Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé

Miroslava Vyvadilová a kol. Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé METODIKA PRO PRAXI VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. PRAHA RUZYNĚ 2008

Miroslava Vyvadilová, Miroslav Klíma, Vratislav Kučera Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé METODIKA PRO PRAXI VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. PRAHA RUZYNĚ 2008 1

Metodika vznikla za finanční podpory MZe ČR a je výstupem řešení Výzkumného záměru MZe 0002700602 Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agrobiodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství. Autoři: Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc. Ing. Miroslav Klíma Ing.Vratislav Kučera, CSc. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Oponenti: RNDr. Miroslav Griga, CSc. Agritec, výzkum, šlechtění a služby, s.r.o. Zemědělská 16 78701 Šumperk Ing. Ivan Branžovský, CSc. Odbor rostlinných komodit Ministerstvo zemědělství ČR Autor fotografií: Kontakt na autory: Ing. Miroslav Klíma vyvadilova@vurv.cz, klima@vurv.cz Vydáno v počtu: 50 ks Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008 ISBN 978-80-87011-80-5 Schváleno MZe, dopis č.j. 46274/2008-18020 2

Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé Dihaploidy (DH) vytvářené technikou mikrosporových kultur jsou využívány ve šlechtitelských programech, kde umožňují produkci homozygotních linií a výrazně zkracují dobu vyšlechtění odrůd ve srovnání s tradičními postupy. Tato publikace přináší souhrnný návod k produkci dihaploidních linií ozimé řepky. Pylová embryogeneze je ovlivňovaná řadou kritických faktorů, z nichž je nejvýznamnější genotyp, fyziologický stav donorových rostlin a vývojové stádium mikrospor. Optimalizace metody spočívá v pěstování donorových rostlin v klimatizovaných kultivačních komorách, ve zlepšení regenerace celistvých rostlin postupnou subkultivací kotyledonárních embryí na média s různými kombinacemi fytohormonů a odřezávání části jejich děloh. Účinnost diploidizace mikrosporových regenerantů byla značně zvýšena aplikací antimitotické látky trifluralinu do mikrosporových kultur. Modifikovaná metoda mikrosporových kultur je využitelná pro široké spektrum genotypů řepky ozimé. Method of doubled haploid line production for winter oilseed rape breeding Doubled haploids (DH) derived from microspore culture are used in breeding programmes where they enable the production of homozygous lines and significantly reduce cultivar development time. Doubled haploid system is really saving up two years in comparison to the conventional breeding work. This publication brings the comprehensive instruction for the production of oilseed rape DH lines. There are a number of critical factors affecting the efficiency of microspore embryogenesis. The most important are genotype, physiological state of donor plants and stage of microspore development. The improvement of DH methodology consists of donor plant growing in controlled conditions in cultivation room, the regeneration of plantlets by gradual subcultivation of cotyledonary embryos on media with various combinations of phytohormones and excision of the cotyledons from mature embryo. Chromosome doubling efficiency was considerably increased by trifluralin treatment of in vitro microspore cultures. The modified microspore culture technique is applicable to a wide spectrum of winter oilseed rape genotypes. 3

Obsah I) Cíl metodiky...5 II) Vlastní popis metodiky...5 1. Úvod...5 2. Metodické postupy...5 2.1. Příprava donorových rostlin...5 2.1.1. Technické vybavení a materiál...5 2.1.2. Pracovní postup...6 2.2. Odběr rostlinného materiálu...6 2.2.1. Materiál a vybavení...6 2.2.2. Pracovní postup...6 2.3. Stanovení vývojové fáze mikrospor...6 2.3.1. Materiál a vybavení...6 2.3.2. Pracovní postup...7 2.4. Mikrosporové kultury...7 2.4.1. Technické vybavení a materiál...7 2.4.2. Pracovní postup...7 2.4.2.1. Odběr a sterilizace poupat...7 2.4.2.2. Izolace mikrospor...7 2.4.2.3. Diploidizace in vitro a kultivace mikrospor...8 2.5. Regenerace celistvých rostlin...8 2.5.1. Technické vybavení a materiál...8 2.5.2. Pracovní postup...8 2.6. Dopěstování regenerantů do generativní fáze...9 2.6.1. Technické vybavení a materiál...9 2.6.2. Pracovní postup...9 2.6.2.1. Přesazení regenerantů do nesterilních podmínek...9 2.6.2.2. Kontrola ploidie regenerantů...9 2.6.2.3. Získání osiva R 1 generace...9 2.7. Časový harmonogram přípravy donorových rostlin pro jarní odběry poupat...10 2.8. Časový harmonogram vývoje embryí a regenerace celistvých rostlin...11 III) Srovnání novosti postupů...13 IV) Popis uplatnění metodiky...13 V) Seznam použité související literatury...13 VI) Seznam publikací, které předcházely metodice...15 VII) Příloha...16 4

