MECHANISMÙ NOCICEPCE

Pùvodní práce SOUÈASNÉ TRENDY VÝZKUMU BUNÌÈNÝCH MECHANISMÙ NOCICEPCE PRESENT TRENDS IN THE STUDY OF CELLULAR MECHANISMS OF NOCICEPTION VIKTORIE VLACHOVÁ, LADISLAV VYKLICKÝ Fyziologický ústav AV ÈR, Praha SOUHRN Nové poznatky ve výzkumu mechanismù bolesti, které jsou získávány na bunìèné a molekulární úrovni prostøednictvím moderních elektrofyziologických technik, mohou otevøít nové smìry léèby bolesti selektivním pùsobením na receptory nocicepce. Tato práce informuje o nìkterých souèasných pøístupech výzkumu periferních mechanismù nocicepce na úrovni jednotlivých senzorických neuronù, vèetnì izolovaných neuronù v tkáòové kultuøe. Klíèová slova: nocicepce, primární senzorické neurony, tkáòové kultury, algogeny, horko SUMMARY The modern electrophysiological techniques are suitable for the study of cellular and molecular mechanisms of nociception in isolated and cultured sensory neurones. This review presents examples of the effects of algogens and noxious heat on a distinct group of small sensory neurones in culture that fulfil criteria to play a role of nociceptors in vivo. It is suggested that better understanding of the mechanisms of nociception may be useful in the search for new drugs in the treatment of pain. Key words: nociception, dorsal root ganglion neurones, cell cultures, algogens, noxious heat Úvod Akutní bolest je posledním varováním organismu pøed hrozícím nebezpeèím poškození tkánì fyzikálními nebo chemickými prostøedky. Varovné signály vyvolávají ve slabých aferentních vláknech skupiny C nebo Aδ vzruchovou aktivitu, která vstupuje do centrální nervové soustavy (CNS) a vyvolá obrannou reakci organismu doprovázenou bolestí. Bolest tak pøedstavuje subjektivní doprovod nocicepèního dráždìní, a proto o její kvalitì a intenzitì mùže podat zprávu pouze èlovìk. Není však žádný dùvod k domnìnce, že by bolest existovala pouze u èlovìka. Všechny behavoirální studie se shodují v tom, že bolest existuje u všech obratlovcù. Obranné reakce na nocicepèní podnìty, které jsou pro èlovìka bolestivé, lze pozorovat u všech živoèichù vèetnì bezobratlých, jako je napøíklad hmyz nebo èervi. Proto lze struktury, které slouží nocicepci, považovat za nejprimitivnìjší senzorický orgán, který je významný z hlediska zachování života a integrity jedince. Vzhledem k tomu, že bolest je nejèastìjším pøíznakem onemocnìní a mùže pøetrvávat i po jeho vyléèení, je bolest odpradávna ve støedu lékaøského zájmu. K poznávání mechanismù, které se pøi vzniku bolesti uplatòují, pøispívají prakticky všechny lékaøské disciplíny vèetnì základního lékaøského výzkumu. To dokazuje nesèetná vìdecká literatura ve specializovaných mezinárodních èasopisech a sbornících, které jsou publikovány Mezinárodní asociací pro studium bolesti. Z této literatury vyplývá, že centrálním mechanismùm bolesti se vìnuje podstatnì více pozornosti než mechanismùm, které se uplatòují na jejím vzniku, tj. na úrovni nervových zakonèení specializovaných k detekci podnìtù, jež bolest vyvolávají. Mnohem vzácnìji se objevují práce, které poznatky v oblasti studia mechanismù bolesti shrnují a jsou pøístupné nejen úzce specializovaným odborníkùm, ale i širší lékaøsky orientované veøejnosti. Pøíkladem takového díla je èeský pøeklad monografie D. Albe-Fessardové Bolest (Albe-Fessard, 1998). Monografie shrnuje souèasné poznatky o nervových mechanismech bolesti a odráží celosvìtové trendy jejího výzkumu. Avšak i v ní je patrno, že periferní mechanismy nocicepce jsou pojaty pouze okrajovì. Tento pøehled se pokouší tyto základní údaje doplnit o nìkteré novìjší poznatky o mechanismech nocicepce, které vyplynuly ze studia aktivity jednotlivých nervových vláken u savcù vèetnì èlovìka a na izolovaných orgánech in vitro. Navíc informuje o nìkterých nových pøístupech výzkumu nocicepce na úrovni jednotlivých senzorických neuronù v tkáòové kultuøe, které pomocí moderních elektrofyziologických technik umožòují její studium na bunìèné a molekulární úrovni. Mìøení jednotkové aktivity pomalu vedoucích aferentních vláken u zvíøat Uplynulo témìø tøi ètvrtiny století od doby, kdy se neurofyziologùm poprvé podaøilo registrovat aktivitu z jednotlivých aferetních vláken obratlovcù. Bylo to pøedevším proto, že do výzkumu byly zavedeny zcela nové elektrofyziologické techniky, pøedevším osciloskop a zesilovaèe, jež umožnily registrovat velmi slabé elektrické signály vznikající v nervových vláknech pøi vzruchové aktivitì. Pionýry v této oblasti byl E. D. Adrian, jemuž se dostalo Nobelovy ceny v roce 1932, a jeho mladší spolupracovník Y. Zottermann z Karolinska Institutet ve Stockholmu. I když se dlouho nedaøilo registrovat vzruchovou aktivitu z pomalu vedoucích aferentních vláken skupiny Aδ a C, bylo zøejmé, že bolestivé podnìty, jako je bolestivé stisknutí nebo pálení, musí vyvolávat vzruchovou 8 BOLEST 1/99

