ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE TEZE K DISERTAČNÍ PRÁCI

České vysoké učení technické v Praze Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra přírodovědných oborů Markéta Koplová Vybrané fyzikální a biologické vlastnosti biokompatibilních materiálů pro implantáty Doktorský studijní program: Biomedicínská a klinická technika Studijní obor: Biomedicínská a klinická technika Teze disertace k získání akademického titulu "doktor", ve zkratce "Ph.D." Kladno, září 2016

Disertační práce byla vypracována v prezenční a kombinované formě doktorského studia na katedře přírodovědných oborů Fakulty biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze. Uchazeč: Ing. Markéta Koplová Katedra přírodovědných oborů ČVUT v Praze, Fakulta biomedicínského inženýrství nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno Školitel: prof. Ing. Miroslav Jelínek, DrSc. Katedra přírodovědných oborů ČVUT v Praze, Fakulta biomedicínského inženýrství nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno Oponenti:......... Teze byly rozeslány dne:... Obhajoba disertace se koná dne... v hod. před komisí pro obhajobu disertační práce ve studijním oboru Biomedicínská a klinická technika v zasedací místnosti č.... Fakulty biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze. prof. Ing. Peter Kneppo, DrSc. předseda oborové rady Fakulta biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno Bližší informace o obhajobě disertační práce jsou k dispozici na sekretariátu děkana FBMI, ČVUT v Praze, nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno.

Obsah 1 Úvod a současný stav... 1 2 Cíle disertační práce... 2 3 Teoretická a rešeršní část: Fyzikální analytické metody měření tenkých vrstev... 2 3.1 Infračervená spektroskopie... 2 3.1.1 Interferometrický spektrometr... 3 3.2 Ramanova spektroskopie... 4 3.3 Zkoumané biokompatibilní tenké vrstvy... 5 4 Experimentální výsledky: Fyzikální vlastnosti tenkých vrstev... 5 4.1 Studie tenkých vrstev TiO2 sloužící pro pokrývání uretrálního katetru... 5 4.2 Hydroxyapatitový aniont... 7 4.3 Poměr sp 2 a sp 3 vazeb v DLC... 8 4.4 T pík v DLC filmech... 9 4.5 DLC vrstvy dopované chrómem... 10 4.6 Určování fononových módů v LiNbO3... 12 4.7 Polykrystalické vrstvy LiNbO3... 15 5 Teoretická a rešeršní část: Biologické vlastnosti tenkých vrstev... 18 5.1 Pracovní postup při testování na tenkých vrstvách... 18 6 Experimentální výsledky: Bakteriální testování tenkých vrstev... 19 6.1 DLC a UNCD... 19 6.2 DLC - Ag na podložkách technického PEEKu... 21 6.3 DLC dopované stříbrem pro vývoj antibakteriálních povlaků... 22 7 Závěr... 25 Seznam literatury v tezi... 28 Seznam prací k dizertaci... 30 Resumé... 31

1 Úvod a současný stav Biokompatibilita je definována jako snášenlivost látek, především materiálů v biologickém prostředí. Biokompatibilní materiál se posuzuje podle interakce s prostředím. Důležité je, aby materiál neovlivňoval například koagulace, nevyvolával zánětovou reakci a neuvolňoval potenciálně toxické látky. V pracovní skupině zabývající se oborem Pulsní laserové depozice (PLD) byly v posledních letech studovány látky jako oxid titaničitý (TiO 2), hydroxyapatit (HA), hydroxyapatit se stříbrem (HA-Ag), lithium niobát (LiNbO 3), diamantu podobný uhlík (DLC) a DLC dopované chromem (Cr) a stříbrem (Ag). Na těchto látkách se měří řada vlastností, které jsou navzájem svázány, jako je topologie, krystalická struktura, měření drsnosti a tloušťky vrstev, složení, vazby (FTIR, Ramanova spektroskopie), mechanické vlastnosti (adheze, mikrotvrdost) nebo kontaktní úhel, biokompatibilita in-vitro a in-vivo, a případně další vlastnosti (optické, elektrické, tepelné). Jednotlivé tenké vrstvy jsou používány pro vývoj nového typu uretrálního katetru na bázi krystalického TiO 2, nanokompozitní vrstvy HA a HA-Ag pro tkáňové inženýrství, dopované vrstvy DLC pro pokrytí nového typu umělých srdečních chlopní, protéz a umělých tkaninových cévních náhrad a aplikace pro biosenzory a senzory (LiNbO 3). Jedním ze zmíněných důležitých parametrů měření je studium vazeb. Infračervená i Ramanova spektroskopie jsou experimentální techniky, které vedle kvantitativní a kvalitativní analýzy hrají důležitou roli při výzkumu molekulové dynamiky, chemických vlastností molekul, vlivu prostředí na studované molekuly a v mnoha jiných oblastech. Tvoří nezbytnou součást výzkumu, usnadňují analýzu a přinášející nové poznatky o složení a strukturách zkoumaných vzorků. Velké uplatnění si našly také při analýze vzorků připravených PLD. Své využití si našly ve výzkumu biomateriálů nebo biosenzorů. Postup, jak účinně předcházet bakteriálním infekcím ve zdravotnických zařízeních, se nabízí pokrýváním zdravotnických implantátů tenkými vrstvami, které vykazují baktericidní vlastnosti. Takto pokryté tenké vrstvy mohou zabíjet bakterie vyskytující se v blízkosti jejich povrchu a bránit tak adhezi bakterií. Antibakteriální vlastnosti mohou mít např. DLC vrstvy a vrstvy dopované stříbrem či chromem. DLC vrstvy jsou vhodné pro výrobu materiálů použitelných v lidském těle, protože splňují požadavky kladené na testy biokompatibility v souladu s ISO 10993-1. Výhodou DLC vrstev je vysoká pevnost a inertnost. Díky svým vlastnostem, které jsou do určitého směru jedinečné, by se jejich uplatnění mohlo najít v kardiologii, ortopedii, oftalmologii, neurologii, nefrologii i v oblasti potahování lékařských a chirurgických nástrojů ochranným povlakem [1]. Antibakteriální vlastnosti DLC filmů byly studovány pomocí dvou reprezentativních bakterií běžně používaných v antimikrobiálním testování, tedy kmenem Bacillus subtilis a Escherichia coli. 1