I) Cíl metodiky Cílem metodiky je podat ucelené informace o postupu tvorby dihaploidních linií, od přípravy donorových rostlin, založení mikrosporových kultur, regenerace celistvých rostlin až po převod regenerantů do nesterilních podmínek a získání osiva R1 generace. II) Vlastní popis metodiky 1. Úvod Tvorba dihaploidů (DH) je v poslední době využívána ve šlechtění celé řady plodin. Tato metoda umožňuje vytvářet kompletně homozygotní genotypy z heterozygotních rodičů během jedné generace. Pomocí dihaploidů jsou fixovány rekombinantní gamety přímo jako fertilní homozygotní linie. K produkci dihaploidních linií řepky je nyní rutinně využívána metoda pylové embryogeneze v mikrosporových kulturách in vitro. Pomocí indukce haploidů v mikrosporových kulturách a zdvojení chromozómové sádky lze získat zcela homozygotní neštěpící DH linie prakticky za jeden rok. Značnou výhodou DH systému je úspora času, vzhledem k tomu, že hodnocení výnosu a dalších hospodářských znaků je možné mnohem dříve ve srovnání s tradičními metodami šlechtění. Zkoušky výkonu a přemnožení osiva mohou být provedeny během tří až čtyř let. Systém dihaploidů umožňuje efektivní tvorbu linií pro šlechtění jak tradičních odrůd, tak zejména komponent hybridů (Kučera et al. 2002). Další možnosti využití představuje časná selekce specifických znaků, stabilizace mezidruhových hybridů, genetické analýzy, mutace a selekce in vitro (např. na obsah mastných kyselin, rezistenci vůči chorobám, mrazuvzdornost apod.). Pomocí dihaploidů lze docílit kombinací znaků, tradičními metodami obtížně nebo zcela nedosažitelných, jako je autoinkompatibilita (AI) a 00 kvalita semen. Haploidní či dihaploidní regeneranty se též mohou využívat k transformacím a molekulárním analýzám. Na pracovišti VÚRV, v.v.i. byla propracována a optimalizována metoda produkce dihaploidů pomocí mikrosporových kultur. Výrazným posunem bylo zejména zlepšení přímé regenerace celistvých rostlin z mikrosporových embryí metodou ořezávání děložních segmentů (KLÍMA et al. 2004) a optimalizace metody diploidizace mikrosporových regenerantů za účelem získání fertilních celistvých rostlin (KLÍMA et al. 2008). 2. Metodické postupy 2.1. Příprava donorových rostlin 2.1.1. Technické vybavení a materiál - Výsevní substrát - Květináče 8 cm a kontejnery 19 x 19 cm - Vícesložkové tekuté hnojivo - Klimatizovaná růstová komora fotoperioda 16/8 h, teplota 22/20 C (den/noc), intenzita osvětlení 84 µmol/m 2 /s - Skleník fotoperioda 16/8 h, teplota 1525/1015 C (den/noc), s přisvětlováním (sodíkové výbojky - 210 W) - Jarovizační komora fotoperioda 8/16 h, teplota 25 C, přisvětlování zářivkami - Lednice teplota 4-5 C 5

2.1.2. Pracovní postup - Výsev semen vybraných genotypů ve dvou obdobích, dle etapy odběru poupat: a) Odběr poupat záříleden výsev v průběhu června (rostliny ve fázi nástupu kvetení umístit do klimatizované kultivační komory) b) Odběr poupat únorkvěten výsev záříříjen (odběry poupat lze provádět též ve skleníkových podmínkách, pokud teploty nepřesáhnou 25 C) - Přepichování klíčenců do květináčků 8 cm s výsevním substrátem (10 rostlin od genotypu) - Jarovizace rostlin ve fázi 610 pravých listů po dobu 78 týdnů - Přesazení jarovizovaných rostlin do kontejnerů 19 x 19 cm se zahradnickým substrátem a pěstování ve skleníkových podmínkách (kontrola zdravotního stavu, případné ošetření pesticidy) - Přemístění rostlin ve fázi prodlužování před tvorbou květenství do klimatizované komory nebo do skleníku, pokud není k dispozici klimatizovaná komora - Přihnojování v průběhu kvetení roztokem tekutého vícesložkového hnojiva 12 x týdně - Pravidelné odstraňování odkvetlých květenství, aby se podpořila tvorba nových poupat 2.2. Odběr rostlinného materiálu 2.2.1. Materiál a vybavení - Nůžky - Kádinky (200250 ml) s vychlazenou destilovanou vodou - Lihový fix na popis kádinek - Cestovní chladnička (termotaška) 2.2.2. Pracovní postup - Odstřižení částí terminálních a axilárních květenství s neotevřenými poupaty - Umístění květenství jednotlivých genotypů v kádinkách do termotašky - Uložení květenství v lednici při 4-5 C až do vlastního odběru jednotlivých poupat (po dobu maximálně pěti dnů) 2.3. Stanovení vývojové fáze mikrospor Nezralá pylová zrna jsou schopna procházet embryogenezí pouze v určité fázi svého vývoje ve středně až pozdně jednojaderném stádiu. Proto se před založením mikrosporové kultury stanovuje délka poupat, která je v korelaci s vývojovým stadiem mikrospor 2.3.1. Materiál a vybavení - Milimetrový papír - Pinzeta - Podložní a krycí sklíčka - Roztok železitého acetokarmínu - Optický mikroskop 6