aktivitu právì v tìchto vláknech. Pravdìpodobnì Zottermannova práce z roku 1939 je prvou publikací, která to dokazuje pøímo (Zotterman, 1939). V této dobì se stejnou problematikou v Edinburgu zaèal zabývat A. Iggo, kterému se podaøilo identifikovat aktivitu v jednotlivých C-vláknech a prokázat jejich pomalou rychlost vedení (< 1 m/s), (Iggo, 1959; Iggo, 1958). Tyto nálezy byly o nìco pozdìji plnì potvrzeny E. R. Perlem a jeho spolupracovníky, jimž se podaøilo intracelulárnì registrovat aktivitu z tìl senzorických neuronù ve spinálních gangliích, která pøichází jednotlivými C-vlákny (Bessou et al., 1971). Metodické pøístupy vypracované na anestezovaných zvíøatech umožnily studovat nocicepci pøedevším pùsobením fyzikálních podnìtù, jako je tlak a horko. Velmi obtížnì však šlo zkoumat vliv chemických látek, jež u èlovìka vyvolávají bolest (algogeny), jako jsou napøíklad slabé kyseliny, capsaicin, bradykinin a prostaglandiny. Studium uvedených chemických látek umožnily až izolované nervovì-orgánové preparáty. Techniku izolace testis ve spojení s horním spermatickým nervem u psa zavedli do neurofyziologického výzkumu japonští neurofyziologové Kumazawa a Mizumura v roce 1980 (Kumazawa a Mizumura, 1980). Ve spermatickém nervu lze pomìrnì snadno izolovat jednotlivá nervová vlákna a registrovat z nich vzruchovou aktivitu pøi dráždìní oblasti, kterou inervují. Ukázalo se, že asi 90 % tìchto vláken odpovídá vzruchovou aktivitou na všechny nocicepèní podnìty: mechanické, chemické i tepelné, a lze je proto považovat za polymodální nociceptory. Jiným významným typem preparátu urèeným pro studium vlastností nociceptorù byl nervovì kožní preparát mladých krys, u nìhož je izolovaná kùže inervována n. suralis. Tento experimentální model byl navržen P. W. Reehem (Reeh, 1986) a jeho skupinou v Erlangenu, je intenzivnì využíván ke studiu interakce bolest vyvolávajících podnìtù a analgetik. Preparát je uložen v komùrce a omýván roztokem, který umožòuje mnohahodinové pøežití a studium jak chemických látek, tak pøesnou lokalizaci mechanických nebo tepelných podnìtù. N. suralis ovšem obsahuje i velké množství myelinizovaných vláken, která slouží jiným modalitám kožního èití, a proto ke studiu nocicepce lze využít pouze nervová vlákna s pomalou rychlostí vedení. nebo obdobnými materiály až blízko jejich hrotu. Pravdìpodobnì se žádnou jinou technikou nebylo provedeno tolik neúspìšných pokusù jako na zaèátcích lidské mikroneuronografie (Handwerker, 1996). Jak se dalo pøedvídat, ukázalo se být snadnìjším registrovat nervovou aktivitu ze silnì myelinizovaných nervových vláken než ze slabých, nemyelinizovaných vláken (Hagbarth a Vallbo, 1967). Avšak již prvé práce ukázaly, že mikroneuronografie je u èlovìka schùdná, protože nezpùsobuje vážnìjší poškození nervu manipulací elektrodou pøi hledání vláken, která vykazují fyziologicky oèekávanou aktivitu, a lze ji využít i pro registraci vzruchové aktivity v nejslabších nervových vláken (Vallbo, 1991). Další vývoj pak potvrdil, že nocicepèní signalizaci zajiš ují pøedevším C-vlákna. Mikroneuronografie významnì obohatila naše poznatky o vztahu intenzity podnìtu a bolesti a o hyperalgezií a rùzných formách dysestezie, které nelze získat v pokusech na zvíøatech (Torebjörk a Hallin, 1970; Hallin a Torebjörk, 1970; Van Hees a Gybels, 1972). Uvedené studie též ukázaly, že je nutné pøedpokládat, že neexistuje pouze jeden typ polymodálních nociceptorù, nebo odpovìdi vykazují znaènou variabilitu, pokud jde o citlivost k rùzným typùm dráždìní fyzikálními nebo chemickými prostøedky. Rovnìž byly zjištìny znaèné rozdíly subjektivních vjemù pøi stimulaci jednotlivých nervových vláken pomocí pozdìji zavedené techniky mikrostimulace elektrickým proudem (Vallbo et al., 1984; Torebjörk et al., 1996). Dá se pøedpokládat, že mikroneuronografie v dohledné dobì pomùže i pøi objasnìní fyziologické úlohy tzv. mlèících nociceptorù, které odpovídají na mechanické nebo tepelné dráždìní až po pøedchozím podráždìní algogeny (Schmidt et al., 1995). Disociované neurony zadních koøenù míšních v tkáòové kultuøe jako model ke studiu bunìèných a molekulárních mechanismù nocicepce Nemyelinizovaná aferentní vlákna vytváøejí v periferii volná zakonèení, která jsou kryta Schwannovou pochvou. Jejich prùmìr je zpravidla menší než 1 µm (obr. 1). Jde o rozmìry tak malé, že vlákna jsou experimentálnì nedostupná pro vyu- Pùvodní práce Mikroneuronografie, technika umožòující registraci jednotlivých nervových vláken èlovìka O bolesti mùže informovat pouze èlovìk, a proto bylo nutné vyvinout takovou elektrofyziologickou techniku, která by pøi rùzných podnìtech periferního dráždìní umožòovala korelaci mezi nervovými