ANKYRINOVÝ RECEPTOR IONTOVÝ KANÁL AKTIVOVANÝ PSYCHOAKTIVNÍMI LÁTKAMI:

Transkript

1 ANKYRINOVÝ RECEPTOR IONTOVÝ KANÁL AKTIVOVANÝ PSYCHOAKTIVNÍMI LÁTKAMI: SOUVISLOST S MECHANIZMY NOCICEPCE ANKYRIN RECEPTOR ION CHANNEL ACTIVATED BY PSYCHOACTIVE DRUGS: ITS RELATION TO THE MECHANISMS OF NOCICEPTION LUCIE SURÁ, VLASTIMIL ZÍMA, FILIP TOUŠKA, VIKTORIE VLACHOVÁ Fyziologický ústav AV ÈR, v.v.i., Praha SOUHRN Ankyrinový receptor typu 1 (TRPA1) je iontový kanál, jehož funkce se uplatòuje v pøenosu bolestivých podnìtù na primárních nociceptivních neuronech. Tento receptor patøí do skupiny TRP (transient receptor potential) iontových kanálù, rùznorodé tøídy membránových receptorù, z nichž mnohé zprostøedkovávají senzorické vjemy pøicházející z okolního prostøedí: algogenní, pálivé nebo chladivé látky nacházející se v rùzných rostlinách, bolestivé teplo nebo chlad. TRPA1 kanál lze aktivovat øadou dráždivých látek, organosulfátù, obsažených v hoøèici, køenu, èesneku nebo cibuli, dráždivými aldehydy nacházejícími se ve výfukových a slzných plynech nebo v cigaretovém kouøi. Tento iontový kanál je ale také pøímo aktivován chladem, mediátory zánìtu, endogenními produkty oxidativního stresu a pøekvapivì i psychoaktivními látkami, jako jsou fytokanabinoidy. Cílem tohoto pøíspìvku je informovat o souèasných poznatcích týkajících se strukturálních, funkèních a farmakologických vlastností TRPA1 receptoru, zejména z hlediska možného fyziologického významu a pøípadných souvislostí s periferními mechanizmy nocicepce, které byly v uplynulých letech studovány na oddìlení bunìèné neurofyziologie Fyziologického ústavu AV ÈR, v.v.i. ( cz/d331/index.htm). Klíèová slova: nocicepce, ankyrinový receptor, bolest, chlad, termo-trp receptory, ganglia zadních koøenù míšních, senzorická transdukce, hyperalgezie SUMMARY The ankyrin transient receptor potential subtype 1 (TRPA1) is an ion channel that is highly expressed in primary sensory neurons with nociceptive properties. This channel belongs to a diverse collection of membrane proteins: transient receptor potential (TRP) channel superfamily, some members of which mediate a variety of sensory qualities that are clearly related to pain: stinging, pricking, warmth, burning or cold. The TRPA1 channel can be activated by some organosulfur compounds contained in mustard oil, horse radish or garlic, environmental irritants contained in air polution, cigarette smoke or tear gas, by cold, inflammatory mediators and, interestingly, also by some psychoactive drugs such as phytocannabinoids. The purpose of this article is to give an overview of the pharmacological, structural and functional properties of the TRPA1 receptor with a focus on its potential physiological role in peripheral mechanisms of nociception that have been studied at the Department of Cellular Neurophysiology of the Institute of Physiology AS CR, v.v.i. ( Key words: nociception, ankyrin receptor, pain, cold, thermo-trp receptors, dorsal root ganglia, sensory transduction, hyperalgesia Surá L, Zíma V, Touška F, Vlachová V. Ankyrinový receptor iontový kanál aktivovaný psychoaktivními látkami: souvislost s mechanizmy nocicepce. Psychiatrie 2010; 14(Suppl. 