2.3.2. Pracovní postup - Příprava roztlakových preparátů s acetokarmínem z prašníků vyjmutých z poupat tří až čtyř velikostí, obvykle v rozsahu 34 mm - Hodnocení vývojového stádia mikrospor pod mikroskopem při zvětšení 400x až 600 x - Stanovení optimální velikosti poupat pro mikrosporové kultury jednotlivých genotypů (převažující zastoupení středně až pozdně jednojaderných mikrospor, které se vyznačují kulovitým tvarem, čirou cytoplazmou, zřetelným jádrem v blízkosti exiny, obrázek č. 1 viz příloha) 2.4. Mikrosporové kultury 2.4.1. Technické vybavení a materiál - Flowbox pro práci ve sterilním prostředí - Stolní centrifuga - Laboratorní horizontální třepačka - Binokulární lupa - Inverzní mikroskop - Biologický termostat - Lednice - Stolní autokláv - Kultivační místnost fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světelná intenzita 250 µmol/m 2 /s; 25 C ± 1 C - Kultivační místnost fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světelná intenzita 250 µmol/m 2 /s; 19 C ± 1 C - Laboratorní sklo a pomůcky plynový nebo lihový kahan, pipety, kyvety (1020 ml), sterilní Petriho misky o průměru 90 mm, parafilm, silné skleněné tyčinky, nylonové filtry (40 a 70 µm) - Etanol (čistý a denaturovaný) - SAVO - Tekuté kultivační médium NLN (Tabulka č. 1 viz příloha) - Roztok diploidizační látky trifluralinu (viz příloha, str. 18) - Redestilovaná voda 2.4.2. Pracovní postup 2.4.2.1. Odběr a sterilizace poupat - Odběr poupat odpovídající velikosti do ledem chlazené kádinky v co nejkratším možném čase, aby se předešlo dehydrataci - Sterilizace poupat 70% etanolem 2 min. nebo 10% SAVO 10 min. při větším riziku kontaminace - Opláchnutí chlazenou sterilní destilovanou vodou 3x po 5 minutách 2.4.2.2. Izolace mikrospor - Macerace poupat ve 20 ml kádince v chlazeném NLN médiu pomocí skleněné tyčinky - Filtrace přes dvojitý nylonový filtr do 20 ml kádinky a doplnění na celkový objem suspenze mikrospor 910 ml - Purifikace mikrospor centrifugací v 10 ml kyvetách při 100 g (1000 RPM) po dobu 10 minut 7