2 Cíle disertační práce Cílem disertační práce bylo studium, analýza a vyhodnocení tenkých vrstev především biokompatibilních materiálů pro biomedicínské aplikace jak z hlediska fyzikálních tak biologických metod. V práci se zabývám převážně studiem chemických vazeb anebo zjišťováním vibračních kolektivních módů pomocí infračervené a Ramanovy spektroskopie. Obě metody patří do skupiny nedestruktivních analytických metod. Zkoumaný vzorek není analýzou nijak poškozen a poskytuje informaci o svém složení. Získané hodnoty vibračních energií souvisí s pevností chemických vazeb a také s molekulovou geometrií a hmotnostmi jader, tedy s molekulovou strukturou. Jsou založeny na dvou fyzikálně rozdílných jevech (absorpci respektive nepružném rozptylu). Obě umožňují studovat přechody mezi vibračními stavy molekul v základním elektronovém stavu. Jejich společným rysem a hlavním přínosem je možnost získání poměrně detailní strukturní informace, která je často jinými metodami obtížně zjistitelná. Druhá část práce byla zaměřena na studium vybraných biologických vlastností, konkrétně na testování antibakteriální účinnosti biokompatibilních tenkých vrstev. Testovaly se především DLC vrstvy, ať už samotné nebo dopované stříbrem a také speciální DLC vrstvy, Ultra-nano-krystalické diamantové (UNCD) vrstvy, vyrobené v Univerzity of Kassel. Z hlediska testování antibakteriální účinnosti na tenkých vrstvách byl studován růst bakteriálních kultur při styku s povrchem tenké vrstvy. Vrstvy vykazující antibakteriální vlastnosti mohou účinně bránit infekčním onemocněním a komplikacím po implantaci ať už kloubních náhrad, šroubů nebo srdečních chlopní a stentů. Pro studium účinnosti jsme si vybrali zástupce dvou kmenů bakterií, které jsou rozděleny podle Gramova barvení na grampozitivní (Bacillus subtilis) a gramnegativní (Escherichia coli). 3 Teoretická a rešeršní část: Fyzikální analytické metody měření tenkých vrstev Z hlediska analýzy tenkých vrstev připravených metodou PLD se využívají techniky FTIR a Ramanovy spektroskopie pro zkoumání složení a výskytu látek na povrchu vzorků. Umožňují studovat přechody mezi vibračními stavy molekul a získávat poměrně detailní strukturní informace zkoumaných vzorků. 3.1 Infračervená spektroskopie Podstatou IČ spektroskopie je interakce infračerveného záření s hmotou. V případě pohlcení fotonu studovanou hmotou hovoříme o absorpční spektroskopii a v případě vyzáření fotonu o emisní spektroskopii. Nejpoužívanější jednotkou v infračervené spektroskopii je vlnočet, který je svázán s vlnovou délkou (ṽ = 1/λ) a s frekvencí (ṽ = v/c). Infračervené záření je 2

elektromagnetické záření v rozsahu vlnočtů 12 500 až 20 cm -1 a vlnových délek 800 nm až 0,5 mm. Uvedený rozsah infračerveného záření je nutno brát s určitou rezervou, v různých literaturách se mohou lišit. [2] Infračervené záření tedy navazuje na záření viditelné na jedné straně a na záření mikrovlnné na straně druhé. Podle vžité konvence infračervenou spektroskopii dělíme podle vlnových délek záření na oblast dalekou (FIR far infrared), střední (MIR middle infrared) a blízkou (NIR near infrared). Energie fotonů infračerveného záření (0,0012-1,63 ev) není dostačující pro excitaci elektronů v molekulových orbitalech, ale je dostatečná ke změně vibračního stavu (z klasického pohledu ke zvětšení amplitudy vibrace molekuly) či rotačního stavu molekuly (ke zrychlení rotace molekuly). Molekuly jsou tvořeny atomy, které jsou spojeny vazbami a mohou různými způsoby vibrovat.[3] Obecně existují 3 druhy pohybů, které mohou molekuly vykonávat translace, rotace a vibrace. Při interakci IČ záření s molekulou bude tedy absorbováno pouze záření, jehož energie bude odpovídat rozdílu mezi jednotlivými vibračními hladinami. Pokud aktuální frekvence zdroje odpovídá určitému energetickému rozdílu hladin, dojde k absorpci a v IČ spektru se objeví absorpční pás. IČ spektrometr tak umožňuje měřit optické vlastnosti vzorků v závislosti na vlnočtu. IČ spektrum látky představuje závislost transmitance T, absorbance A na vlnočtu nebo na vlnové délce. Oblasti absorpcí označujeme jako absorpční pásy, které obvykle charakterizujeme polohou (vlnočtem) maxima resp. minima a relativní intenzitou [2, 3]. Infračervené spektrum má z hlediska kvalitativní analýzy látek dvě významné vlastnosti. První z nich je, že prakticky neexistují dvě sloučeniny, které by měly zcela stejné infračervené spektrum. Pro identifikaci dané látky se využívá tzv. knihovny spekter. Druhou vlastností je, že se jednotlivé funkční skupiny projevují ve spektru podobně, a tak lze rozborem infračerveného spektra zjistit přítomnost jistých funkčních skupin v molekule a vyloučit výskyt skupin jiných [2, 3]. 3.1.1 Interferometrický spektrometr Zdrojem záření v interferometrických spektrometrech je stejně jako v disperzním přístroji keramická destička, která při zahřátí emituje spojité záření v infračervené oblasti. Obr. 1. Schéma Michalsonova interferometru (červenou linií ohraničeny jeho součásti). 3

Na rozdíl od disperzního přístroje obsahuje tento typ spektrometru interferometr pracující nejčastěji na principu Michelsonova interferometru, jehož hlavními součástmi jsou dělič paprsků, pohyblivé a pevné zrcadlo (Obr. 1.). Pro střední a dalekou infračervenou oblast se používá jako dělič paprsků polopropustné zrcadlo. Jelikož je na vstupu polychromatické záření, je signál opouštějící interferometr a dopadající na detektor součtem všech konstruktivních a destruktivních interferencí při všech možných frekvencích. Z jednoho pohybu zrcadla je získán jeden interferogram, který se Fourierovou transformací převádí z časové škály do frekvenční nebo vlnočtové na spektrum odpovídající jednomu skenu. [4] Přístroj pracuje jako jednopaprskový. Pro zjištění transmitance, resp. absorbance musíme nejdříve získat vlnočtovou závislost detekovaného signálu pro tok záření dopadající na vzorek (tzv. pozadí, angl. background), poté stejnou závislost pro tok prošlý zkoumaným vzorkem. Poměr těchto hodnot teprve vede ke spektru, tj. vlnočtové závislosti transmitance, resp. absorbance. Nejběžněji používanými detektory jsou pyroelektrické detektory deuterovaný triglycinsulfát (DTGS). Dražší přístroje jsou vybaveny citlivějším mercury-cadmium-telluride (MCT) detektorem, který vyžaduje chlazení kapalným dusíkem. 3.2 Ramanova spektroskopie U Ramanovy spektroskopie se měří rozptýlené záření, které vzniká interakcí monochromatického záření z viditelné oblasti s molekulami vzorku za současné změny jejich vibračních a rotačních stavů. Zvolené monochromatické záření nesmí být absorbováno vzorkem. Intenzita rozptýleného záření závisí na změnách polarizace během vibračních pohybů molekul. Rozptyl může být Rayleighův elastická (pružná) srážka fotonu s molekulou, foton změní směr, ale nepředá molekule E (má stejnou λ). Nebo rozptyl Ramanův neelastická srážka fotonu s molekulou, foton interaguje s molekulou, ta pak vyšle foton s menší E (tedy větší λ). Protože část E byla spotřebována na zvýšení vibrační energie E VIB molekuly, označujeme tento jev jako Stokesovu linii. Méně pravděpodobný je případ, kdy foton převezme vibrační energii E VIB od molekuly, vyslaný foton má pak větší E (a kratší λ), tomuto jevu říkáme anti-stokesova linie. Jde o rozdíly vibrační energie E VIB nebo rotační energie E ROT a získáme obdobné informace jako u infračervené absorpční spektrometrie. [5, 6] V Ramanově spektru příslušejí nejintenzivnější pásy vibracím nepolárních vazeb se symetrickým rozdělením náboje (největší změny polarizovatelnosti), zejména C=C, C-C, C C, C-S, S-S vazeb, které mají v IČ spektroskopii málo intenzivní absorpci. V IČ spektru jsou intenzivní vibrace, které příslušejí silně polárním skupinám (větší změna dipólového momentu). Pro molekuly se středem symetrie platí pravidlo vzájemného vyloučení: vibrace aktivní v Ramanově spektru jsou neaktivní v IČ spektru a naopak. Takže například CO 2: ν s změna polarizovatelnosti Ramanova spektrometrie; ν as změna dipólového momentu infračervená spektrometrie. 4