2): 4 8. Úvod Mechanizmy zajišśující vnímání bolesti jsou spolu s dalšími orgány smyslového èití souèástí senzorického systému, který informuje organizmus o aktuálním stavu zevního prostøedí a umožòuje mu tak èelit pøípadnému nebezpeèí v jeho okolí. Specializované proteiny, které na periferních zakonèeních primárních aferentních senzorických neuronù pøevádìjí podnìty rùzných modalit na elektrickou signalizaci, pøedstavují tak zøejmì jeden z vývojovì nejstarších obranných mechanizmù, který hraje nezastupitelnou úlohu z hlediska zachování života a integrity vnitøního prostøedí organizmù. Významnou skupinou proteinù, která právì takovou úlohu polymodálních senzorù v organizmu zastává, je rozsáhlá rodina tzv. transient receptor potential (TRP) iontových kanálù (Montell, 2005; Nilius et al., 2007; Wang and Woolf, 2005). TRP proteiny jsou exprimovány na mnoha buòkách a tkáních lidského tìla, v jejichž plazmatických membránách vytváøejí komplexy iontových kanálù úèastnící se regulace rùzných bunìèných funkcí. Objev specifické podskupiny TRP iontových kanálù, které se nacházejí v hojné míøe na periferních zakonèeních nociceptivních neuronù, v posledním desetiletí silnì poznamenal nové smìry výzkumu mechanizmù nocicepce, motivované snahou nalézt nové úèinnìjší látky s analgetickým pùsobením (Wong a Gavva, 2009). Mnoho cenných informací o mechanizmech pøenosu bolestivých podnìtù bylo v prùbìhu druhé poloviny minulého století získáno na neuronech izolovaných z ganglií zadních koøenù míšních a na neuronech trigeminálních ganglií. Postupnì bylo prokázáno, že zvláštní vlastností neuronù vykazujících nocicepèní charakteristiku je citlivost ke kapsaicinu a že tato vlastnost je zprostøedkována specifickými receptory. Vaniloidní (také zvaný kapsaicinový) receptor typu 1 (TRPV1, døíve oznaèovaný VR1), byl prvním identifikovaným zástupcem iontových kanálù skupiny TRP receptorù, jejichž exprese je charakteristická pro senzorické neurony (Caterina et al., 1997). V prùbìhu deseti let se postupnì ukázalo, že nocicepèní vlastnosti neuronù souvisejí s citlivostí nejen ke kapsaicinu, ale také k øadì dalších algogenních látek, které obvykle doprovázejí zánìtlivé stavy, a k pùsobení tepla, jež pøekraèuje fyziologický práh bolesti (> 43 C) 4

2 Pùvodní práce Obrázek 1: Èasová osa znázoròující hlavní objevy týkající se ankyrinového TRP receptoru a jeho úlohy v nocicepci. (Cesare a McNaughton, 1996). Na specifické podmnožinì senzorických neuronù citlivých na kapsaicin (tedy na tìch, které exprimují TRPV1) byl o šest let pozdìji molekulárnì identifikován ještì jeden významný iontový kanál z rodiny TRP kanálù: ankyrinový receptor typu 1 (TRPA1; obr. 1). Objevem tohoto receptoru byla v roce 2003 uzavøena øada celkem šesti novì molekulárnì identifikovaných TRP kanálù, jejichž vlastnosti jsou dosud intenzivnì studovány v souvislostech s mechanizmy bolesti a nocicepce: TRPV1-TRPV4, TRPM8 a TRPA1. Pro vìtšinu z tìchto receptorù byla na experimentálních zvíøecích modelech prokázána dùležitá úloha v chemické, teplotní, nebo mechanické citlivosti (viz pøehledné èlánky Boukalová a Vlachová, 2008; Sušánková a Vlachová, 2006). Ve snaze porozumìt mechanizmùm aktivace a fyziologické funkci TRP kanálù jsou vyhledávány funkèní, strukturální a evoluèní souvislosti mezi receptory rùzných TRP podskupin. Všech šest výše uvedených zástupcù TRP tøídy iontových kanálù mùže být aktivováno zmìnami okolní teploty a pro nìkteré z nich již bylo prokázáno, že skuteènì hrají fyziologickou úlohu teplotních senzorù: TRPV1, TRPV3, TRPV4 a TRPA1. Existují dùkazy o tom, že mechanizmy teplotní citlivosti se v prùbìhu evoluce obratlovcù mìnily