečka (Penka, Tesařová, 2012). V roce 1957 Brittigham popsal první TRALI reakci u pacienta, kterému byla podána transfuze plné krve. TRALI vzniká z důvodu přítomnosti antileukocytárních protilátek v krvi dárce, které se naváží na antigeny leukocytů (anti HLA) nebo neutrofilů (anti HNA) příjemce krve. Během reakce dojde k uvolnění zánětlivých cytokinů, které zvyšují propustnost plicních kapilár, a tím se zvyšuje riziko vzniku plicního edému. Za příčinu vzniku TRALI mohou být zodpovědné i biologicky aktivní lipidy přítomny v plazmě dárce, které reagují s leukocyty příjemce. Výzkumy na zvířatech prokázaly, že TRALI mohou způsobovat i aktivované krevní destičky, které reagují s neutrofily (Dean, 2005; Schmidt, 2012; Sahay, 2012). V současnosti rozeznáváme i neimunitní TRALI, kdy dochází ke změně epitelu plicní tkáně. Příčinou vzniku neimunitního TRALI je pravděpodobně předchozí aktivace endotelu mediátory zánětu. V případě dalšího endogenního stimulu leukocytů (např. sepse), dochází u pacienta k adheraci leukocytů a k obstrukci plicních mikrocirkulací s vývojem plicního edému. Na vzniku neimunitního TRALI má vliv i stáří erytrocytárních nebo trombocytárních přípravků. Pokud jsou příjemci podané staré erytrocyty nebo trombocyty, dochází k aktivaci endotelu prostřednictvím biodegradačních substancí buněčných membrán, zejména lysofosfatidylcholinu (Penka, Tesařová, 2012). - 34 -
Typickým nálezem pro TRALI reakci na předozadním snímku z rentgenu je oboustranný plicní infiltrát. Výskyt TRALI u mužů a žen (příjemců transfuze) je stejně častý. Tato potransfuzní reakce je smrtelná asi pro čtvrtinu pacientů, u kterých byla diagnostikována (Penka, Tesařová, 2012). Při laboratorním průkazu TRALI se v krvi příjemce i dárce transfuze hledají antigranulocytární nebo anti HLA protilátky. Následně laborantky hodnotí pozitivitu a sílu granulocytového cross-match (Řeháček, 2013). V transfuzní praxi se doporučuje využívat plazmu od žen pouze na výrobu krevních derivátů a pro kliniku používat čistě jenom plazmu od mužů. U dárkyň krve je výskyt anti- HLA či anti-hna protilátek častější v důsledku předchozí senzibilizace těhotenstvím (Penka, Tesařová, 2012). V ČR neexistuje žádná platná legislativa, která by nařizovala transfuzním oddělením využívat pro klinické účely jenom plazmu od mužů. Záleží jenom na možnostech transfuzního oddělení, jestli se rozhodne pro toto opatření. Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno se rozhodlo tohoto doporučení držet. Plazma žen se využívá pouze na výrobu krevních derivátů. Pro kliniku se používá jenom plazma od mužů bez transfuze v anamnéze. Ve Velké Británii v letech 2009-2010 byl proveden výzkum, který zkoumal přítomnost leukocytárních protilátek v transfuzních přípravcích. Výsledky tohoto výzkumu měly vést k zavedení nových bezpečnostních opatření v transfuzní praxi, které by snížili výskyt TRALI reakce. Ke studii byly použity aferetické vzorky krve prvodárkyň, které byly testovány na výskyt HLA protilátek a specifických HNA protilátek. Výsledky ukázaly znatelné zastoupení HLA a HNA protilátek v krvi dárkyň. Studie navrhla řadu opatření ke snížení této potransfuzní reakce. Výsledky rovněž ustanovily nová doporučení pro kritéria výběru dárce krve (Lucas, 2012). Ve Spojených státech amerických v letech 2006-2007 proběhla studie na přítomnost antileukocytárních protilátek mezi dárci krve (Leukocyte Antibody Prevalence Study LAPS I) ve spojitosti se snížením výskytu TRALI reakce. Konkrétně se studie zaměřila na dárce s transfuzí a těhotenstvím v anamnéze. Studie se zúčastnilo kolem 8 tisíc dobrovolníků. Z výsledků vyplývá, že výskyt anti-hla protilátek byl menší než 2 % u mužů s transfuzí v anamnéze i bez ní a u žen bez proběhlého těhotenství. Naopak ženy s 1 těhotenstvím měly výskyt anti-hla protilátek s četností 11.2 %. U žen s vícečetným těhotenstvím byl výskyt protilátek ještě daleko vyšší. HNA protilátky byly u dárců taky vyšetřovány. Čestnost výskytu byla u obou pohlaví stejná. Podle výsledků by bylo vhodné testovat dárce s transfuzí a těhotenstvím v anamnéze na výskyt antileukocytárních protilátek (Darrell, 2009). - 35 -