projevy a subjektivním vjemem. Takovou technikou je mikroneuronografie, která pøedstavuje nejnároènìjší klinicky využitelnou metodu pro studium bolesti. I když pionýrské práce, které umožnily registrovat vzruchovou aktivitu jednotlivých nervových vláken na èlovìku, byly provedeny pomocí bipolárních háèkových elektrod na vypreparovaných nervech vlastních experimentátorù (Hensel a Boman, 1960), bylo od samého zaèátku jasné, že tímto zpùsobem cesta k širšímu využití nepovede. Slibnìjším pøístupem se zdála být jednoelektrodová technika, která byla vyvinuta v Uppsale, pøí níž se vyšlo ze zkušeností získaných v experimentálním neurofyziologickém výzkumu pøi snímání jednotkové aktivity v centrálním nervovém systému. Pro svoji mechanickou odolnost to byly pøedevším elektrolyticky zbroušené wolframové elektrody, které byly izolovány lakem BOLEST 1/99 Obr. 1: Volné nervové zakonèení tvoøené nemyelinizovaným aferentním vláknem krytým Schwannovou pochvou (kùže èlovìka, podle Cauna, 1980). 9

Pùvodní práce žití moderních elektrofyziologických technik umožòujících výzkum vlastností membránových receptorù a iontových kanálù. Tyto receptory a iontové kanály pøedstavují komplexní bílkovinné struktury zabudované v plazmatické membránì bunìk, které pøi své aktivaci umožòují tok iontù ve smìru jejich elektrochemického gradientu, a øídí tak frekvenci vzruchové aktivity pøicházející do míchy jako základní informace. Nìkteré iontové kanály se otevírají pøi zmìnì napìtí, tj. zmìnì membránového potenciálu, jiné se aktivují úèinkem chemické látky, která se naváže na specifické vazebné místo proteinového komplexu, èímž zmìní jeho konformaci a umožní otevøení iontového kanálu a tok iontù. V bunìèné membránì existují rovnìž specifické receptory, které pøi navázání chemické látky (mediátoru) aktivují intracelulární procesy, jež mohou funkci iontových kanálù ovlivòovat z vnitøní strany (pro bližší informaci viz Hille, 1992; Aidley a Stanfield, 1996; Vyklický a Vyskoèil, 1993). I když nelze vlastnosti tìchto proteinù studovat na nervových zakonèeních pøímo, nikdy nebylo pochyb o jejich existenci a vysoké specifiènosti. Pro další výzkum mechanismù nocicepce se ukázaly být rozhodujícími poznatky molekulární biologie, z nichž vyplynulo, že všechny bílkoviny se vytváøejí složitým procesem transkripce DNK na RNK a její translace na bílkoviny. Pøi tomto procesu je využíváno 20 aminokyselin pøedstavujících základní elementy, jejichž sekvence rozhoduje o funkci proteinu (Watson et al., 1988). Proces transkripce a translace se odehrává v jádøe a bunìèném tìle, odkud se bílkoviny dostávají axonovým transportem na místo svého urèení, kde plní svou fyziologickou funkci in vivo. Dalo se proto pøedpokládat, že v podmínkách tkáòových kultur se iontové kanály a receptory senzorických neuronù funkènì exprimují i v jejich bunìèném tìle. Velikost tìl tìchto neuronù je dostaèující k tomu, aby jejich vlastnosti mohly být studovány moderními elektrofyziologickými technikami. Prvou prací, která z tìchto pøedpokladù vyšla, byla studie Baccagliniho a Hogana (Baccaglini a Hogan, 1983), kteøí využili tkáòových kultur pøipravených z neuronù ganglií zadních koøenù míšních a klasickou technikou intracelulárního snímání mìøili zmìny membránového potenciálu po aplikaci rùzných chemických látek. V této práci jako první zjistili, že capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamid, látka obsažená v rùzných druzích pálivé papriky) depolarizuje pouze nìkteré malé senzorické neurony a vyvolává v nich vzruchovou aktivitu. Toto zjištìní je vedlo k názoru, že senzorické neurony v tkáòové kultuøe mohou být vhodným modelem pro studium bunìèných mechanismù nocicepce. Trvalo však øadu let než byl tento názor pøijat, ponìvadž mnoho neurofyziologù se obávalo, že bude obtížné odlišit neurony, které pøedstavují nociceptory od neuronù, které by in vivo sloužily jiným modalitám èití, napøíklad propriocepci nebo epikritickému èití. Existovaly i obavy, že podmínky kultivace mohou proces exprese bílkovinných struktur pozmìnit nepøedvídatelným zpùsobem (viz Vyklický a Knotková, 1996). Dramatický vývoj výzkumu molekulárních mechanismù nocicepce, který následoval a který probíhá v souèasnosti, byl umožnìn zavedením techniky terèíkového zámku, patch-clamp technique (Hamill et al., 1981), za niž E. Neher a B. Sakmann byli v roce 1991 ocenìni Nobelovou cenou. Významným pøínosem pro další výzkum pøedstavoval i vývoj technik, které umožòují rychlou aplikaci chemických látek kolem vyšetøovaného neuronu. Velikost neuronu a jeho citlivost na capsaicin se staly hlavním vodítkem pøi identifikaci nociceptorù mezi neurony izolovanými z ganglií zadních koøenù míšních, které jsou pìstovány v podmínkách tkáòových kultur. V dalším jsou uvedeny