- Odpipetování supernatantu a resuspendování sedimentu v čerstvém chlazeném médiu NLN - Dvě další centrifugace po 5 minutách se stejným postupem 2.4.2.3. Diploidizace in vitro a kultivace mikrospor - Příprava zásobního a pracovního roztoku diploidizační látky trifluralinu (viz příloha) - Resuspendování pročištěných mikrospor v 10 ml roztoku trifluralinu (10 µmol/l) a v 90 mm sterilní Petriho misce uložení na 18 24 hodin v termostatu bez osvětlení při 30 C - Přepipetování suspenze do 10 ml centrifugační kyvety a odstředění při 1000 RPM po dobu 10 minut - Resuspendování sedimentovaných mikrospor v temperovaném kultivačním NLN médiu v 50 ml Erlenmeyerově baňce a upravení hustototy na 10 4 mikrospor na 1 ml média - Kultivace mikrospor v 90 mm Petriho misce uzavřené parafilmem v termostatu při 30 C až do objevení globulárních embryí (10 14 dní) - Přemístění kultur na třepačku (70 RPM) do kultivační místnosti s kontinuálním osvětlením (250 µmol/m 2 /s) a teplotou 25 C ± 1 C, kde dochází k vývoji kotyledonárních embryí (Obrázek č. 7 viz příloha) 2.5. Regenerace celistvých rostlin 2.5.1. Technické vybavení a materiál - Flowbox - Kultivační místnost pro explantátové kultury - Lednice - Autokláv - Kultivační média (Tabulky č. 2, 3 a 4 viz příloha) - Etanol čistý 2.5.2. Pracovní postup - Subkultivace kotyledonárních embryí o délce 47 mm (Obrázek č. 7 viz příloha) na agarové diferenciační (DM) médium v 90 mm plastových Petriho miskách po 20 ks - Umístění kultur v kultivační místnosti při fotoperiodě 16/8 h (den/noc), intenzitě osvětlení 300 µmol/m 2 /s a teplotě 19 C ± 1 C po dobu 814 dnů (Obrázek č. 8) - Odříznutí části děložních lístků (1/2 až 2/3) pro podpoření vývoje vrcholového meristému a subkultivace embryí na regenerační médium (RM) v 90 mm plastových Petriho miskách po 20 ks (Obrázek č. 9) - Subkultivace regenerantů s 12 pravými lístky na RM médium v Erlenmeyerových baňkách - Subkultivace regenerantů ve fázi 35 pravých lístků (Obrázek č. 10) na MS médium (Obrázek č. 11) - Vysazení regenerantů s dobře vyvinutým kořenovým systémem do nesterilních podmínek (Obrázek č. 12). 8

2.6. Dopěstování regenerantů do generativní fáze 2.6.1. Technické vybavení a materiál - Skleník - Jarovizační komora - Výsevní a zahradnický substrát - Previcur - Vícesložkové tekuté hnojivo - Perforovaná fólie - Izolátory na jednotlivé rostliny z netkané textilie - Květináče 8 cm - Kontejnery 19 x 19 cm 2.6.2. Pracovní postup 2.6.2.1. Přesazení regenerantů do nesterilních podmínek - Vyjmutí regenerantů z kultivačních nádob a opláchnutí pod tekoucí vodou a odstranění zbytků agarového média - Ponoření celých rostlinek do 0,15% roztoku Previcuru na 20 minut - Vysazení rostlin do květináčů o 8 cm s výsevním substrátem a zalití roztokem Previcuru - Zakrytí květináčů perforovanou fólií na 710 dní pro vytvoření vlhkého mikroklima a pěstování ve skleníku až do doby aktivního růstu rostlin (1418 dní) 2.6.2.2. Kontrola ploidie regenerantů - Přesné rozlišení haploidních a dihaploidních regenerantů se provádí karyologickou analýzou nebo průtokovou flow-cytometrií. Tyto metody jsou však pracovně i finančně náročné při větším počtu testovaných rostlin. V praxi se využívá především hodnocení rostlin podle morfologie květenství a fertility/sterility květů (Obrázky č. 15, 16, 17). 2.6.2.3. Získání osiva R 1 generace - Jarovizace rostlin v klimatizované komoře po dobu 6 až 8 týdnů - Vysázení jarovizovaných regenerantů do kontejnerů o velikosti 19 x 19 cm, naplněných zahradnickým substrátem - Umístění vysázených rostlin do vytápěného skleníku s přisvětlováním (v zimních měsících) nebo do venkovních izolátorů (Obrázek č. 14) - Provádění pravidelné kontroly zdravotního stavu a preventivní ošetření rostlin proti chorobám a škůdcům (Obrázek č. 13) - Průběžná izolace celých rostlin před počátkem kvetení sáčky z netkané textilie 9

2.7. Časový harmonogram přípravy donorových rostlin pro jarní odběry poupat Měsíc IX. Výsev X. Přepichování Umístění do jarovizace XI. XII. Vyskladnění z jarovizace, přesazení, ošetření proti patogenům I. II. Odběry poupat III. IV. V. 10

2.8. Časový harmonogram vývoje embryí a regenerace celistvých rostlin Dny 1. 2. 3. 4. 5. Založení kultury 24 buněčné útvary Globulární proembrya 10. Srdčitá proembrya (délka 0,20,3 mm) Přenos na třepačku na světlo délka proembryí 0,5 1 mm 15. 20. Pasážování kotyledonárních embryí (délka 48 mm) na diferenciační médium (po 20 30 dnech od založení kultury); kultivace při 1820 C 25. 30. Odříznutí 2/3 kotyledonů, pasážování embryí na regenerační médium RM v Petriho miskách, regenerace vzrostných vrcholů a vývoj pravých lístků 35. 40. Postupná subkultivace regenerantů na MS médium, vývoj kořínků 11

