10A1_IR spektroskopie

Transkript

1 C6200-Biochemické metody 10A1_IR spektroskopie Petr Zbořil

2 IR spektroskopie Excitace vibračních a rotačních přechodů Valenční vibrace n Deformační vibrace d

3 IR spektroskopie N atomů = 3N stupňů volnosti Vibrační modus: molekulární pohyb, ve kterém atomy vibrují ve fázi se stejnou frekvencí Lineární molekuly: 3N -5 modů (odečet rotace) Nelineární molekuly 3N 6 modů

4 IR spektroskopie Podmínka viditelnosti absorpce v IR spektru vibrace musí být provázena změnou dipólového momentu (např. asymetrické vibrace) (Elmg. záření je oscilující dipolový moment)

5 Podmínky viditelnosti IR Absorpce záření jen u molekul s dipolmomentem, který se mění absorbcí kvant Vektor el. pole vibrující molekuly se periodicky mění absorbce záření s nímž je v resonanci: ν = 1/2π. k/μ Hookův zákon silová konstanta / redukovaná hmotnost k = f(typu vazby) C-C... 0,5 knm -1, C=C... 0,95, C C... 1,5 μ = m 1.m 2 / (m 1 + m 2 ) E v = k/2 (r-r 0 ) 2 = (v + ½). h ν 0 (aplik. Sch. rovnice) E v+1 = k/2 (r 1 -r 0 ) 2 = (v + ½). h ν 0 E = h ν = E v+1 - E v = h ν 0 Neaktivní Neaktivní molekuly jednoatomové symetrické nepolární (H 2, N 2, O 2...) mající symetrické valenční vibrace (CO 2 )

6 Podmínky viditelnosti IR Oblasti spektra fingerprint cm -1 charakteristické pásy vazeb Vlivy skupenství ν g ν l ν s (s vhodné na určení struktury, ne změny) vodíkové vazby rostou dipolární interakce konjugace menší ν isotopová záměna ν = f(1/μ) D za H apod.

7 IR spektroskopie E = hn Vlnočet = cm -1 Blízká mm cm -1 Střední mm cm -1 Vzdálená mm cm -1 X H X=Y X=Y X-Y n bar = 1/2p (k AB /m AB ) 1/2 kde m AB = M A M B /(M A + M B ) Kde k je silová konstanta, MA, MB hmotnosti atomů, n vlnočet A B

8 IR spektroskopie

9 Typické IR spektrum IR spektroskopie

10 Příklady vibrací cm -1 n OH (alkohol) n NH2(amin) n SH (thioly) d HOH (voda) biopolymery n SH (cystein) n NH2 (amidy) n C=O (Asp, Glu) n COO n C-N 1625 n NH d jádro (Tyr) 1515 n NH (Trp) 3400 n O-PO (fosfát) 900 d jádro (nukl. báze) n CO, dnh (pep. vazba) dcn, dnh Polohy abs. pásu podle typu vazeb X -H X=Y X=Y X-Y

11 IR spektroskopie IR spektra proteinů Amid I cm -1 n N-CO Amid II 1550 cm -1 d NH CN Závislost spektra peptidové vazby na typu struktury Amid I (D 2 O) a-helix b- struktura RC

12 Schema přístroje IR spektroskopie

13 IR spektroskopie Zdroj žhavené materiály (slitiny kovů, keramika) vlákna, tyčinky (nichromový zdroj, Nernstova tyčinka, globar) Monochromátor mřížka jiná hustota vrypů Michelsonův interferometr za vzorkem Detektor fotoelektrický tepelný

14 IR spektroskopie FT-IR spektroskopie Michelsonův interferometr

15 IR spektroskopie FT-IR spektra proteinů, změna konformace CaF 2, D 2 O, 60 mg/ml, 10 ml H bs

16 Ramanova spektroskopie NC 1930 Neelastický rozptyl srážky fotonů s částicí Není absorpční Měříme vyzářené světlo Sir C. V. Raman

17 Ramanova spektroskopie Rozptyl, měření vyzářeného světla o Virtuální stav excitace

18 Ramanova spektroskopie

19 Ramanova spektroskopie n R = n o n vibr Rayleigh Dn = n o n R = n o (n o n vib ) Dn = n vib lo = 555 nm no = cm -1 Pokud n vib = 1600 cm -1 n R = = cm -1 l R = 610 nm Stockes n o n vib Anti-Stockes n o + n vib

20 Ramanova spektroskopie Zdroje: lasery He-Ne 633 nm Ar 488 nm

21 Ramanova spektroskopie

22 Ramanova spektroskopie Polarizovatelnost molekuly a vibrační mody Viditelnost vibrace v Ramanově spektru vyžaduje změnu polarizovatelnosti vazby Doplňkové k IR Symetrické vibrace CO2

23 Ramanova spektroskopie Indukce dipólu P v elektrickém poli E i P = a. E i a polarizovatelnost E i = E o cos(2pn i t) n i vlnočet záření a= a o + a v cos(2pn v t) n v vibr. frekvence molekuly p = E o a o cos(2pn i t) + E o a v cos(2pn i t).cos(2pn v t) + E o a v [cos2pt(n i +n v ) + cos2pt(n i - n v )] Poměr intenzit Stockesových a anti-stockesových linií I A /I S = (n i n v ) 4.e (-hnv/kt) (n i + n v ) Anti-Stockesovy linie jsou mnohem slabší

24 Ramanova spektroskopie Infrared Raman Fyzikální efekt Příprava vzorku Absorpce Změna diplového momentu (silné, iontové vazby jako O-H, N-H) Optimální tloušťka (transmission mode) kontakt vzorku nutný Komplikace Silná absorpce skla, vody, CO 2 Fluorescece Materiály Zejména organické látky Neomezeno Rozptyl Změna polarizovatelnosti (silné: kovalentní vazby jako C=C, C-S, S-S) Bez kontaktu, destrukce jednoducháý příprava voda nebo sklo neruší měření Frekvenční rozsah cm cm -1 (Stokes and Antistokes)

25 Ramanova spektroskopie Běžná Ramanova spektroskopie Excitace světlem E DE = E ex - E z Např. l chromoforu 220 nm, l světla 488 nm Rezonanční Ramanova spektroskopie Elektronové a vibrační přechody excitace světlem E DE = E ex - E z l světla je kratší než l odpovídajícího el. přechodu (l chromoforu 550 nm, l světla nm, laditelný laser) Rezonanční Ramanův efekt zesílení určitých liníí

26 Dn Dn

27 Ramanova spektroskopie Resonanční Ramanova spektra cyt c: cm-1: oxidační a vazebný stav hemového Fe a 1504 cm-1 oxidovaný stav, bis-his hemu (6cLS konfigurace). Redukovaný stav: cm-1 (5cHS konfigurace)

28 Ramanova spektroskopie Vazba izotopů CO na cytochrom b5.

29 Ramanova spektroskopie Analýza mutantů Leu88Asp Prakticky totožná CD spektra RR: 1482, koordinační Fe, s vysokým spinem 1505, koordinační, nízký spin divoký kmen a mutant prakticky totožné

30 Ramanova spektroskopie nas CD2 nscd2 nscd3 nscd3 Spektrum deuterovaného DPPC