nìkteré pøíklady výsledkù tohoto výzkumu. Capsaicinový receptor Capsaicin, tato pozoruhodná, organismu cizí látka, která pùsobí selektivní aktivaci skupiny nociceptivních neuronù, zaèali intenzivnì studovat maïarští neurofyziologové G. Jancso, A. Jancso-Gabor a J. Szolczanyi na systémové úrovni (viz Szolcsanyi, 1991). Z jejich studií vyplynulo, že capsaicin je velmi intenzivním algogenem, který u èlovìka vyvolává palèivou bolest a experimentálnì mùže vést k degeneraci malých senzorických neuronù pøedevším u mladých jedincù (pro pøehled viz Fitzgerald, 1983). Capsaicin, aplikován již v koncentraci nižší než 1 µm, vyvolává asi u 70 % malých senzorických neuronù v tkáòové kultuøe (< 25 µm v prùmìru ) membránový proud, který je nesen kationty vèetnì vápníku. Velké neurony jsou ke capsaicinu zcela necitlivé, jsou zato vysoce citlivé na kyselinu γ-amino-máselnou (GABA), jež je klasickým inhibièním mediátorem (obr. 2). Tyto dva typy odpovìdí se znaènì liší i svými kinetickými charakteristikami; aktivace odpovìdí vyvolaných capsaicinem je podstatnì pomalejší než nástup odpovìdi vyvolané aplikací GABA (Vlachová a Vyklický, 1993). Membránové proudy vyvolané capsaicinem jsou neseny kationty, jejichž tok za fyziologických okolností smìøuje dovnitø buòky. V dùsledku toho vzniká depolarizace, která pøi dosažení jisté úrovnì vyvolává vzruchovou aktivitu. Ta se podle zákona vše, nebo nic pøenáší po celém neuronu do míchy. Opakovaná nebo dlouhotrvající aplikace capsaicinu vede k desenzitizaci, tzn. že další odpovìï je nižší než odpovìï pøedchozí. Pøíèina vzniku desenzitizace capsaicinového receptoru (lépe tachyfylaxe, nebo jde o jev prakticky nevratný) Obr. 2: Membránové proudy vyvolané rychlou aplikací GABA a capsaicinu (CAPS), zaznamenané technikou patch clamp v konfiguraci snímání proudu z celé buòky na dvou odlišných senzorických neuronech v téže tkáòové kultuøe. A. Záznam odpovìdí z vìtšího unipolárního neuronu (prùmìr 30 µm). B. Záznam z malého bipolárního neuronu (10 µm x 20 µm). Membránový potenciál -50 mv. Trvání aplikace látek je vyznaèeno vždy silnou horizontální èarou nad záznamem (Vlachová a Vyklický, 1993). 10 BOLEST 1/99

byla vysvìtlena aktivací fosfatázy 2B (kalcineurin), jež je enzymem, který defosforyluje nìkteré intracelulární proteiny vèetnì té èásti capsaicinového receptoru, která smìøuje dovnitø buòky (Docherty et al., 1996). Opakovanou nebo dlouhotrvající aplikací navozená desenzitizace capsaicinového receptoru je jedním z možných mechanismù analgetického úèinku capsaicinových náplastí používaných v tradièní medicínì k léèení nìkterých forem benigní bolesti. V roce 1997 se podaøilo molekulárnì genetickými metodami založenými na principu PCR (polymerázové øetìzové reakce) capsaicinový receptor identifikovat (Caterina et al., 1997). Autoøi vyšli z pøedpokladu, že komplementární DNA kódující capsaicinový receptor urèuje obecnì citlivost ke capsaicinu. Zpùsob, kterým se podaøilo z rozsáhlé knihovny komplementárních DNA capsaicinový receptor identifikovat, spoèíval v jeho charakteristické vysoké propustnosti pro vápník. Buòky transfekované jednotlivými klony cdna podrobili autoøi mikroskopickému fluorescenènímu zobrazení a jako pozitivní byl vybrán klon, který pøi aplikaci capsaicinu vyvolal znaèné zvýšení koncentrace vápníku uvnitø buòky. Takto naklonovaný receptor byl oznaèen jako vaniloidní receptor podtypu 1, VR1. Protein je tvoøen 838 aminokyselinami uspoøádanými do šesti transmembránových domén a jedné neúplné hydrofobní smyèky (obr. 3). Není bez zajímavosti, že ve struktuøe VR1 byly nalezeny významné homologie se skupinou vápníkových iontových kanálù, jež se otevírají pøi vyèerpání zásob vápníku z endoplazmatického retikula. Tento typ iontových kanálù se úèastní na pøenosu svìtelných podnìtù a byl dosud identifikován ve svìtloèivných buòkách sítnice mouchy Drosophila. ho ph 7,3 až na hodnotu 5,5) (Lindahl, 1961). Mediátory zánìtu nehrají svoji roli pouze pøi zánìtu, je dobøe známo, že tyto látky plní významnou úlohu v celé øadì fyziologicky významných funkcí. Nelze se proto divit, že pro každý z nich existuje nìkolik receptorù, jejichž molekulární struktura byla již identifikována a existují pro nì specifické blokátory. Pro bradykinin existují nejménì dva receptory, pro serotonin sedm a pro prostaglandiny nejménì dva. Protony jsou ve svých úèincích málo specifické, nebo svým pozitivním nábojem mohou mìnit terciární strukturu mnoha proteinù vèetnì iontových kanálù. Tyto uvedené specifické receptory až na malé výjimky pùsobí prostøednictvím druhých poslù a nìkteré z nich jsou funkènì exprimovány i na neuronech izolovaných z ganglií zadních koøenù míšních. Zjistilo se, že mediátory zánìtu mohou významnì aktivovat capsaicinový receptor pouze ve vzájemné