závisle na prostøedí, a proto porovnání primární struktury homologních receptorù bylo prvním záchytným bodem pro vytvoøení hypotéz o molekulární podstatì teplotní aktivace (Latorre et al., 2007; Saito a Shingai, 2006). Experimentální úsilí strukturálnì-funkèních studií bylo zejména zamìøeno na hledání takových oblastí proteinù, jejichž zámìna nebo mutace by poškodila jen jednu z aktivaèních modalit receptoru. Vzhledem k výrazné alosterii, která je typická pro teplotnì aktivované TRP kanály, bylo však výsledkem vìtšiny genetických manipulací poškození celkové funkce receptoru, tedy všech zpùsobù aktivace: nejen teplotní, ale také chemické modality. Molekulární mechanizmy aktivace ankyrinového receptoru TRPA1 jsou detailnì studovány od roku 2003, kdy byl tento iontový kanál identifikován v nociceptivních drahách (Story et al., 2003), vyklonován však byl již o ètyøi roky døíve z lidských fibroblastù (Jaquemar et al., 1999). Cílem tohoto pøehledného èlánku je shrnout souèasné poznatky o ankyrinovém receptoru TRPA1, možné úloze v mechanizmech pùsobení kanabinoidù a nìkterých dalších aspektech aktivace, zvláštì tìch, které se uplatòují v pøenosu bolestivých podnìtù v periferním nervovém systému a na nìž je nejvíce soustøedìna pozornost v souvislosti se souèasnými smìry výzkumu zamìøeného na hledání nových pøístupù k léèbì bolestivých stavù u lidí. Molekulární struktura a topologické uspoøádání TRPA1 kanálu Molekulární struktura TRP receptorù je zpravidla tvoøena šesti transmembránovými doménami (S1-S6) a cytoplazmaticky orientovaným karboxylovým a aminovým koncem (obr. 2). Iontové kanály TRPA1 receptoru jsou vytváøeny vždy ètyømi podjednotkami, které jsou symetricky uspoøádány tak, že vždy 5. a 6. transmembránový segment receptoru s hydrofobní èástí klièky mezi nimi se podílejí na vytvoøení centrálního póru kanálu (Ramsey et al., 2006). Tato oblast iontového kanálu patøí mezi nejvíce konzervované oblasti napøíè rodinou TRP proteinù, a proto existuje øada spoleèných principù selektivity, propustnosti a blokujících úèinkù nìkterých nekompetitivních inhibitorù (rutheniové èervenì nebo lanthanidù). Souèástí vnìjší èásti póru TRPA1 kanálu je selektivní filtr, který urèuje charakter propustnosti a selektivity iontového kanálu. Iontovým kanálem TRPA1 procházejí jednomocné i dvojmocné kationty, zøejmì ale také organické kationty vìtšího prùmìru (Banke et al., 2010; Chen et al., 2009). Jakým zpùsobem urèuje proteinová struktura a topologické uspoøádání iontového kanálu jeho funkci? Zatím byla urèena krystalová struktura jen pro nìkolik cytoplazmatických úsekù TRP receptorù, navíc jen vzdálenì pøíbuzných TRPA1 kanálu. Základní pøedstavy o mechanizmech, kterými TRPA1 receptor pøevádí chemické a fyzikální podnìty na otevøení kanálu, vycházejí ze strukturnì-funkèních studií, z podobnosti membránového uspoøádání a vzdálené homologie TRP receptorù s draslíkovými kanály. Pøedpokládá se, že podobnì jako je tomu u ostatních iontových kanálù, dùležitými a specifickými funkèními strukturálními oblastmi TRPA1 receptoru jsou vazebná doména pro specifický ligand, oblast póru iontového kanálu vèetnì selektivního filtru a N- a C-koncové èásti receptoru. Hydrofilní N- a C-koncové èásti jsou u všech TRP receptorù nejménì konzervované, a proto se pøedpokládá, že obsahují funkèní domény, jež urèují specifické vlastnosti jednotlivých podtypù receptorù. TRPA1 je jediným zástupcem