Intenzita rozptýleného záření závisí na změnách polarizace během vibračních pohybů molekul. Analytickým výstupem je spektrum znázorňující závislost mezi Ramanovým posunem (Raman shift, jednotka vlnočet [cm -1 ]) a intenzitou tohoto rozptýleného záření. [5, 6] 3.3 Zkoumané biokompatibilní tenké vrstvy Níže uvedené výsledky pojednávají o jednotlivých zkoumaných tenkých vrstvách, které mohou být v biomedicíně používány jako materiály vhodné například k pokrývání nového typu uretrálního katetru na bázi krystalického TiO 2. Nanokompozitní vrstvy HA a HA-Ag jsou využity pro tkáňové inženýrství, dopované vrstvy DLC pro pokrytí nového typu umělých srdečních chlopní, protéz a umělých tkaninových cévních náhrad a LiNbO 3 je využíván jako materiál k aplikacím pro biosenzory a senzory. Každá vrstva má své vlastní specifické vlastnosti. Zabývám se převážně studiem chemických vazeb nebo zjišťováním vibračních kolektivních módů. 4 Experimentální výsledky: Fyzikální vlastnosti tenkých vrstev 4.1 Studie tenkých vrstev TiO2 sloužící pro pokrývání uretrálního katetru Cílem bylo pomocí PLD vytvořit při nízkých teplotách krystalické (nejlépe anatasové) TiO 2 tenké vrstvy, kterými by bylo možné potáhnout vnitřní povrch plastových trubiček používaných pro katetry. Pomocí IČ spektroskopie se měřily TiO 2 vrstvy deponované na (111) Si podložkách, rozměr 1x1 cm. Byl použit FTIR spektrometr NICOLET 6700. Vzorky byly měřeny na reflexi v daleké infračervené oblasti (600-100 cm -1 ), která je vhodná pro zkoumání vibrace mřížek krystalů anorganických sloučenin. Měřilo se pomocí detektoru DTGS Poly s využitím nástavce SEAGULL s měnitelným úhlem. Většinou byl použit úhel 50 a rozlišení 8 cm -1 při 256 skenech, za použití TURBO módu, při maximální svítivosti infračerveného zdroje. Měřili se vzorky krystalické (anatas, rutil, brookit) nebo amorfní struktury. Snahou bylo na spektrech pozorovat vrcholy (píky), které by se pak z hlediska kvalitativní informace daly srovnávat s knihovnami spekter. Naměřená spektra pak byla porovnávána s knihovnou poskytnutou společností NICOLET HR Inorganics I. Minerals, které mají k dispozici spektra měřená ve střední infračervené oblasti, takže spektra končí ve 400 cm -1. Bohužel krystalické fáze TiO 2 mají píky i pod 400 cm -1, což ve střední infračervené oblasti nelze vidět. Na Obr. 2. vidíme spektra anatasu u vzorku č. 35 měřeného z více stran po otočení o 90 (35a, 35b, 35c) s píky okolo 488 cm -1 v porovnání s knihovnou spekter (pík v 492.07 cm -1 ). Spektra rutilu (Obr. 3.) u vzorku č. 26 s vrcholy v 513.04 cm -1 a 496.69 cm -1 (knihovna má píky v 532.76 cm -1 a v 406.16 cm -1 ). Spektra brukitu (Obr. 4.) u vzorků č. 53. Má nižší píky okolo 370 cm -1 a vyskytují se zde také píky okolo 567 cm -1. Knihovna uvádí píky v 531.47 cm -1 a 411.84 cm -1. Poslední zde máme spektra amorfních vzorků TiO 2 č. 74 a č. 75 (Obr. 5.). Můžeme vidět jasný 5

rozdíl oproti krystalickým fázím TiO 2. V oblasti pod 400 cm -1 nejsou v amorfních spektrech žádné zřetelné píky a to je pro nás určující. Obr. 2. Spektrum anatasu vzorku TiO 2 č. 35 a spektrum z knihovny spekter HR Inorganics I. - Minerals. Obr. 3. Spektrum rutilu u vzorku TiO 2 č. 26 v porovnání se spektrem z HR Inorganics I. - Minerals. Obr. 4. Spektrum brukitu vzorku TiO 2 č. 53 a spektrum z HR Inorganics I. - Minerals. 6

4.2 Hydroxyapatitový aniont Obr. 5. Spektra amorfních struktur vzorků TiO 2 č. 74 a 75. Pro měření vzorků byla použit spektrometr NICOLET 6700. Při měření jsme použili detektor DTGS KBr pro střední IČ oblast a nástavec SEAGULL vhodný pro reflexi. Nejprve jsme hydroxyapatit (HA) měřili při 128 skenech a rozlišení 4 cm -1. Později při 64 skenech a rozlišení 4 cm -1. Zajímaly nás především krystalické fáze HA, tedy vzorky č. 49, 54 a 59, připravované při teplotě 600 C. Vzorek č. 49 byl čistý HA a vzorek č. 59 byl HA se stříbrem přidaným v poměru počtu pulzů do terče HA:Ag (1:3). Pro porovnání jsme vybrali vzorky č. 49 (HA čistý) a 59 (HA se stříbrem). Je nutno říci, že IČ spektroskopie není přímo vhodná metoda pro detekci stříbra, vhodnější je spíše rentgenová difrakce (XRD). Pásy se stříbrem a bez stříbra se od sebe moc neliší. Lehce se mění poměr pásů, díky projevu na aniontu. Rozdíl je také v zešikmení spektra u vzorku č. 59 se stříbrem z důvodu většího rozptylu infračerveného záření u kratších vlnových délek. Povrch je méně pravidelný než u HA. Charakteristický pás HA (obr. 6.) můžeme ve spektru pozorovat od 1200 cm -1 do 800 cm -1, kde se nachází PO 4-3 ohýbací (bending) a natahovací (stretching) vibrace [7], stejně jako fosfátové pásy v 650 cm -1 a 550 cm -1 [8]. Dále můžeme na obou vzorcích pozorovat v oblasti okolo 3500 cm -1 stretch deformaci (OH - ) [9], pod 3000 cm -1 valenční vibrace CH alyfatické, které by se ve spektrech neměly vůbec vyskytovat. Pravděpodobně jsou zde přítomny díky drobnému znečištění a manipulaci se vzorky. V detailu (c) subtrakce (odečítání), okolo 1030 cm -1 a 990 cm -1 pozorujeme pásy, které přiřazujeme β-tcp (beta-tricalcium fosfát) fázi. V detailu (c) subtrakce vidíme přítomnost Ag 3PO 4, pás odpovídá fosfátu stříbra okolo 1034 cm -1. To můžeme pozorovat ve spektrech se stříbrným aniontem, ale ve spektrech s čistým HA nepozorujeme tak vysoký vrchol [8]. Karbonová skupina absorbuje ve 2400 cm -1, kdy můžeme vidět přítomný CO 2 z prostředí a dále pak okolo 670 cm -1, lépe pozorovatelný v detailu (d). Pod 1600 cm -1 je zde lehká přítomnost CO 3-2. V oblasti okolo 640 cm -1 můžeme pozorovat drobnou změnu, která může ukazovat na přítomnost aniontu stříbra. 7