kombinaci, a to ještì v podmínkách kyselého prostøedí, v nìmž se rovnìž znaènì zvyšuje úèinnost capsaicinu. Na obrázku 4 jsou ukázány membránové proudy (A) a depolarizace neuronu (B) vyvolané aplikací mediátorù zánìtu. Ze záznamù je patrné, že kombinace mediátorù zánìtu (bradykinin, serotonin a prostaglandin E 2 ) v kyselém prostøedí vyvolává výrazný membránový proud a významnou depolarizaci neuronu. Ze záznamu je rovnìž patrné, že pøítomnost kyselého prostøedí výraznì facilituje i úèinek capsaicinu. Mediátory zánìtu spoleènì pùsobí Pùvodní práce Obr. 3: Membránová topologie vaniloidního receptoru VR1 získaná analýzou hydrofobních vlastností. Protein je uspoøádán v šesti doménách procházejících membránou a obsahuje jednu neúplnou hydrofobní smyèku umístìnou mezi 5. a 6. transmembránovou doménou. Hydrofilní segment s aminoskupinou NH 2 (N) obsahuje tøi ankyrinové domény (A). (C) Øetìzec aminokyselin obsahující karboxylovou skupinu COOH (Caterina et al., 1997). Capsaicin je pro lidský organismus cizorodou látkou. Pro cizorodou látku však pøíroda ve své historii žádný receptor nevytvoøila. Dalo se proto pøedpokládat, že pro tento receptor musí existovat endogenní mediátory, které se tvoøí v samotném organismu. Vzhledem k charakteru bolesti, kterou capsaicin vyvolává, pøicházely v úvahu pøedevším mediátory zánìtu, které se uvolòují do okolí z poranìné tkánì. Jde pøedevším o bradykinin, serotonin a prostaglandiny. Vedle tìchto látek významnou úlohu pøi vzniku bolesti hrají i protony, nebo se zjistilo, že v exsudátech vznikajících pøi zánìtlivých procesech mùže být ph znaènì sníženo (z fyziologické- BOLEST 1/99 Obr. 4: Odpovìdi vyvolané mediátory zánìtu a capsaicinu na neuronu zadních koøenù míšních v tkáòové kultuøe. Prùmìr neuronu: 22 µm. A. Membránové proudy vyvolané aplikací mediátorù zánìtu a capsaicinu v následujícím poøadí zleva doprava, v závorce vždy s uvedenou hodnotou ph: extracelulární roztok (ECS, ph 6,1), prostaglandin E 2 (PE 2, ph 7,3), PE 2 (ph 6,1), mediátory zánìtu: bradykinin 10 µm, serotonin 5-HT 10 µm a PE 2 1 µm (IM, ph 7.3), IM (ph 6,1), ECS (ph 6,1), capsaicin 6 µm (CAPS, ph 7,3), CAPS (ph 6,1). B. Zmìny membránového potenciálu vyvolané výše uvedenými látkami aplikovanými ve shodném poøadí a na stejném neuronu jako v A. Klidový membránový potenciál -62 mv. Horizontální plné èáry nad záznamy indikují trvání aplikace uvedených látek, nevyplnìné èáry oznaèují ph 6,1 (Vyklický et al., 1998a). 11

Pùvodní práce na capsaicinový receptor (obr. 5), protože jejich úèinek lze blokovat capsazepinem, který je kompetitivním antagonistou capsaicinu (Vyklický et al., 1998a). Tyto nálezy ukazují, že bradykinin, serotonin a prostaglandin vedle svého pùsobení na specifické receptory pøedstavují endogenní mediátory pùsobící na capsaicinovém receptoru. Jejich potence aktivovat tento receptor je však podstatnì nižší, než je tomu u capsaicinu. Obr. 5: Kompetitivní antagonista capsaicinu, capsazepin, inhibuje membránové proudy vyvolané kombinací mediátorù zánìtu, ale neinhibuje mebránové proudy vyvolané kyselým prostøedím. A. Capsazepin blokuje zvýšení odpovìdi vyvolané aplikací mediátorù zánìtu (bradykinin, 5-HT a PE 2 ) v kyselém prostøedí ph 6,1. Capsazepin (ZP) byl aplikován v koncentraci 10 µm and 3 µm, jak je uvedeno. B. Capsazepin blokuje membránové proudy vyvolané mediátory zánìtu a capsaicinem, neblokuje však odpovìdi vyvolané zmìnou ph na 5,5. Úèinek capsazepinu byl testován vždy jako první, aby se pøedešlo desenzitizaci zpùsobené opakovanou aplikací dané látky. ZP, capsazepin (6 µm), CAPS, capsaicin (5 µm). (Vyklický et al., 1998a). Membránové receptory senzorických neuronù aktivované tepelným podnìtem Bolest po popálení je klinickým problémem zejména pro svoji bezprostøední krutost a sekundární úèinky. Bolest, která vzniká pøi zvyšování teploty nad úroveò, pøi níž mùže dojít k poškození tkánì, je posledním varováním organismu. Obranné reakce na potenciálnì poškozující horko vznikají nejen u všech obratlovcù, ale i u primitivních organismù. Dá se proto pøedpokládat, že existuje specifický protein urèený pro detekci teploty, která ohrožuje organismus. Práh pro bolest vyvolanou zvyšováním teploty se mìøí obtížnì, nebo nervová zakonèení jsou uložena v kùži hloubìji, kde aplikované teplo mùže být odvádìno krví. Existuje však dobrá shoda mezi neurofyziology, že nejnižší teplotou, kterou lze bolest vyvolat, je 43-45 o C. Pøi opakované aplikaci teploty, kterou bylo dosaženo prahu bolesti, nebo po lehkém popálení se tento práh snižuje, takže bolest mùže být vyvolána i nižší teplotou - za normálních okolností fyziologickou. Bolest vyvolaná horkem mùže být znaènì zvýšena pøítomností algogenù. Tyto poznatky vyplynuly z psychofyziologických pokusù na èlovìku i z