50. Pasážování prýtů ve stádiu 23 vyvinutých pravých lístků na pevné MS médium v Erlenmayerových baňkách, regenerace kořenového systému 60. Postupná výsadba regenerantů s dobře vyvinutým kořenovým systémem do nesterilních podmínek (rašelinový substrát) 70. Jarovizace regenerantů po 1020 dnech od výsadby do substrátu (58 C, 68 týdnů) 80. 12

III) Srovnání novosti postupů Metodika je výsledkem experimentů, které probíhaly v laboratořích, sklenících a na pokusných pozemcích Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. Modifikace a optimalizace postupů spočívala především v pěstování donorových rostlin pro mikrosporové kultury v klimatizovaných komorách s řízeným režimem, aplikaci diploidizační látky trifluralinu přímo do tekutého kultivačního média pro včasnou diploidizaci a v odřezávání 2/3 děložních lístků mikrosporových embryí pro zlepšení přímé regenerace celistvých rostlin. Optimalizovaná metoda produkce DH linií ozimé řepky je úspěšná prakticky u všech genotypů, a proto umožňuje rutinní využití ve výzkumných a šlechtitelských programech. Většina zde zmíněných postupů byla u ozimé řepky aplikována v podmínkách České republiky poprvé a byla publikována v řadě článků (viz seznam literatury). Předkládaná metodika je svého druhu první česky vydanou, komplexní prací na dané téma. IV) Popis uplatnění metodiky Metodika je určena především pro pracovníky výzkumných a šlechtitelských pracovišť, kteří budou její výsledky využívat ve výzkumu a v zemědělské praxi. Metodika bude uplatněna ve šlechtitelských a výzkumných programech, zaměřených na efektivní produkci dihaploidních linií a komponent pro hybridní šlechtění ozimé řepky, časnou selekci specifických znaků, mutace a selekce in vitro (např. na obsah mastných kyselin, rezistenci vůči chorobám, mrazuvzdornost apod.). V) Seznam použité související literatury CEGIELSKATARAS T., TYKARSKA T., SZAŁA L., KURAS M., KRZYMAŃSKI J., 2002. Direct plant development from microsporederived embryos of winter oilseed rape Brassica napus L. ssp. oleifera (DC.) Metzger. Euphytica, 124: 341342. CHEN J.L., BEVERSDORF W.D. (1992): Production of spontaneous diploid lines from isolated microspores following cryopreservation in spring rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breeding, 108: 324327. CHEN Z.Z., SNYDER S., FAN Z.G., LOH W.H. (1994): Efficient production of doubled haploid plants through chromosome doubling of isolated microspores in Brassica napus. Plant Breeding, 113: 217221. CHUONG P.V., DESLAURIERS C., KOTT L.S., BEVERSDORF W.D. (1988): Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus. Canadian Journal of Botany 66: 16531657. COVENTRY J., KOTT L., BEVERSDORF W.D. (1988): Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Department of Crop Science Technical Bulletin OAC Publication 0489. University of Guelph. DUNWELL J.M., THURLING N. (1985): Role of sucrose in microspore embryo production of Brassica napus ssp. oleifera. Journal of Experimental Botany 36: 14781491. EIKENBERRY E. (1994): Chromosome doubling of microsporederived canola using trifluralin. Cruciferae Newsletter, 16: 5152. EVANS D.E., SINGH M.B., KNOX R.B. (1990): Pollen development and application in biotechnology. In Blackmore S., Knox R.B. (eds.) Microspores: Evolution and Ontogeny. Academic Press: California, pp. 309338. 13