Obr. 6. FTIR spektra hydroxyapatitu se stříbrem HA+Ag (a), čistého hydroxyapatitu HA (b), v detail (c) a (d) vidíme výslednou subtrakci HA a HA-Ag. 4.3 Poměr sp 2 a sp 3 vazeb v DLC Použili jsme FTIR a Ramanovu spektroskopii k analýze vzorků DLC na Si podložkách připravených metodou PLD. Princip FTIR spočívá v tom, že část dopadajícího infračerveného záření je absorbována vzorkem a způsobuje změny v rotačních a vibračních stavech molekuly v důsledku změn dipólového momentu. Pokud nenastanou žádné změny dipólového momentu, tak molekula nepohlcuje žádné světlo a infračervené záření je neaktivní. V Ramanově spektroskopii je intenzita rozptýleného záření nezávislá na změnách dipólového momentu molekuly, záleží však na změně polarizace během vibračních pohybů molekul. Ve FTIR spektrech se nevyskytly žádné viditelné vrcholy sp 2 nebo sp 3 vazeb. Vzhledem k nedostatku vody v DLC vzorcích, molekuly nezměnily rotační a vibrační stavy. Získali jsme jen Ramanova spektra DLC vzorků a mohli jsme určovat poměr sp 2 a sp 3 pásů. Provedli jsme měření pomocí Thermo Scientific DXR Raman Microscope s laserem o vlnové délce 532 nm s prostorovým rozlišením 1 µm a hloubkovým rozlišením 2 µm. Zvětšení objektivu je 50x. Pro analýzu jsme použili spektra softwaru Omnic a softwaru OriginLab. Spektra jsme fitovali pomocí Voigtovi funkce a Breit-Wigner-Fano funkce. Jelikož je vlnová délka laseru v oblasti viditelného světla, museli jsme použít nepřímé metody pro určování poměru sp 2 a sp 3 vazeb. Ramanova spektra vzorku č. 8 lze vidět na Obr. 7. a Obr. 8.. Vhodná fitovací křivka (Voigtova funkce a Breit-Wigner-Fano funkce) závisí na symetrii spektra. Voigtovou funkcí jsme fitovali dva vrcholy, které lze nalézt ve spektru DLC tedy D vrchol (1340 cm -1 ) a G vrchol (1580 cm -1 ). G vrchol je způsoben stretching (natahovací) vibracemi mezi libovolným párem uhlíků obsahující sp 2 vazby, ať už v C=C řetězci nebo aromatickém kruhu. Tento vrchol se vyskytuje v každé molekule obsahující vazby mezi sp 2 orbitaly uhlíku. D pás je 8

způsoben dýchacími (breathing) vibracemi do kruhu uspořádaných uhlíků obsahujících sp 2 vazby. Proto bylo nutné použít nepřímé metody k určování sp 2 /sp 3 poměru [10]. Metoda stanovení tohoto poměru používá hodnotu celé šířky v polovině maxima (FWHM) G pásu. Pro tuto metodu jsme použili Voigtovu fitovací funkci (obr. 8.). Rovnice pro odhad sp 3 obsahu je sp 3 = 2,05 + 1,90 10-2 W 3,01 10-5 W 2 ± 0,08 (4.1) kde W je FWHM G pásu. Tato rovnice (4.1) platí pro měření Ramanových spekter laserem o vlnové délce 514 nm a pro DLC vzorky deponované při pokojové teplotě. Naše spektra byla měřena laserem o vlnové délce 532 nm, a tak bylo nutné přepočítat FWHM (532 nm) G pásu na FWHM (514 nm). FWHM (514) = FWHM (λ) + 0,21 (514 λ) (4.2) kde FWHM (514) a FWHM (λ) se vztahuje k hodnotě celé šířky v polovině maxima, měřeno při vlnové délce 514 nm a vlnové délce použitého laseru, v našem případě 532 nm. Kombinací rovnic (4.1) a (4.2), je možné z Ramanova spektra vypočítat obsah sp 3 vazeb v DLC neobsahujícím vodík H [11]. Obr. 7. Vzorek č. 8 Breit-Wigner-Fano fitovací funkce. Obr. 8. Vzorek č. 8 Voigtova fitovací funkce. 4.4 T pík v DLC filmech Jak již bylo zmíněno výše, pokud nedochází ke změně v rotačních a vibračních stavech molekuly v důsledku změn dipólového momentu, molekula nepohlcuje žádné světlo a IČ záření je neaktivní. Díky nedostatku vody v DLC vzorcích připravených metodou PLD, není vhodné analyzovat vrstvy pomocí FTIR spektroskopie, ale Ramanovy spektroskopie. Nepoužili jsme však Ramanovu spektroskopii ve viditelné oblasti, ale v UV oblasti o vlnové délce 325 nm. Měření v UV oblasti by mělo lépe určit zastoupení sp 2 a sp 3 vazeb ve vrstvě a na spektrech by se měl vyskytovat takzvaný T pík, který jsme zatím v předchozích měřeních nepozorovali. Ramanovská analýza laserové excitace vlnových délek v UV oblasti záření (UV Raman) byla provedena pomocí ReniShaw InVia REFLEX. Vlnová délka HeCd laseru byla 325 nm, s rozlišením 2 µm a sílou 3 mw na povrchu vzorku. Byla 9

použita technika zpětného rozptylu. K vyhodnocení naměřených spekter jsme využili software OriginLab. Spektra byla fitována pomocí Gaussovy funkce. Na rozdíl od Ramanových spekter DLC vrstev, získaných excitací zdroje ve viditelné oblasti, kde je přítomen D a G pík, je v tomto případě (UV oblasti) odhadnut obsah sp 3 vazeb z poměru intenzit G píku a nového T píku po jejich fitování pomocí Gaussovy funkce. T pík se objevuje okolo 1100 cm -1 a množství sp 3 uhlíkových atomů závisí na poměru intenzity stejně jako na pozicích obou, T a G píku (Obr. 9.) [10]. Pouze vzorky připravené s vyšší laserovou hustotou energie mezi 10 a 14 J cm -1 během pulzní laserové depozice zobrazují T pík ve spektrech, které korespondují se střední vibrační DOS sítí obsahující σ vazby [10]; v těchto případech byl stanoven obsah sp 3 v rozmezí od 70-75 %. DLC filmy byly zcela amorfní bez přítomnosti vodíku. Byly složeny z sp 2 a sp 3 hybridizovaných uhlíkových atomů v různém poměru na základě depozičních podmínek. Nejlepších výsledků dosahovaly DLC filmy připravené metodou PLD s iontovým bombardováním, kdy byl nejvyšší obsah sp 3 vazeb okolo 75 %. Obr. 9. UV Ramanovo spektrum DLC vzorků deponovaných s různou laserovou hustotou energie. 4.5 DLC vrstvy dopované chrómem Výborné vlastnosti DLC vrstev, vhodné pro pokrývání biologických implantátů nebo kloubních protéz, zde již byly zmiňovány. Ke zlepšení přilnavosti vrstev k podkladu však velice významně přispělo přidání chromu do vrstev. Připravené vrstvy byly studovány z hlediska struktury a složení pomocí Ramanovy spektroskopie, kterou byly určovány vazby C a Cr. S narůstajícím podílem chromu se ve spektru zvyšuje poměr zastoupení intenzit D a G pásů. Pro samotnou Ramanovu analýzu byl použit přístroj Renishaw Invia s HeCd laserem o vlnové délce 488 nm, průměr laserového svazku (spotu) 2 µm o síle 4 mw na povrchu vzorku. Fitování Ramanova spektra zahrnovalo korekci základní linie (baseline) pomocí polynomiální funkce druhého řádu a fitování polohy D a G píku použitím Lorenzovi funkce. Ramanova spektroskopie byla použita k charakterizaci kvalitativní analýzy Cr dopovaných DLC vrstev s různým poměrem zastoupení chromu (Obr. 10.). 10