experimentù provedených na nervovì orgánových preparátech in vitro (Kress a Reeh, 1996; Kumazawa, 1996). Hlubší analýzu procesù, které se odehrávají v nociceptorech pøi pùsobení horka, umožnily až pokusy na izolovaných neuronech zadních koøenù míšních. Rychlým zvýšením teploty extracelulární tekutiny omývající neuron na hodnotu, která by byla èlovìkem poci ována jako bolestivá ( 49 C), se podaøilo Cesareovi a McNaughtonovi (1996) zjistit membránové proudy, které jsou zpùsobeny tokem kationtù, vèetnì Ca 2+, do nitra buòky. Takový typ membránového proudu se vyskytuje výluènì na malých senzorických neuronech. Uvedený poznatek byl záhy doplnìn Kirschsteinem a spol. (1997), kteøí zjistili, že tyto teplotnì senzitivní neurony jsou citlivé rovnìž na capsaicin. Zùstalo však otevøenou otázkou, zda jde o stejný typ iontových kanálù, které se aktivují horkem i capsaicinem, nebo zda jde o dva typy odlišných receptorù (iontových kanálù) exprimovaných na neuronech stejného typu. Charakteristickým rysem bílkovin je nízká stabilita konformace jejich terciární struktury, která je za fyziologických okolností udržována slabými vazbami: vodíkovými mùstky, van der Waalsovými silami atd. Termodynamickou stabilitu vazeb biologicky aktivních bílkovin lze kvantifikovat vyjádøením hodnoty relativního zvýšení aktivity pøi zvýšení teploty o 10 o C, tzv. teplotním koeficientem Q 10. Zmìny membránového proudu jsou pøímým odrazem termodynamických vlastností iontových kanálù, proto elektrofyziologická technika terèíkového zámku je velmi vhodným experimentálním pøístupem k mìøení teplotní závislosti nervových bunìk. Mìøení, která dovolila charakterizovat vlastnosti bílkovinných struktur odpovìdných za membránový proud vyvolaný horkem, vyžadovala novou techniku umožòující aplikovat v bezprostøedním okolí neuronu roztoky rùzného složení pøi stejnì definovaném prùbìhu teploty (Dittert et al., 1998). Touto technikou se podaøilo ukázat, že membránový proud u senzorických neuronù v tkáòové kultuøe citlivých na capsaicin vykazuje práh pøi dosažení teploty kolem 43 C a prudce vzrùstá až do teploty 52 C. V tomto teplotním intervalu je membránový proud charakterizován vysokým teplotním koeficientem Q 10, což ukazuje na významné konformaèní zmìny proteinu, jenž se na vzniku membránového proudu podílí (Vlachová et al., 1998; Vyklický et al., 1998b). Jak je patrno z obrázku 6, zvýšením teploty z 24 C až na 42 C je vyvolána jen malá zmìna membránového proudu. V zobrazení, ve kterém je logaritmus absolutní hodnoty membránového proudu vynesen v závislosti na pøevrácené hodnotì absolutní teploty (tzv. Arrheniova závislost), lze nalézt smìrnici, která v nižším teplotním intervalu (26-36 C) vykazuje nízké hodnoty teplotního koeficientu (Q 10 = 2,4). To znamená, že iontové kanály, které jsou aktivované pøi zvýšení teploty v tomto intervalu, vykazují termodynamickou stabilitu typickou pro mnoho jiných proteinù. V pøípadì aktivace iontových kanálù jde o zvýšení vodivosti, èi pravdìpodobnosti jejich otevøení. V intervalu vyšších teplot, tj. 43-51 o C, smìrni- 12 BOLEST 1/99

ce Arrheniovy závislosti prudce stoupá a blíží se k hodnotì Q 10 = 25. Tato vysoká hodnota teplotního koeficientu svìdèí o velké teplotní citlivosti membránových struktur, charakteristické jen pro uvedenou skupinu teplotnì citlivých neuronù. Vznik membránového proudu vyvolaného tepelným podnìtem je procesem rychlým a do znaèné míry reverzibilním (viz obr. 6 B). Jestliže je neuron vystaven vyšší teplotì, než je teplota varovná (tj. nad 52 C), dochází k nevratným zmìnám proteinových struktur zodpovìdných za vznik membránového proudu. Po jediném tepelném stimulu, který dosahoval 55 C, je následující proudová odpovìï podstatnì menší, zato ji lze vyvolat již pøi podstatnì nižší teplotì (obr. 7). U velkých neuronù, které jsou necitlivé na capsaicin, lze pøi zvýšení teploty až nad 53 C pozorovat pouze proudy, které vykazují nízký teplotní koeficient Q 10 ( 2). To dokazuje, že vedle receptorù pro algogeny jsou nociceptory ve své membránì vybaveny komplexní bílkovinou, receptorem, který je aktivován tepelnými podnìty, které dosáhly nocicepèní hodnoty tj. více než 43 C. Jedna ze souèasných hypotéz pøedpokládá, že tento teplotnì citlivý receptor je tvoøen nìkolika podjednotkami, jež se z komplexu uvolòují pøi potenciálnì poškozující teplotì a aktivují specifickou skupinu kationtových kanálù. V nižších teplotách se podjednotky ochotnì opìt shlukují, ale tato vlastnost vytváøet komplex se mùže nevratnì ztratit po vystavení membrány neuronu nadmìrnì vysoké teplotì. Uvolnìné podjednotky pak mohou aktivovat pøíslušné iontové kanály pøi teplotách nižších (Vyklický et al., 1998b). Nové metodické pøístupy pro studium nocicepce odhalují bohatost a zároveò vysokou