FERRIE A.M.R, KELLER W.A. (1995): Microspore culture for haploid plant production. In Gamborg O.L., Phillips G.G (eds.) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: fundamental methods. Springer, Berlin, pp. 155164. FERRIE A.M.R., PALMER C.E., KELLER W.A. (1994): Biotechnological Applications of Haploids. In Shargool P.D., Ngo T.T. Biotechnological Applications of plant cultures. CRC Press, Inc.: Boca Raton, pp. 77110. FERRIE A.M.R., PALMER C.E., KELLER W.A. (1995): Haploid Embryogenesis. In T.A. Thorpe (ed.), In vitro embryogenesis in plants. Kluwer Academic Publisher: Netherlands. pp. 309344. GAMBORG O.L., MILLER R.A., OJIMA K. (1968): Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50: 155158. HANSEN N.J.P., ANDERSEN S.B. (1996): In vitro chromosome doubling potential of colchicine, oryzalin, trifluralin, and APM in Brassica napus microspore culture. Euphytica, 88: 156164. HENDERSON C.A.P., PAULS K.P. (1992): The use of haploidy to develop plants that express several recessive traits using lightseeded canola (Brassica napus) as an example. Theoretical and Applied Genetics 83: 476479. HUANG B., BIRD S., KEMBLE R., SIMMONDS D., KELLER W.A., MIKI B. (1990): Effects of culture density, conditioned medium and feeder cultures on microspore embryogenesis in Brassica napus L. cv. Topas. Plant Cell Reports 8: 594597. ILICGRUBOR K., ATTREE S.M., FOWKE L.C. (1998): Induction of microsporederived embryos of Brassica napus L. with polyethylene glycol (PEG) as osmoticum in a low sucrose medium. Plant Cell Reports 17: 329333. KOTT L.S., POLSONI L., ELLIS B., BEVERSDORF W.D. (1988): Autotoxicity in isolated microspore cultures of Brassica napus. Canadian Journal of Botany 66: 16651670. LICHTER R. (1985): From microspores to rape plants. A tentative way to low glucosinolate strains. In: Sorensen H. (ed.): Advance in the Production and Utilisation of Cruciferous Crops. Martinus Dordecht, Boston, Lancaster, Nijhoff M., Junk W. Publishers, 268277. MATHIAS R., RÖBBELEN G. (1991): Effective diploidization of microsporederived haploids of rape (Brassica napus L.) by in vitro colchicine treatment. Plant Breeding, 106: 82 84. MÖLLERS C., IQBAL M.C.M., RÖBBELEN (1994): Efficient production of doubled haploid Brassica napus plants by colchicine treatment of microspores. Euphytica, 75: 95104. PECHAN P.M., KELLER W.A. (1988): Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus. Physiologia Plantarum 74: 377384. RUDOLF K., BOHANEC B., HANSEN M. (1999): Microspore culture of white cabbage, Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic improvement of nonresponsive cultivars and effect of genome doubling agents. Plant Breeding, 118: 237241. TAKAHATA Y., BROWN D.C.W., KELLER W.A. (1991): Effect of donor plant age and inflorescence age on microspore culture of Brassica napus L. Euphytica 58: 5155. WEBER S., ÜNKER F., FRIEDT W. (2005): Improved doubled haploid production protocol for Brassica napus using microspore colchicine treatment in vitro and ploidy determination by flow cytometry. Plant Breeding, 124: 511513. ZHAO J., SIMMONDS D.H. (1995): Application of trifluralin to embryogenic microspore cultures to generate doubled haploid plants in Brassica napus. Physiologia Plantarum, 95: 304309. 14

VI) Seznam publikací, které předcházely metodice KLÍMA M., VYVADILOVÁ M., KUČERA V. (2004): Production and utilization of doubled haploids in Brassica oleracea vegetables. Horticultural Science (Prague), 31: 119 123. KLÍMA M., VYVADILOVÁ M., KUČERA V. (2008): Chromosome doubling effects of selected antimitotic agents in Brassica napus microspore culture. Czech J. Genet. Plant Breed., 42: 3036. KUČERA V., SCHWARZBACH E., KLÍMA M., VYVADILOVÁ M. (2004): Agronomic performance of doubled haploid lines and pedigreederived lines of winter oilseed rape. Czech J. Genet. Plant Breed., 40: 127133. KUČERA V., VYVADILOVÁ M., KLÍMA M. (2002): Utilisation of doubled haploids in winter oilseed rape (Brassica napus L.) breeding. Czech J. Genet. Plant Breed. 38: 5054 SMÝKALOVÁ I., VĚTROVCOVÁ M., KLÍMA M., MACHÁČKOVÁ I., GRIGA M. (2006): Efficiency of Microspore Culture for Doubled Haploid Production in the Breeding Project Czech Winter Rape. Czech J. Genet. Plant Breed., 42: 5871. VYVADILOVÁ M., ZELENKOVÁ S., TOMÁŠKOVÁ D., KOŠNER J. (1993): Diploidization and cytological control of Brassica napus L. haploids. Rostlinná výroba, 39: 129137. 15