Obr. 10. Ramanova spektra DLC-Cr s různým poměrem zastoupení chromu. Ramanova spektroskopie excituje viditelné fonony právě při vlnové délce 488 nm, při které jsou citlivější sp 2 vazby zastoupeny v kruhu mnohem silnější než sp 3 vazby. [10] Ramanovo spektrum zobrazuje dva - D a G pás grafitu. Oba tyto pásy ukazují přítomnost neuspořádaných sp 2 vazeb v materiálu. D a G pásy jsou obvykle přiřazovány k zónově centrovaným fononům E 2g symetrie a K-bodovým fononům A 1g symetrie.[12] G mód je přisuzován stretching (natahovací) vibraci některé z párů sp 2 vibrace, tento mód se vyskytuje okolo 1580 cm -1. D mód je přisuzován breathing (dýchací) vibraci pouze uspořádaných sp 2 vazeb v kruhu, ne v řetězcích. D pás vrcholu DLC-Cr vrstvy byl umístěn okolo 1340 cm -1 zatímco G pás byl centrován okolo 1530 cm -1. Data ze studie Ramanovy spektroskopie zahrnující jak hodnotu celé šířky v polovině maxima (FWHM) intenzit I D a I G pásů, intenzity D (I D) a G (I G) pásů, poměr I D/I G a pozice vrcholů D a G pásu. Pozice G píku a poměr I D/I G stejně jako množství koncentrace Cr můžeme vidět na Obr. 11.. Obr. 11. Bodové znázornění pozice G píku, poměru I D/I G a množství Cr ve filmu. S narůstajícím množstvím chromu roste i poměr intenzit I D/I G. Stejně tak D pík je zastoupen sp 2 vazbami pouze v kruhu ne v řetězcích a vkládání chromu je 11

výsledkem více grafitové struktury DLC. Vzorek čistého DLC je na druhé straně více neuspořádaný stejně jako vrchol G a tedy převládají všechny sp 2 vazby. Vrchol v pozici A je přisuzován Si substrátu, na kterém je vrstva (Obr. 10.). S rostoucím množstvím Cr se pík ztrácí. 4.6 Určování fononových módů v LiNbO3 FTIR a Ramanova spektroskopie jsou experimentální techniky, které se široce využívají při studiu dynamiky fononů a fázového přechodu LiNbO 3. K přípravě tenkých vrstev LiNbO 3 byla použita metoda PLD za použití 3 terčů (krystalický, lisovaný a magnetronový). Pro měření reflexe byl k měření vzorků použit FTIR spektrometr NICOLET 6700. DTGS/KBr detektor s reflexním nástavcem SEAGULL byl použit pro měření ve střední oblasti a DTGS Polyethylenový detektor pro měření v daleké oblasti. Použili jsme rozlišení 4 cm -1 a 256 skenů za použití TURBO módu. Ramanova analýza byla provedena pomocí Thermo Scientific DXR Raman mikroskopem s prostorovým rozlišením 1 µm a hloubkovým rozlišením 2 µm. Zvětšení objektivu je 50x. Spektra byla excitována druhou harmonickou Nd:YAG laserem o vlnové délce 532 nm. Pro analýzu našich spekter jsme použili Omnic software a OriginLab software. Deponované vrstvy LiNbO 3 tloušťky přibližně 680 nm byly nanášeny na SiO 2/Si a (0001) safírové substráty při teplotě 650 C, 700 C a 750 C. Obecně platí, že vzorky připravené na (0001) safíru jsou hladší, než připravené na SiO 2/Si. Předchozí charakterizace nám ukázaly, že LiNbO 3 je polykrystalický. Infračervená i Ramanova spektra jsou tedy kombinace obou A 1 a E módů, kterých je dohromady 13. Nebyly použity žádné polarizátory. IČ spektrum námi naměřeného monokrystalu LiNbO 3 s přiřazenými módy můžeme pozorovat na Obr. 12.. Uvedené spektrum pak můžeme srovnávat se spektry tenkých vrstev. Vzhledem k tloušťce podložek a hloubce penetrace můžeme na měřených spektrech očekávat vrcholy přisuzovány podložce. Obr. 12. IČ spektrum s A 1 a E módy u monokrystalu LiNbO 3 v oblasti 0-1000 cm -1. 12

Obr. 13. IČ spektrum LiNbO 3 na (0001) safírové podložce (červeně), samotná podložka (černě). Obr. 14. IČ spektrum LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce (červeně), samotná podložka (černě) a (111) křemík (modře). Obr. 15. Spektrum LiNbO 3 na (0001) safírové podložce (červeně), samotná (0001) safírová podložka (černě). 13

Obr. 16. Spektrum LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce (červeně), samotná SiO 2/Si podložka (černě). Porovnáním fononových spekter uvedených na předchozích obrázcích Obr. 13., Obr. 14., Obr. 15. a Obr. 16. dostaneme několik zajímavých míst. Příspěvek SiO 2/Si substrátu je zanedbatelný, v tomto materiálu nejsou k dispozici žádné IČ aktivní módy kromě silného pásu nad 1000 cm -1 na Obr. 14.. Silný vrchol v Ramanově spektru okolo 500 cm -1 na Obr. 16. je jediný Ramanovsky aktivní fonon v tomto materiálu. V případě tenkých vrstev, může být přítomna i interference z filmů nebo substrátů a mohou se vyskytovat i vrcholy přítomné od podložek. Když vyloučíme tyto možnosti, můžeme snadno najít prvních šest E módů označených E(TO1) až E(TO6) ve všech čtyřech obrázcích. Zbývající tři E módy nejsou příliš výrazné, ale lze je ve spektru také nalézt. Pozorování A 1 módů je složitější. Může to být důsledkem textury ve filmu, která pochází z preferenčního růstu filmů s c osou kolmou k povrchu podkladu. Tento efekt by měl být lepší pro (0001) safírový substrát, kde se směr shoduje se třemi osami jak podkladu, tak filmu. Situace je komplikována skutečností, že (0001) safírový substrát má sám velmi bohaté a silné fononové spektrum, které spektrum filmu překrývá. Si substráty jsou pokryty vrstvou SiO 2, která je amorfní, a tato tendence by měla být menší. A 1 módy je proto velmi obtížné odlišit, takže byly pozorovány pouze (TO1) a (TO4). Srovnání se spektrem monokrystalu umožňuje přiřazování módů a identifikaci tenkých vrstev. Spíše však používáme spektra pro kvalitativní srovnání depozičních podmínek. Tenké vrstvy připravené na SiO 2/Si substrátu při teplotě 750 C se neliší v závislosti na terči. Na SiO 2/Si substrátu jsou spektra při všech teplotách stejná. Totéž platí pro vzorky připravené na (0001) safíru. V Ramanových spektrech můžeme porovnávat terče a teploty na substrátech SiO 2/Si a (0001) safíru. U vzorků z krystalického terče LiNbO 3 můžeme pozorovat vrchol okolo 130 cm -1 při teplotě 700 C, při vyšší teplotě je vrchol buď vyšší anebo stejný. U vzorků z práškového lisovaného terče LiNbO 3 je pozorován vrchol pouze u SiO 2/Si podložek, jinak platí totéž jako pro krystalický terč. Práškový lisovaný terč LiNbO 3 je jediným terčem, kde můžeme pozorovat výrazné rozdíly mezi substráty. U magnetronového terče můžeme pozorovat vrchol pouze při teplotě 750 C. 14

