Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 7. Interakce DNA/RNA - protein Ivo Frébort
Interakce DNA/RNA - proteiny v buňce
Základní dogma molekulární biologie
Replikace DNA v E. coli
DNA polymerasa a replikace Směr replikace 5' 3' Enzym DNA polymerasa E. coli Pol I (928 aminokyselin, 109 kda) monomer - funkce: opravy a spojování DNA E. coli Pol III (10 podjednotek) - funkce: vlastní replikace Kruhový genom - jeden počátek replikace
DNA polymerasa u E. coli Pol III Pol I
DNA replikace u eukaryot Mechanimus podobný E. coli, ale složitější Lidská buňka: 6 mld bp, diploidní genom, 23 chromosomů Počátky replikace: 1 na 3-300 kbp DNA Pol a b 4 podjednotky (replikace do 200 b), ne 3'-exonucleasa DNA Pol g - mitochondrie DNA Pol d neomezená replikace, 3'- exonucleasová aktivita, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), obdoba prokaryotní Pol III DNA Pol e vysoká účinnost replikace, neobsahuje PCNA
Replikace DNA u eukaryot
Základní dogma molekulární biologie
Transkripce u prokaryot
Transkripce u prokaryot Jediná RNA polymerasa E.coli: RNA polymerasa (465 kda): podjednotky 2, 1 b, 1 b', 1 - b' se váže na DNA - b váže NTPs a interaguje s - rozpoznává sekvenci promoteru na DNA - je důležitá pro stabilitu struktury a interakci s regulačními proteiny
E. coli RNA polymerasa
Lac operon u E. coli Negativní kontrola Positivní kontrola
Vazba lac represoru na DNA
Catabolite Activator Protein (CAP) Positivní kontrola lac operonu CAP je dimer 2 x 22.5 kda N-konec váže camp; C-konec váže DNA Vazba CAP-(cAMP) 2 na DNA pomáhá vytvořit transkripční komplex
Vazba CAP a RNA Pol do oblasti lac promoteru
Vazba CAP-(cAMP) 2 na DNA
Transkripce u eukaryot RNA Pol I transkripce rrna genů RNA Pol II transkripce mrna RNA Pol III transkripce převážně trna genů Velké multimerní proteiny (500-700 kda) Obsahují 2 velké podjednotky podobné b a b' u E. coli RNA Pol podobné katalytické místo Interagují s promoterem prostřednictvím transkripčních faktorů Transcripční faktory rozpoznávají a iniciují transkripci na specifických promoterech Některé transkripční faktory (TFIIIA a TFIIIC) se vážou do sekvencí uvnitř kódující oblasti genu
Transkripční komplex u kvasinek
Strukturní motivy regulačních proteinů Základním předpokladem kontaktu jsou interakce mezi residui proteinu a nukleovými bázemi na dvojšroubovici DNA Většina kontaktů probíhá ve velkém zářezu DNA 80% regulačních proteinů lze zařadit do jedné z těchto skupin: helix-otočka-helix (HTH), zinkové prsty (Zn-finger) a leucinové zipy (bzip) Tyto proteiny obsahují doménu vázající se na DNA a kromě ní ještě většinou další doménu interagující s jinými proteiny
DNA velký a malý zářez
-Helixy a DNA Typickou vlastností proteinů interagujících s DNA je přítomnost -helikálních segmentů, které přesně zapadají do velkého zářezu ve struktuře B-formy DNA Průměr -helixu je 1.2 nm Velký zářez DNA je 1.2 nm široký a od 0.6 do 0.8 nm hluboký Proteiny jsou schopny rozpoznat specifická místa (sekvence) na DNA
Helix-otočka-helix proteiny Jako první objeveny u prokaryot E. coli catabolite activator protein (CAP) Váží se jako dimery do symetrických míst na DNA Obsahují dva -helixy oddělené b-otočkou C-koncový helix zapadá do velkého zářezu DNA; N-koncový helix je stabilizován hydrofobní interakcí s C-koncovým helixem
Vazba Helix-Turn-Helix proteinu na DNA
Vazba CAP dimeru na DNA
Zn-Finger proteiny Jako první objeven TFIIIA u žáby Xenopus laevis Prokázány ve všech organismech Třída C 2 H 2 : domény Cys-x 2 -Cys a His-x 3 -His oddělené 7-8 aminokyselinami - tvoří složené b-vlákno a -helix který zapadá do velkého zářezu DNA Třída C x : 2 domény, každá tvořená 4-6 Cys (ligandy Zn) a -helixem - jeden -helix rozpoznává specifické místo na DNA a druhý ho stabilizuje hydrofobní interakcí
Vazba Zn-finger proteinů na DNA Cx C 2 H 2
Leucinové zipy První objeven C/EBP z jádra buněk krysích jater Prokázány u všech organismů Charakteristické vlastnosti: sekvence 28-residuí s Leu v každé 7. pozici a "bazický region" Amphiphatický - helix, dimer Basický region rozpoznává specifickou sekvenci DNA, vytvořen párem - helixů, které obalují velký zářez na DNA
Leucinový zip amphiphatický helix
Leucinový zip schematická struktura dimeru
Vazba Leucinového zipu na DNA