VII) Příloha Tabulka 1. Médium NLN 13 (Lichter 1985) Složka Složka A) navážky [mg. l 1 média] ph 5,86,0 MgSO 4 7 H 2 O 125,0 navážky B) a C) (v mg na 100 ml zás. roztoku) KNO 3 125,0 navážky mikroprvků KH 2 PO 4 125,0 H 3 BO 3 1 000,0 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 500,0 MnSO 4 H 2 O 1 894,0 Lserin 100,0 ZnSO 4 7H 2 O 1 280,0 Lglutamin 800,0 Na 2 MoO 4 H 2 O 25,0 Lglutathion 30,0 CuSO 4 5H 2 O 2,5 myoinositol 100,0 CoCl 2 6H 2 O 2,5 sacharóza 130 000,0 navážky vitaminů zásobní roztoky (po 1 ml na l média) kys. nikotinová 500,0 B) zásobní roztok mikroprvků thiamin ( I.) 50,0 C) zásobní roztoky vitaminů I. IV. pyridoxin 50,0 D) ostatní složky kys. listová * ( II.) 50,0 Ferrous sulfate/chelate solution 1) 10 ml (na l média) biotin * ( III.) 5,0 glycin ( IV.) 200,0 složky I. IV. rozpustit samostatně * rozpustit v 1N KOH 1) firma SIGMA sterilizace filtrací Tabulka 2. Médium MS (Murashige a Skoog 1962) Složka Navážka (mg/l) Složka Navážka (mg/l) NH 4 NO 3 1 650,000 FeSO 4 7 H 2 O 27,800 KNO 3 1 900,000 Na 2 EDTA 2 H 2 O 37,300 CaCl 2 2 H 2 O 440,000 kys. nikotinová 0,500 MgSO 4 7 H 2 O 370,000 pyridoxin HCl 0,500 KH 2 PO 4 170,000 thiamin 0,100 KI 0,830 glycin 2,000 H 3 BO 3 6,200 inositol 100,000 MnSO 4 4 H 2 O 22,300 agar 8 000,000 ZnSO 4 7 H 2 O 8,600 sacharóza 30 000,000 Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,250 kasein 1 000,000 CuSO 4 5 H 2 O 0,025 CoCl 2 6 H 2 O 0,025 ph 5,8 16

Tabulka 3. Diferenciační médium DM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) 2 SO 4 134 KNO 3 3000 NaH 2 PO 4. 2 H 2 O 150 MgSO 4. 7 H 2 O 500 CaCl 2.2 H 2 O 750 FeNaEDTA 40 Mikroelementy H 3 BO 3 3 MnSO 4. 4 H 2 O 10 ZnSO 4. 7 H 2 O 2 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 Vitamíny Thiamin HCl 10 Pyridoxin HCl 1 Kys. nikotinová 1 Myoinositol 100 Aminokyseliny Glutamin 800 Serin 100 Fytohormony 6BAP 0,2 Sacharóza Agar IAA 0,2 20 g 8 g ph 5,8 6,0 17

Tabulka 4. Regenerační médium RM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) NO 3 1650 KNO 3 1900 KH 2 PO 4 170 MgSO 4. 7 H 2 O 370 CaCl 2.2 H 2 O 440 FeNaEDTA 36,7 Mikroelementy H 3 BO 3 6,2 MnSO 4. 4 H 2 O 22,3 ZnSO 4. 7 H 2 O 8,6 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 KI 0,83 Vitamíny Thiamin 0,1 Pyridoxin 0,5 Kys. nikotinová 0,5 Myoinositol 100 Glycin 2 Sacharóza Agar 10 g 10 g ph 5,9 Příprava roztoku trifluralinu - Rozpuštění 33,52 mg trifluralinu v malém množství acetonu ve sterilních podmínkách ve flowboxu - Konečné rozpuštění v dimetylsulfoxidu (DMSO) a upravení koncentrace roztoku na 10 mmol/l - Uložení zásobního roztoku ve sterilních Erlenmeyerových baňkách při teplotě 22 C - Příprava pracovního roztoku o koncentraci 10 µmol/l přidáním NLN média těsně před použitím pro mikrosporové kultury 18