Vrchol ve 200 cm -1 je pravděpodobně od LiNbO 3 a je přítomen nezávisle na substrátu. Vrchol v 519 cm -1 je pravděpodobně ze (0001) safírového substrátu. Vliv SiO 2/Si podložky můžeme pozorovat v 673 cm -1 a v 690 cm -1. V 900 cm -1 můžeme u práškového lisovaného terče vidět vliv teploty (650 C a 700 C). IČ spektra jsou v podstatě stejná a to zejména na SiO 2/Si podložkách. 4.7 Polykrystalické vrstvy LiNbO3 Studie polykrystalických vrstev navazuje na předchozí výzkum tenkých vrstev LiNbO 3, které byly analyzovány pomocí FTIR a microramanovy spektroskopie. Filmy byly připraveny na SiO 2/Si substrátech při třech různých teplotách substrátu T S (650 C, 700 C a 750 C) KrF excimerovým laserem ablací monokrystalického a listovaného terče. Byly studovány depoziční vlastnosti a změny optických vlastností E a A 1 módů, které byly porovnávány s výsledky různých autorů. FTIR spektrometr Bruker 113v byl použit k měření vzorků v reflexním módu v daleké IČ oblasti (50-700 cm -1 ). Rozlišení bylo 4 cm -1 pro 128 skenů. MicroRaman spektroskopie byla provedena na Renishaw Ramanscope model 1000 za použití Ar+ laseru, λ = 514,5 nm. Optické vlastnosti FTIR a Ramanova spektra jsou směsí A 1 a E fononových módů. Tloušťka filmů je přibližně 680 nm. Hloubka průniku záření tenkým filmem je větší než tloušťka samotných filmů, takže další pozorované píky ve spektrech pocházejí ze substrátu (SiO 2/Si) a je třeba je také zahrnout do naší analýzy. Spektra jsou rovněž modifikována pomocí interference z důvodů vícenásobných odrazů na filmu nebo na substrátu. Všechny tyto jevy byly zahrnuty v softwaru použitém k vyhodnocení FTIR a Ramanových spekter. IČ spektrum vzorku LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce můžeme vidět na Obr. 17.. Spektrum bylo proloženo 10 harmonickými oscilátory a jejich parametry byly stanoveny fitováním. Nejprve jsme modelovali dielektrickou funkci samotného SiO 2/Si substrátu. Vzhledem k tomu, že se funkce nemění s frekvencí, byla aproximována ke konstantnímu epsilon nekonečnu, které představuje příspěvek ε 1 elektronových přechodů na mnohem vyšších frekvencích. Pak byla funkce pevně fixována a fitovali jsme spektra celého systému (film + substrát), měnili jsme pouze parametry filmu. Našli jsme 9 E(TO transverzální) módů centrovaných okolo 151, 232, 262, 321, 362, 380, 435, 582 a 675 cm -1, na kterých se shoduje většina autorů [15-17]. Ramanovo spektrum vzorku LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce (T S=750 C) můžeme vidět na Obr. 18., má poměrně silné a dobře rozvinuté píky. Pro analýzu těchto spekter jsme použili software Origin a Lorenzovu křivku jako základ fitovací funkce. Spektrum filmu bylo porovnáváno s našimi naměřenými spektry monokrystalu LiNbO 3 [18]. Mohli jsme zde najít pouze osm E(TO) módů. E(TO 6) mód nelze vidět, protože ho mód E(TO 5) překrývá. Zhodnocení výsledků E(TO) módů naměřených spekter LiNbO 3 našich i různých autorů [14-17, 21-24] a vypočítaných spekter LiNbO 3 [13, 19, 20] se celkově shodují. 15

Obr. 17. IČ spektrum LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce (krystalický terč, TS = 750 C). Obr. 18. Ramanovo spektrum LiNbO 3 na SiO 2/Si podložce (lisovaný práškový terč, T S=750 C). A 1 mód bylo opět obtížné pozorovat v obou jak IČ tak Ramanových spektrech. Je to z toho důvodu, že se většinou překrývají s E módy a módy od substrátů. Si substráty způsobují Ramanovský pík pouze v 520 cm -1, ale jsou pokryty ještě vyrovnávací vrstvou SiO 2, která vytváří ještě další vrcholy. V našem IČ spektru můžeme pozorovat dva A 1 módy, TO 1 a TO 2. A 1 (TO 3) mód není vidět. Je to důsledkem toho, že je E(TO 4) mód poměrně široký a překrývá se s A 1(TO 3) módem. A 1(TO 4) mód je nejslabší a tak ho nemůžeme pozorovat (Obr. 17.). V Ramanově spektru jsme pozorovali tři A 1 módy, TO 2, TO 3 a TO 4 (Obr. 18.). V SiO 2/Si substrátech jsme mohli pozorovat různé výsledky ve srovnání s jinými autory. Vliv depozičních podmínek Studovali jsme vliv depozičních podmínek na infračervená a Ramanova spektra. Měnícími se parametry depozice byla depoziční teplota a tři typy PLD terčů. Obecně můžeme říci, že dominantním parametrem je teplota a vliv dalších parametrů je mnohem slabší. Nejlepší FTIR a Ramanova spektra byla pozorována na vrstvách připravených z krystalického terče. To odpovídá představě, že krystalický terč je nejvíce 16

homogenní a proto působení proudění z terče na substrát není během depozice rozdílné. V Ramanových spektrech z depozice vrstev z krystalického terče můžeme pozorovat pík okolo 130 cm -1 při teplotě 700 C. Pík se mírně zvyšuje s teplotou depozice. Ve filmech z práškového lisovaného terče můžeme pozorovat totéž. Ve filmech z krystalického LiNbO 3 a magnetronového terče můžeme pozorovat pík ve 200 cm -1 pouze při teplotě 750 C. Pík pravděpodobně pochází z SiO 2/Si substrátu v důsledku zvyšující se transmise z nejvyššího filmu (Obr. 19.). Obr. 19. Ramanova spektra LiNbO 3 tenkých vrstev na SiO 2/Si vzorcích při měnících se substrátových teplotách (T S). IČ spektra se na základě depozičních podmínek liší jen velmi málo (Obr. 20.). Jejich pásy jsou širší, protože tvoří reststrahlen pásy, které se překrývají a snižují možnost jejich rozlišení. Vzorky připravené při teplotě 650 C ukazují jejich zvyšující se sílu. Obr. 20. IČ spektra LiNbO 3 tenkých vrstev na SiO 2/Si při měnících se substrátových teplotách (T S). Typ terče neměl vliv na krystaličnost filmů. Naše FTIR a Ramanova spektra filmů na SiO 2/Si podložkách při stejných teplotách jsou v podstatě totožná, nezávisle na terčích. Pásy ve spektrech filmů z lisovaného práškového terče a magnetronového terče jsou mírně posunuty k nižším frekvencím. Parametrem, který mění spektra nejvíce je depoziční teplota. 17