ankyrinového podtypu TRP kanálù u savcù (Story et al., 2003). Své oznaèení získal díky opakujícímu se sekvenènímu motivu nazývanému ankyrinová doména, který nacházíme na N-konci tohoto kanálu. Repetice 17 ankyrinových domén zabírá dominantní èást (716 aminokyselin, tj. pøibližnì 80 %) relativnì dlouhého cytoplazmatického N-konce. Ankyrinová doména je pomìrnì èastý strukturní motiv popsaný u tisícù rùzných proteinù. Obecnì se pøedpokládá, že je to místo protein-proteinové interakce, ale mùže také zprostøedkovávat vazbu s ligandy neproteinové povahy, jako je napø. vazba adenosintrifosfátu na ankyrinovou doménu TRPV1 receptoru (Gaudet, 2008). Na C-konci receptoru není zatím predikována žádná konzervovaná doména, ale vzhledem k tomu, že tato èást proteinu obsahuje znaèné množství kladnì nabitých aminokyselinových zbytkù (27 u lidského ortologu), je pravdìpodobné, že nìkteré z nich se budou podílet na modulaci receptoru prostøednictvím interakce s negativnì nabitými molekulami nebo rezidui ve svém okolí. Ze strukturálnì-funkèních studií postupnì vyplývá, že homologie, která existuje mezi nejblíže pøíbuznými TRP kanály, nemusí nutnì znamenat analogii v mechanizmech pøevodu jednotlivých aktivaèních signálù nebo v mechanizmech otevírání/zavírání (vrátkování neboli gating) iontového kanálu (Latorre, 2009). Zatímco ve vrátkování TRPV1 kanálu hrají hlavní úlohu dva hydrofobní aminokyselinové zbytky v intracelulární èásti pórové domény (Salazar et al., 2009; Susankova et al., 2007), rozhodující úlohu v procesu otevírání a zavírání póru TRPA1 iontového kanálu má zøejmì lokální flexibilita prolinového zbytku pøibližnì uprostøed 6. transmembránové domény. Šroubovice vytváøející tuto doménu je v místì výskytu prolinového zbytku zalomená (obr. 2) a právì tato vlastnost hraje zøejmì významnou úlohu v otvírání a zavírání TRPA1 kanálu (Benedikt et al., 2009). Polymodální aktivace TRPA1 Pøi studiu TRPA1 jsou intenzivnì využívány poznatky, které byly nashromáždìny o pøíbuzných TRP receptorech, a proto se mnoho informací o distribuci, struktuøe, farmakologických vlastnostech a mechanizmech aktivace tohoto receptoru podaøilo získat mnohem rychleji na základì èetných analogií. Jedním z takových charakteristických znakù, který je spoleèný mnoha TRP kanálùm, je jejich polymodalita, tedy schopnost integrovat signály rùzné povahy (chemické èi fyzikální) a rùzného pùvodu (intra- a extracelulární). TRPA1 lze aktivovat chemickými podnìty, ale také chladem, zmìnami osmotického tlaku nebo depolarizací bunìèné membrány. Heterolognì i nativnì exprimovaný TRPA1 je pøímo aktivován teplotami < 17 C, a to zpùsobem, který není závislý na extracelulární koncentraci vápenatých iontù ani na jejich intracelulárních zásobách 5

3 protony, oxid dusnatý (NO), peroxid vodíku (H 2 O 2 ) a prostaglandin (15-deoxy- 12,14 -prostaglandin J 2 ). Druhou, ménì úèinnou skupinou látek, které aktivují TRPA1, jsou látky typu alkylfenolù, kanabinoidù, icilinu, eugenolu, metysalicylátu a karvakrolu. Mechanizmus aktivace tìmito látkami dosud neznáme, nebo máme jen nepøímé dùkazy o jejich pùsobení, jako v pøípadì mnoha dalších fytochemických látek obsažených napø. ve skoøici (cinnamaldehyd), seèuánském pepøi (hydroxy-α-sanshool), tymiánu (tymol), dobromysli (karvakrol též nazývaný cymofenol), mátì (mentol), nebo v zázvoru (gingerol). Podle nìkterých strukturních motivù, kterými se nìkteré z tìchto látek vyznaèují, lze