VIII) Přílohy Tabulka 1. Médium NLN 13 (Lichter 1985) Složka Složka A) navážky [mg. l 1 média] ph 5,86,0 MgSO 4 7H 2 O 125,0 navážky B) a C) (v mg na 100 ml zás. roztoku) KNO 3 125,0 navážky mikroprvků KH 2 PO 4 125,0 H 3 BO 3 1 000,0 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 500,0 MnSO 4 H 2 O 1 894,0 Lserin 100,0 ZnSO 4 7H 2 O 1 280,0 Lglutamin 800,0 Na 2 MoO 4 H 2 O 25,0 Lglutathion 30,0 CuSO 4 5H 2 O 2,5 myoinositol 100,0 CoCl 2 6H 2 O 2,5 sacharóza 130 000,0 navážky vitaminů zásobní roztoky (po 1ml na l média) kys. nikotinová 500,0 B) zásobní roztok mikroprvků thiamin ( I.) 50,0 C) zásobní roztoky vitaminů I. IV. pyridoxin 50,0 D) ostatní složky kys. listová * ( II.) 50,0 Ferrous sulfate/chelate solution 1) 10 ml (na l média) biotin * ( III.) 5,0 glycin ( IV.) 200,0 složky I. IV. rozpustit samostatně * rozpustit v 1N KOH 1) firma SIGMA sterilizace filtrací Tabulka 2. Médium MS (Murashige a Skoog 1962) Složka Navážka (mg/l) Složka Navážka (mg/l) NH 4 NO 3 1 650,000 FeSO 4 7H 2 O 27,800 KNO 3 1 900,000 Na 2 EDTA 2H 2 O 37,300 CaCl 2 2H 2 O 440,000 kys. nikotinová 0,500 MgSO 4 7H 2 O 370,000 pyridoxin HCl 0,500 KH 2 PO 4 170,000 thiamin 0,100 KI 0,830 glycin 2,000 H 3 BO 3 6,200 inositol 100,000 MnSO 4 4H 2 O 22,300 agar 8 000,000 ZnSO 4 7H 2 O 8,600 sacharóza 30 000,000 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,250 kasein 1 000,000 CuSO 4 5H 2 O 0,025 CoCl 2 6H 2 O 0,025 ph 5,8 19

Tabulka 3. Diferenciační médium DM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) 2 SO 4 134 KNO 3 3000 NaH 2 PO 4. 2 H 2 O 150 MgSO 4. 7 H 2 O 500 CaCl 2.2 H 2 O 750 FeNaEDTA 40 Mikroelementy H 3 BO 3 3 MnSO 4. 4H 2 O 10 ZnSO 4. 7 H 2 O 2 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 Vitamíny Thiamin HCl 10 Pyridoxin HCl 1 Kys. nikotinová 1 Myoinositol 100 Aminokyseliny Glutamin 800 Serin 100 Fytohormony 6BAP 0,2 Sacharóza Agar IAA 0,2 20 g 8 g ph 5,8 6,0 20

Tabulka 4. Regenerační médium RM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) NO 3 1650 KNO 3 1900 KH 2 PO 4 170 MgSO 4. 7 H 2 O 370 CaCl 2.2 H 2 O 440 FeNaEDTA 36,7 Mikroelementy H 3 BO 3 6,2 MnSO 4. 4 H 2 O 22,3 ZnSO 4. 7 H 2 O 8,6 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 KI 0,83 Vitamíny Thiamin 0,1 Pyridoxin 0,5 Kys. nikotinová 0,5 Myoinositol 100 Glycin 2 Sacharóza Agar 10 g 10 g ph 5,9 21

Obrázek 1. Vývojová stádia mikrospor (1 hod. od založení kultury) Detail zobrazuje jádra mikrospor, zřetelná ve formě tmavších prstenců M mladé stádium 0 optimální stádium S starší stádium Šipka označuje buňku po prvním mitotickém dělení Obrázek 2. Vývojová stádia mikrospor (24 hod. od založení kultury) 22

Obrázek 3. Detail dělících se buněk (označeny šipkou) - 24 hod. od založení kultury Obrázek 4. Časné globulární proembryo (6 dní od založení kultury) 100 µm 23

Obrázek 5. Kultura ve stádiu globulárních až torpédovitých embryí (18 dní od založení kultury) 10 mm Obrázek 6. Kultura ve stádiu globulárních až kotyledonárních embryí (20 dní od založení kultury) 5 mm 24

Obrázek 7. Kultura ve stádiu, kdy se provádí subkultivace kotyledonárních embryí (25 dní od založení kultury) 5 mm Obrázek 8. Embrya po 12 dnech na DM médiu, před ořezáváním kotyledonů 10 mm 25

Obrázek 9. Embrya na RM médiu po ořezání 2/3 kotyledonů 10 mm Obrázek 10. Regeneranty na RM médiu 18 dní po odřezání kotyledonů Průměr Petriho misky 90 mm 26

Obrázek 11. Regeneranty na MS médiu (60 dní od založení kultury) Obrázek 12. Regeneranty 8 dní po vysázení do půdního substrátu (80 dní od založení kultury) 27

Obrázek 13. Jarovizované regeneranty před výsadbou do kontejnerů Obrázek 14. Dihaploidní rostliny ve skleníku 7 měsíců od založení kultury 28

Obrázek 15. Fertilní květ řepky ozimé Obrázek 16. Sterilní květ řepky ozimé 29

Obrázek 17. Terminální květenství fertilní a sterilní rostliny řepky ozimé 30