5 Teoretická a rešeršní část: Biologické vlastnosti tenkých vrstev Z hlediska testování antibakteriální účinnosti na tenkých vrstvách byl studován růst bakteriálních kultur při styku s povrchem tenké vrstvy. Pro studium účinnosti jsme si vybrali zástupce dvou kmenů bakterií, které jsou rozděleny podle Gramova barvení na grampozitivní a gramnegativní. Bacillus subtilis je grampozitivní bakterie běžně se vyskytující v půdě, přičemž Escherichia coli je gramnegativní bakterie nacházející se v tlustém střevě savců. 5.1 Pracovní postup při testování na tenkých vrstvách Tekuté kultivační médium se v Erlenmeyerových baňkách naočkovalo bakteriální kulturou. LB médium bylo naočkováno bakterií Escherichia coli a modifikované MPA médium bakterií Bacillus subtilis. Sterilní tekutá kultivační média se nechala kultivovat přes noc v třepačce při 130 otáčkách za minutu. Další den ráno se přistoupilo k testování. Tenké vrstvy byly umístěny na dno sterilních Petriho misek. Z Erlenmeyerovy baňky, z přes noc narostlé bakteriální suspenze, byl pomocí automatické pipety se sterilní špičkou odebrán 1 ml suspenze a nanesen na testovaný vzorek. Bakteriální suspenze se nechala na vzorcích působit 1hodinu a 3 hodiny. Z povrchu vzorku umístěného v Petriho misce bylo nejprve po 1 hodině a poté po 3 hodinách odebráno 100 μl bakteriální suspenze, která byla sterilním fyziologickým roztokem rozředěna na koncentraci 10-6 (popis ředění uveden níže). Nakonec bylo 100 μl vyředěné bakteriální suspenze naneseno na agarovou plotnu a rozetřeno po celé její ploše pomocí jednorázové očkovací plastové hokejky. Pro každý odběr byly udělány tři plotny. Postup byl prováděn velmi rychle v mikrobiálním laminárním boxu, aby se zabránilo případné kontaminaci. Agarové plotny s bakteriální suspenzí byly zalepeny a utěsněny parafilmem a dnem vzhůru umístěny v termostatu a kultivovány při teplotě 30 C (B. subtilis po dobu 24 hodin, E. coli po dobu 48 hodin). Po kultivaci byly narostlé bakteriální kolonie spočítány metodou kolonie tvořící jednotky (KTJ). Stejný postup byl aplikován i pro referenční vzorek (např. samotný Si substrát). Postup při ředění 10-6 0,1 ml bakteriální suspenze do 9,9 fyziologického roztoku dává zředění 10-2 0,1 ml zředění 10-2 do 9,9 fyziologického roztoku dává zředění 10-4 0,1 ml zředění 10-4 do 9,9 fyziologického roztoku dává zředění 10-6 Antibakteriální účinnost Antibakteriální účinnost (ABÚ) byla spočtena dle vzorce: počet kolonií v referenční skupině - počet kolonií v testovaném vzorku ABÚ % 100% počet kolonií v referenční skupině (5.1) Experimentální skupina testované tenké vrstvy Referenční skupina samotný substrát bez tenké vrstvy 18

6 Experimentální výsledky: Bakteriální testování tenkých vrstev Testovaly se především DLC vrstvy, ať už samotné nebo dopované stříbrem a také speciální DLC vrstvy, Ultra-nano-krystalické diamantové (UNCD) vrstvy, vyrobené v Univerzity of Kassel. DLC vrstvy jsou vhodné pro výrobu materiálů použitelných v lidském těle, protože splňují požadavky kladené na testy biokompatibility v souladu s ISO 10993-1. Výhodou DLC vrstev je vysoká pevnost a inertnost. 6.1 DLC a UNCD Byly studovány dva typy filmů na bázi uhlíku, DLC a UNCD. DLC filmy byly připraveny metodou PLD bez nebo s přídavným iontovým bombardováním. UNCD vrstvy byly připraveny metodou depozice rozkladem plynné fáze v mikrovlnném plazmatu (MWCVD), což je rozšířená PECVD metoda. Tato práce navazovala na spolupráci s ERASMUS programem s Univerzity of Kassel. Antibakteriální vlastnosti DLC a UNCD filmů byly studovány pomocí dvou reprezentativních bakterií (B. subtilis a E. coli) DLC jsou zcela amorfní nebo obsahují mikro nebo nanokrystalický diamant nebo grafit a mají neuspořádanou strukturu sp 2 a sp 3 vazebných uhlíkových konfigurací. Jsou odolné proti napadení jak kyselinou, tak zásadou a jsou thromborezistentní [25, 26]. DLC filmy mohou být přichyceny na různé biologické materiály. Nejsou toxické vůči různým živým buňkám, nevyvolávají zánětlivé reakce ani ztrátu integrity buněk [27]. DLC filmy vykazují také vynikající hemokompatibilitu, snižují tendence tvorby trombu a potažené srdeční chlopně a stenty jsou již komerčně dostupné [28]. Buňky mikrobiální E. coli byly kultivovány v živné půdě LB média (Lysogeny Broth), zatímco B. subtilis byl kultivován na živném MPB médiu (obsahuje pepton, extrakt z hovězího masa, NaCl a ph je 7,0). Pro přípravu pevného živného média byla použita půda s přídavkem 2% bakteriologického agaru jako zpevňovací činidlo. Testované tenké vrstvy byly umístěny do sterilních misek a byl na ně nanesen 1 ml kultury E. coli nebo B. subtilis. Kultury se nechaly působit po určitou dobu. Tedy kultury se zředí na koncentraci buněk 10 6 KTJ ml -1 a nechají se přes noc působit. Při testování byly sterilní misky kultivovány při teplotě 35 C a po 8 hodinách bylo odebráno 100 µl a zředěno na koncentraci 10-6. Poté bylo 100 µl z každého zředěného vzorku rovnoměrně rozetřeno na agarovou plotnu a inkubováno po dobu 48 hodin. Nakonec byl spočítán počet vypěstovaných kolonií. Bakteriální účinnost DLC a UNCD tenkých vrstev na E. coli a B. subtilis byla odhadnuta podle vzorce (5.1). Jako referenční vzorek považujeme čistou Si (100) podložku. Referenční skupina určuje množství bakteriálních kolonií, které narostly nebo zahynuly na Si (100) substrátu. Všechny zkoumané DLC a UNCD filmy zobrazené v grafu na Obr. 21. níže, ukazují velmi dobrou antibakteriální účinnost. Toto podobné chování může být přičítáno k obdobným povrchovým vlastnostem obou typů filmů, zejména jejich hladkosti, smáčivosti a povrchové energii dominující u disperzních (rozptýlených) složek. 19

Tab. 1. Bakteriální účinnost po 8 hodinách působení bakteriálních kmenů E. coli a B. subtilis. Vzorek Gramnegativní Grampositivní (E. coli) (B. subtillis) Počet kolonií Účinnost (%) Počet kolonií Účinnost (%) 1. DLC 4 27 94 4 98 2. DLC 10 41 90 0 100 3. DLC 10_0.15A 28 93 8 97 4. DLC 10_0.5 27 94 0 100 5. DLC 14 38 91 10 97 6. UNCD D94 24 94 2 99 7. Kontrola 451 0 365 0 Obr. 21. Počet kolonií E. coli a B. subtilis na DLC a UNCD vrstvách a kontrolní antibakteriální účinnost. Obr. 22. Antibakteriální účinnost DLC a UNCD tenkých filmů against E.coli misky s koloniemi E.coli (vzorky 1 6), C kontrola. 20

Obr. 23. Antibakteriální účinnost DLC a UNCD tenkých filmů against B.subtilis misky s koloniemi B.subtilis (vzorky 1 6), C kontrola. 6.2 DLC - Ag na podložkách technického PEEKu Přesný princip působení stříbra na bakteriální buňky není ještě zcela znám, ale možný mechanismus můžeme popsat podle morfologických a strukturálních změn nalezených v bakteriálních buňkách. Jedna z hypotéz vysvětluje tento mechanismus tím, že buňky jsou snadno ovlivnitelné během replikace, kdy jsou DNA molekuly v relaxovaném stavu. Stříbrné ionty uvnitř bakteriální buňky proniknou do DNA molekul a způsobí, že dojde k zhuštěné formě, čímž molekuly DNA ztrácí schopnost replikace a to vede k buněčné smrti buňky. Jiná hypotéza říká, že je mechanismus působení stříbra spojený s jeho interakcí s thiolovou skupinou sloučeniny nalezené v dýchacím enzymu bakteriálních buněk. Stříbro se váže na bakteriální buněčnou stěnu a buněčnou membránu a zabraňuje tak procesu dýchání. V případě E. Coli, stříbro brání absorpci fosforečnanu a uvolnění fosforečnanu, sukcinátu, prolinu a glutaminu z buňky E. Coli. [29] Byly provedeny depozice DLC vrstev dopovaných stříbrem na podložky z technického PEEKu ve třech různých koncentracích. Koncentrace v atomárních procentech byla dána z dřívějších zkušeností a předchozího testování na přibližně 5% Ag. Další dvě koncentrace byly jedna nižší (2,2%) a jedna vyšší (8,8%), tak aby nalezená koncentrace Ag byla co nejnižší, ale měla stále výborné antibakteriální vlastnosti. Jako testované kontrolní vzorky byly použity čisté PEEK podložky. K testování antibakteriální účinnosti grampozitivní bakterií B. subtilis byly použity tři vrstvy Ag-DLC (AgC-5-023, AgC-5-0224, AgC-5-025) a k testování gramnegativní bakterií E. coli další tři vrstvy Ag-DLC (AgC-5-0226, AgC-5-0227, AgC-5-028). Pro kultivaci bakterií bylo použito tekuté médium LB (Lysogeny Broth) médium. Pro přípravu pevných agarových ploten byl použit přídavek 2% agarové řasy. Bakterie byly kultivovány přes noc v tekutém médiu, následně byl sterilně proveden odběr bakteriální kultury. Ta byla nanesena na testovaný vzorek a po 1 hodině a po 3 hodinách byl proveden odběr kultury, která byla zředěna 21