soudit, že mechanizmus aktivace TRPA1 tìmito látkami by mohl spoèívat v klasické vazbì ligand-receptor. Jinými, z klinického hlediska významnými, aktivátory TRPA1 receptoru jsou celková anestetika: látky jako napø. izofluran, desfluran èi propofol. Je známo, že tyto slouèeniny aktivují nociceptivní neurony, èímž pøispívají ke zvýšení nežádoucí bolesti spojené s aplikací anestetik (Matta et al., 2008). Vzhledem k tomu, že úlohu TRPA1 receptoru v bolesti je dnes již možné považovat za velmi pravdìpodobnou, problematika chemické aktivace TRPA1 je mimoøádnì intenzivnì studována mnoha specializovanými farmakologickými pracovišti (Baraldi et al., 2010). Obrázek 2: Topologické uspoøádání receptorové podjednotky TRPA1 kanálu. Struktura je tvoøena šesti transmembránovými segmenty, kratší hydrofobní klièkou mezi 5. a 6. transmembránovým segmentem a cytoplazmatickým aminovým a karboxylovým koncem. Dominantní èást aminového konce (N) receptoru je tvoøena opakujícím se sekvenèním motivem ankyrinových domén. N-konec obsahuje vazebnou doménu (EF-hand), která zodpovídá za modulaci TRPA1 vápenatými ionty (Doerner et al., 2007; Zurborg et al., 2007). Cysteiny interagující s cystein-reaktivními látkami typu isothiokyanát jsou vyznaèeny písmenem C. Iontové kanály TRPA1 jsou tvoøeny symetrickým uspoøádáním ètyø stejných podjednotek, pøièemž hydrofobní klièky mezi segmenty 5 a 6 se podílejí na vytvoøení centrálního póru. Propustnost kanálu pro Ca 2+ je urèena aspartátem D915 (èervený symbol). Helikální struktura 6. transmembránové domény je zalomená v místì výskytu prolinového zbytku (šipka ukazuje strukturu prolinu). Toto zalomení hraje zøejmì významnou úlohu v otvírání a zavírání TRPA1 kanálu (Benedikt et al., 2009). Úloha karboxylového konce (C-konce) v aktivaci TRPA1 je zatím zcela neprozkoumána. (Bandell et al., 2004; Karashima et al., 2009; Macpherson et al., 2006; Sawada et al., 2007; Story et al., 2003). Na základì behaviorálních studií bylo prokázáno, že myši, kterým byl vyøazen gen pro TRPA1 receptor, vykazují zmìny v reaktivitì na pùsobení bolestivého chladu (Kwan et al., 2006) a že je tedy možné TRPA1 považovat za molekulární senzor pro bolestivý chlad in vivo (Karashima et al., 2009). Chemicky lze aktivovat ankyrinový receptor širokou škálou exogenních i endogenních látek, mezi nìž patøí slouèeniny, které vyvolávají bolest, nebo látky, které se vyskytují v místech zánìtu. Pøíkladem typických exogenních aktivátorù TRPA1 receptoru jsou isothiokyanáty pálivé substance hoøèice, wasabi a køenu (Bandell et al., 2004; Jordt et al., 2004). Z hlediska specifické interakce chemických látek s TRPA1 receptorem byly doposud rozpoznány dvì hlavní skupiny chemických aktivátorù (tab. 1). První skupina látek, které jsou nejvíce úèinné, je charakterizována pøítomností elektrofilního uhlíku nebo síry, které preferenènì interagují s nukleofilními skupinami, jako jsou cysteinové nebo lyzinové zbytky proteinu receptorového komplexu. Tyto látky vytváøejí kovalentní vazby s cysteinovými zbytky na aminovém konci TRPA1 receptoru (Hinman et al., 2006; Macpherson et al., 2007), a proto je dùležité, aby byly propustné pøes plazmatickou membránu. Prostøednictvím kovalentní modifikace TRPA1 proteinu pùsobí dráždivì akrolein, látka obsažená ve výfukových plynech a døíve souèást slzných plynù (Bautista et al., 2006; Brone et al., 2008), α,β-nenasycené aldehydy v cigaretovém kouøi (Andre