specifiènost proteinových struk- Pùvodní práce Obr. 6: Membránové proudy vyvolané teplem na malých senzorických neuronech v tkáòové kultuøe. A. Technika rychlého øízení teploty roztokù aplikovaných na neuron v tkáòové kultuøe. Princip techniky spoèívá v ohøevu spoleèného výtoku svazku 10 kapilár napojených k nádobám naplnìným testovacími roztoky. Topným elementem je platinová vrstva pokrývající spoleènou kapiláru výtoku, která je elektricky spojená s øídící jednotkou (sonda). Stejnosmìrný proud urèený pro øízení ohøevu (HC) je generován externì. Teplota roztokù protékajících výtokovou kapilárou je registrována miniaturním termoèlánkem umístìným ve výtokové kapiláøe (TC 1) (Dittert et al., 1998). B. Membránový proud snímaný z malého senzorického neuronu v tkáòové kultuøe, který byl vyvolán lineárnì rostoucím tepelným podnìtem. Prùbìh teploty extracelulárního roztoku omývajícího neuron je zobrazen vždy nad záznamem proudu. Membránový potenciál -60 mv. Neuron byl citlivý na capsaicin. C. Arrheniova závislost (logaritmus absolutní hodnoty normalizovaného membránového proudu vynesen v závislosti na pøevrácené hodnotì absolutní teploty) membránového proudu uvedeného v B. Teplotní koeficient byl stanoven na lineárních úsecích Arrheniovy závislosti (prázdné symboly) a prùseèík regresních pøímek (teèkovaná èára) lze považovat za prahovou teplotu pro vyvolání horkem indukovaného membránového proudu (42 C, oznaèeno šipkou). Hodnota teplotního koeficientu, Q 10 = 25, svìdèí o vysoké teplotní citlivosti senzorického neuronu. D. Membránový proud snímaný z neuronu necitlivého na capsaicin. Postupné zvyšování teploty vede k vyvolání jen malých proudových zmìn (< 100 pa). E. Arrheniova závislost membránového proudu uvedeného v D. Teplotní citlivost neuronu je charakterizována jen nízkými hodnotami teplotního koeficientu (Q 10 = 1,9 a 3,9) BOLEST 1/99 Obr. 7: Úèinek poškozujícího horka na proudovou odpovìï neuronu. A. První proudová odpovìï je vyvolána aplikací teploty dosahující 55 C (teèkovaná èára) na senzorický neuron v tkáòové kultuøe. Maximální odpovìdi bylo dosaženo pøi 53 C, další zvýšení teploty již vyvolaný proud nezvyšovalo. Membránový potenciál -60 mv. B. Následující proudová odpovìï je pøi stejném teplotním podnìtu vyvolána již pøi nižší teplotì, maximální dosažená hodnota proudu je však podstatnì menší. C. Arrheniova závislost proudových odpovìdí uvedených v A a B. Zatímco nejvyšší hodnota Q 10 = 33,7 stanovená pro první záznam A (plné symboly) dokazuje vysokou teplotní citlivost neuronu, záznam B (nevyplnìné symboly) je charakterizován v širokém teplotním intervalu 25-47 C pouze hodnotou Q 10 = 2,1. 13

Pùvodní práce tur, které jsou v ní zapojeny. Tyto struktury se nevyskytují u senzorických neuronù, které slouží jiným modalitám èití, jako je propriocepce nebo epikritické èití. Spíše lze hledat analogii v jiných senzorických orgánech, napøíklad receptorech pro zrak v sítnici, nebo receptorech pro èich a chu. I ty jsou souèástí senzorických orgánù, které umožòují rychlou orientaci a adaptaci organismu ke zmìnám a potenciálnímu nebezpeèí zevního prostøedí. Tyto senzorické orgány umožòují pøenos informace na urèitou, nìkdy i znaènou, vzdálenost. Receptory pro nocicepci jsou však výjimeèné tím, že na rozdíl od ostatních senzorù zprostøedkovávají informaci až pøi bezprostøedním nebezpeèí destrukce organismu. Literatura nerves in human subjects. J Neurophysiol 1960;23:564-578. 16. Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. 1992, Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc., 2nd edition 1992:607. 17. Iggo A. Cutaneous heat and cold receptors with slowly conducting (C) afferent fibres. Q J Exp Physiol 1959;44:362-370. 18. Iggo A. The electrophysiological identification of single nerve fibres, with particular reference to the slowest conducting vagal afferent fibres in the cat. J Physiol (Lond) 1958;142:110-126. 19. Kirschstein T, Busselberg D, Treede RD. Coexpression of heatevoked and capsaicin-evoked inward currents in acutely dissociated rat dorsal root ganglion neurons. Neurosci Lett 1997;231:33-36. 20. Kress M, Reeh PW. Chemical excitation and sensitization in nociceptors. In: Belmonte C and Cervero F, eds. Neurobiology of nociceptors, New York: Oxford University Press. 1996:258-297. 1. Aidley DJ, Stanfield PR. Ion Channels. Molecules in Action. Cambridge: Press Syndicate of the University of Cambridge 1996:307. 2. Albe-Fessard D. Bolest. Mechanismy a základy léèení. Praha: Grada Publishing, 1998:224. 3. Baccaglini PI, Hogan PG. Some rat sensory neurons in culture express characteristics of differentiated pain sensory cells. Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:594-598. 