na koncentraci 10-6. Byl proveden odběr 100 µl, který byl rozetřen na agarovou plotnu. Plotny byly kultivovány 48 hodin v inkubátoru při teplotě 35 C. Antibakteriální účinnost (ABÚ) byla vyhodnocena dle vzorce (5.1). Tab. 2. Testování antibakteriální účinnosti Ag dopovaných DLC vrstev bakterie Bacillus subtilis Vzorek s Bacillus subtilis Počet bakteriálních kolonií / PM 1 hodina (+) Počet bakteriálních kolonií / PM 3 hodiny (~) Kontrolní vzorek (ref 0235) 96 90,5 Antibakteriální účinnost (%) AgC-5-0223 28,3 31 71% / 66% AgC-5-0224 56 31 42% / 66% Tab. 3. Testování antibakteriální účinnosti Ag dopovaných DLC vrstev bakterie Escherichia coli Vzorek s Escherichia coli Počet bakteriálních kolonií / PM 1 hodina (+) Počet bakteriálních kolonií / PM 3 hodiny (~) Kontrolní vzorek (ref 0236) 600 433 Antibakteriální účinnost (%) AgC-5-0226 248 4 59% / 99% AgC-5-0227 160 78 74% / 89% Vyhodnocením počtu kolonií na Petriho miskách bylo zjištěno, že na Ag dopovaných DLC vrstvách byla v experimentu s B. subtilis prokázána bakteriální účinnost kolem 61%. Při testování s E. coli byla prokázána vyšší antibakteriální účinnost kolem 80%. Při provádění experimentu bylo zjištěno, že kontrolní vzorky z technického PEEKu jsou nesmáčivé, a proto nemusí docházet k ideální interakci povrchu kontrolního vzorku s bakteriální kulturou. Tento podkladový materiál může následně působit na vznik nerovnosti povrchu Ag dopovaných DLC vrstev, a proto se domníváme, že testované vrstvy na PEEKu vykazují nižší antibakteriální účinnost než v experimentech s čistými DLC vrstvami, které byly provedeny dříve. Dále bylo zjištěno, že všechny testované vzorky jsou kulaté a jejich velikost je relativně malá pro interakci s bakteriální kulturou, a z toho důvodu bude lepší v dalších experimentech použít větší velikost testovaných vzorků. Při experimentech byly použity i v tabulkách neuvedené vrstvy AgC-5-0225 a AgC-5-0228, které právě díky výše popsaným problémům s nesmáčivostí a velikostí nebylo možné zajistit interakci bakteriální kultury s povrchem vzorku po dobu experimentu. 6.3 DLC dopované stříbrem pro vývoj antibakteriálních povlaků Výhodou Ag je schopnost účinně likvidovat široké spektrum mikroorganismů a vykazuje baktericidní účinky u gramnegativních i grampozitivních bakterií.[30] 22

Dle předchozího testování a doporučení byly připraveny vrstvy na podložkách z křemíku Si (100). Dopace stříbrem byly nejprve provedeny v koncentraci zvolené dle dřívějších zkušeností a testů (1:3). Následně byly vyrobeny dvě další koncentrace, jedna vyšší (3:5) a jedna nižší (1:7). Pro testování antibakteriální účinnosti bylo použito celkem 6 připravených vrstev Ag-DLC. Tři vzorky, zastoupeny s rozdílnou procentuální koncentrací Ag : DLC, byly testovány kmeny grampozitivní bakterie B. subtilis. Další tři vzorky, opět ve stejných poměrech koncentrací, kmeny gramnegativní bakterie E. coli. Jako kontrolní vzorek byla využita čistá Si (100) podložka. Pro kultivaci bakterií bylo použito tekuté médium LB (Lysogeny Broth) a pro přípravu pevných agarových ploten, byl použit přídavek 2% agarové řasy. Bakterie byly kultivovány přes noc v tekutém médiu. Následně byl sterilně proveden odběr bakteriální kultury. Ta byla nanesena na testovaný vzorek a po 1 hodině a po 3 hodinách byl proveden odběr kultury, která byla zředěna na koncentraci 10-6. Byl proveden odběr 100 µl, který byl rozetřen na agarovou plotnu. Agarové plotny byly dnem vzhůru kultivovány 48 hodin v inkubátoru při teplotě 35 C. Antibakteriální účinnost (ABÚ) byla vyhodnocena dle vzorce (5.1). Tab. 4. Testování antibakteriální účinnosti Ag dopovaných DLC vrstev bakterie Bacillus subtilis Vzorek s Bacillus subtilis Počet bakteriálních kolonií / PM 1 hodina Počet bakteriálních kolonií / PM 3 hodiny (~) Kontrolní vzorek Si (100) 134 133 Antibakteriální účinnost (%) AgC-6 (1:3) 16 10 88% / 93% AgC-7 (3:5) 20 9 85% / 93% AgC-8 (1:7) 6 1 96% / 99% Tab. 5. Testování antibakteriální účinnosti Ag dopovaných DLC vrstev bakterie Escherichia coli Vzorek s Escherichia coli Počet bakteriálních kolonií / PM 1 hodina Počet bakteriálních kolonií / PM 3 hodiny (~) Kontrolní vzorek Si (100) 413 425 Antibakteriální účinnost (%) AgC-6 (1:3) 2 2 99% / 99% AgC-7 (3:5) 1 7 99% / 98% AgC-8 (1:7) 298 8 28% / 98% 23

Obr. 24. Výsledky antibakteriální účinnosti u kmenů bakterie Bacillus subtilis po 1 a po 3 hodinách. Obr. 25. Výsledky antibakteriální účinnosti u kmenů bakterie Escherichia coli po 1 a po 3 hodinách Na základě výsledků v experimentu s bakteriální kulturou Bacillus subtilis byla na stříbrem dopovaných DLC vrstvách prokázána bakteriální účinnost kolem 95%. Při testování bakteriální kultury gramnegativní bakterie Escherichia coli byla prokázána vyšší antibakteriální účinnost kolem 98%. Testované vrstvy se stříbrem na Si (100) podložkách vykazují vysokou antibakteriální účinnost v porovnání s experimenty na PEEK podložkách, které byly provedeny dříve. Testované vrstvy jsou výrazně lepší a zjištěná antibakteriální účinnost je srovnatelná s původními pokusy, kdy byla také použita křemíková podložka. Na základě provedených testů nedoporučujeme používat PEEK podložky z důvodů, které jsme uvedli po předchozích testech. Jak už bylo zmíněno, tak mechanismu působení stříbrných iontů není doposud dostatečně porozuměno. Nicméně, efekt stříbrných iontů na bakterie může být pozorovaný strukturálními i morfologickými změnami. 24