et al., 2008) a øada fytochemických látek, mezi nìž patøí organosulfáty obsažené napø. v èesneku (alicin), cibuli a pažitce. Kromì dráždivých exogenních látek pùsobí na TRPA1 jako agonisté také endogenní mediátory zánìtu a cystein-reaktivní látky, které vznikají vlivem oxidativního stresu (nerovnováha mezi produkcí volných kyslíkových radikálù a jejich odstraòováním antioxidanty): Aktivace TRPA 1 psychotropními látkami Nìkteré návykové psychotropní látky pùsobí na TRPA1 jako agonisté, nebo èásteèní agonisté. Mezi tyto látky patøí zejména kanabinoidy, jejichž mechanizmus pùsobení bývá tradiènì uvádìn do souvislosti s metabotropními kanabinoidními receptory, spojenými s G-proteiny (GPCR), které jsou exprimovány v rùzných tkáních nejen CNS. Existují však dùkazy, že mnoho úèinkù kanabinoidù, které mùžeme u savcù pozorovat, není zprostøedkováno metabotropními receptory. Kanabinoidy snižují pøecitlivìlost zanícené tkánì (antihyperalgezie) i u zvíøat, která byla zbavena dvou hlavních genù GPCR kanabinoidních receptorù (pøehledný èlánek viz (Akopian et al., 2009)). Výsledky nedávných studií vedly k identifikaci skupiny ionotropních kanabinoidních receptorù, z nichž prozatím všechny patøí do TRP rodiny iontových kanálù (TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPM8, TRPA1). Je zajímavé, že pøestože kanabinoidy pùsobí typicky na tyto excitaèní ionotropní receptory jako agonisté (pouze èásteèní), nevyvolávají pocit bolesti (Patwardhan et al., 2006). Místo toho navozují efektivní antihyperalgezii a antinocicepci (Hohmann a Suplita, 2006). Jinou psychoaktivní látkou, pro kterou byla prokázána schopnost aktivovat TRPA1, je rozšíøená psychotropní droga nikotin. Dráždivý úèinek, který nikotin vyvolává, je zøejmì rozhodujícím zpùsobem zprostøedkován aktivací TRPA1 (Talavera et al., 2009). Je známo, že ve vysokých koncentracích vyvolává nikotin silné pálení a ostrou bolest. Pøi odvykání kouøení pomocí náhradní terapie nikotinem se jako vedlejší úèinek objevuje lokální dráždìní, které je z kùže a sliznice pøenášeno prostøednictvím nikotinových acetylcholinových receptorù. Ty však pøi vysoké lokální koncentraci nikotinu (až 60 mm), jaká se používá pøi odvykací terapii, podléhají rychlé desenzitizaci a dùležitìjší úlohu sehrává právì aktivace TRPA1. Nedávné výsledky elektrofyziologických pokusù prokázaly, že mùže existovat bezprostøední souvislost úèinku kofeinu s pøítomností TRPA1 receptorù v inervovaných èástech jazyka a že by tento iontový kanál mohl za urèitých okolností zprostøedkovávat farmakologický úèinek kofeinu (Nagatomo a Kubo, 2008). Kofein vyvolává proudové odpovìdi bunìk, ve kterých byl exprimován myší ortolog TRPA1 receptoru, nelze je však vyvolat na buòkách transfekovaných lidským ortologem TRPA1, které jsou naopak kofeinem blokovány. Podobné mezidruhové rozdíly výraznì komplikují souèasný farmakologický výzkum, protože výsledky vìtšiny experimentù provedených na zvíøecích modelech nemohou být vhodným základem preklinických výzkumù. Modulace TRPA1 TRPA1 je neselektivním iontovým kanálem, který propouští jak monovalentní, tak divalentní kationty. Procházející vápenaté 6