4. Bessou P, Burgess PR, Perl ER, Taylor CB. Dynamic properties of mechanoreceptors with unmyelinated C fibers. J Neurophysiol 1971; 34:116-131. 5. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997;389:816-824. 6. Cauna N. Fine morphological characteristics and microtopography of the free nerve endings of the human digital skin. Anat Rec 1980; 198:643-656. 7. Cesare P, McNaughton P. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:15435-15439. 8. Dittert I, Vlachová V, Knotková H, Vitasková Z, Vyklický L, Kress M, Reeh PW. A technique for fast application of heated solutions of different composition to cultured neurones. J Neurosci Methods 1998; 82:195-201. 9. Docherty RJ, Yeats JC, Bevan S, Boddeke HW. Inhibition of calcineurin inhibits the desensitization of capsaicin-evoked currents in cultured dorsal root ganglion neurones from adult rats. Pflügers Arch 1996; 431:828-837. 10. Fitzgerald M. Capsaicin and sensory neurones-a review. Pain 1983; 15:109-130. 11. Hagbarth KE, Vallbo AB. Mechanoreceptor activity recorded percutaneously with semi- microelectrodes in human peripheral nerves. Acta Physiol Scand 1967;69:121-122. 12. Hallin RG, Torebjörk HE. Afferent and efferent C units recorded from human skin nerves in situ. A preliminary report. Acta Soc Med Uppsal 1970;75:277-281. 13. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch 1981;391:85- -100. 14. Handwerker HO. Sixty years of C-fiber recordings from animal and human skin nerves: historical notes. Prog Brain Res 1996;113:39-51. 15. Hensel H, Boman KKA. Afferent impulses in cutaneous sensory 21. Kumazawa T. Sensitization of polymodal nociceptors. In: Belmonte C and Cervero F, eds. Neurobiology of nociceptors, New York: Oxford University Press. 1996:325-345. 22. Kumazawa T, Mizumura K. Mechanical and thermal responses of polymodal receptors recorded from the superior spermatic nerve of dogs. J Physiol (Lond) 1980;299:233-245. 23. Lindahl O. Experimental skin pain. Acta Physiol Scand 1961;51: 1-90. 24. Reeh PW. Sensory receptors in mammalian skin in an in vitro preparation. Neurosci Lett 1986;66:141-146. 25. Schmidt R, Schmelz M, Forster C, Ringkamp M, Torebjörk E, Handwerker H. Novel classes of responsive and unresponsive C nociceptors in human skin. J Neurosci 1995;15:333-341. 26. Szolcsanyi J. Perspectives of capsaicin-type agents in pain therapy and research. In: Winston C V Parris ed. Contemporary Issues in Chronic Pain Management.: Kluwer Academic Publishers, Boston, Dordrech, London 1991:97-122. 27. Torebjörk HE, Hallin RG. C-fibre units recorded from human sensory nerve fascicles in situ. A preliminary report. Acta Soc Med Ups 1970;75:81-84. 28. Torebjörk HE, Schmelz M, Handwerker HO. Functional properties of human cutaneous nociceptors and their role in pain and hyperalgesia. In: Belmonte C and Cervero F, Neurobiology of nociceptors. New York: Oxford University Press. 1996:349-369. 29. Vallbo AB. Microneurography - How it started. In: Stalberg E and Torebjörk HE: Clinical Neurophysiology at the University Hospital, Uppsala, Sweden (1958-1991). 1991:31-38. 30. Vallbo AB, Olsson KA, Westberg KG, Clark FJ. Microstimulation of single tactile afferents from the human hand. Sensory attributes related to unit type and properties of receptive fields. Brain 1984;107: 727-749. 31. Van Hees J, Gybels JM. Pain related to single afferent C fibers from human skin. Brain Res 1972;48:397-400. 32. Vlachová V, Vitásková Z, Kabát M, Vyklický L. Heat-induced membrane currents in small sensory neurones. Europ J Neurosci 1998;10: 80. 33. Vlachová V, Vyklický L. Capsaicin-induced membrane currents in cultured sensory neurons of the rat. Physiol Res 1993;42:301-311. 34. Vyklický L, Knotková H. Can sensory neurones in culture serve as a model of nociception? Physiol Res 1996;45:1-9. 35. Vyklický L, Knotková-Urbancová H, Vitasková Z, Vlachová V, Kress M, Reeh PW. Inflammatory mediators at acidic ph activate 14 BOLEST 1/99

capsaicin receptors in cultured sensory neurons from newborn rats. J Neurophysiol 1998;79:670-676. 36. Vyklický L, Vlachová V, Vitásková Z, Kabát M. The effects of algogens on membrane currents induced by noxious heat in sensory neurones from newborn rats. J Physiol (Lond) 1998;511P:125P. 37. Vyklický L, Vyskoèil F. Molekulární podstata dráždivosti nervového systému. Èeskoslovenská fyziologie 1993;41:69-142. 38. Watson JD, Tooze J, Kurtz DT. Rekombinantní DNA. Krátký kurs. Praha: Academia. 1988:293. 39. Zotterman Y. Touch, pain and tickling. An electrophysiological investigation on cutaneous sensory nerve. J Physiol (Lond) 1939;95:1- -28. RNDr. Viktorie Vlachová, CSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská 1083 142 20 Praha 4 MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská 1083 142 20 Praha 4 Pùvodní práce BOLEST 1/99 15