4 Pùvodní práce Obrázek 3: Membránové proudy HEK293T buòky transfekované cdna lidského TRPA1 receptoru, snímané technikou patch-clamp v konfiguraci whole-cell (snímání aktivity iontových kanálù z membrány celé buòky). A: Proudová odpovìï vyvolaná aplikací allyl-izothiokyanátu (AITC; trvání aplikace znázornìno èarou nad záznamem a žlutým obdélníkem). B: TRPA1 je modulován napìtím. Proudové odpovìdi vyvolané aplikací tøí sérií napìśových pulzù (vyznaèeno nad záznamem): a) v kontrolním extracelulárním roztoku, b) v pøítomnosti saturující koncentrace AITC, c) ~20 s po odmytí AITC opìt v kontrolním extracelulárním roztoku. Membránový potenciál buòky byl mezi pulzy udržován na 70 mv. (Upraveno podle Benedikt et al., 2009). Tabulka 1: Strukturní vzorce nìkterých aktivátorù TRPA1 receptoru. Žlutì jsou vyznaèeny elektrofilní látky, které aktivují TRPA1 prostøednictvím kovalentních vazeb s cysteinovými zbytky na aminovém konci TRPA1 receptoru (Hinman et al., 2006; Macpherson et al., 2007). Pro ostatní látky dosud neexistují dùkazy o možných mechanizmech aktivace. Podle nìkterých strukturních motivù se pøedpokládá, že mechanizmus aktivace TRPA1 by mohl spoèívat v klasické vazbì tìchto látek na (zatím neznámém) hydrofobním vazebném místì receptoru. výrazná, je-li pøítomen ještì jiný aktivaèní podnìt, kdy dochází k výrazné synergii, tj. vyššímu než aditivnímu úèinku obou podnìtù. Všude, kde v periferním nervovém systému dochází k dynamickým zmìnám membránového potenciálu a kde jsou pøítomny TRPA1 kanály, mùže tak být variabilnì uplatòován jejich vliv. Ankyrinový receptor TRPA1 se vyskytuje v pøibližnì polovinì malých a støedních neuronù ganglií zadních koøenù míšních savcù, v nichž jsou typicky exprimovány strukturálnì pøíbuzné vaniloidní receptory typu 1. Zcela nedávno bylo prokázáno, že tyto dva receptory mohou dokonce funkènì interagovat a vzájemnì modulovat míru své aktivace (Staruschenko et al., 2010). Je tedy pravdìpodobné, že aktivita TRPA1 je na nociceptorech významnì modulována také prostøednictvím specifických protein-proteinových interakcí. ionty mají kromì své úlohy nosièù náboje navíc dvì speciální role: významnì aktivují kanál z intracelulární strany, zøejmì vazbou na specifickou doménu N-konce (obr. 2), a souèasnì aktivitu naopak postupnì snižují zatím neznámým mechanizmem. Vápenaté ionty jsou dùležitým faktorem urèujícím míru aktivace TRPA1, ovlivòují jeho jednotkovou vodivost a pravdìpodobnost otevøení, pøispívají k potenciaci a inaktivaci (Nagata et al., 2005; Wang et al., 2008). Modulace vápníkem se zøejmì výraznì uplatòuje v inflamaèním prostøedí, kdy napø. mediátor zánìtu bradykinin aktivuje TRPA1 nepøímo prostøednictvím bradykininového receptoru B2, který stimuluje signální dráhu fosfolipázy C. Tato aktivita vede ke zvýšení vnitrobunìèné koncentrace vápníkových iontù a pøedpokládá se, že právì vápník je bezprostøední stimul, který aktivuje TRPA1 (Bautista et al., 2006). Aktivita TRPA1 kanálu je významnì modulována membránovým potenciálem (obr. 3B). Tato vlastnost TRPA1, která je charakteristická i pro jiné iontové kanály TRP skupiny receptorù, se mùže výraznì uplatòovat ve fyziologickém kontextu, kdy aktivace receptorù je usnadnìna pøi depolarizaci jakéhokoliv pùvodu, aniž by k aktivaci došlo pøímo, tj. chemicky nebo chladem. Modulace napìtím je zvlášś Fyziologická úloha TRPA1 Do jaké míry se TRPA1 iontový kanál podílí na nocicepci a na vzniku chronické bolesti je za souèasného stavu poznání zatím jen obtížné pøedvídat. Nepochybnì však lze øíci, že TRPA1 receptory, které jsou souèástí plazmatických membrán primárních polymodálních nociceptorù, jsou aktivovány podnìty, které vyvolávají u lidí bolest. Vyøazení funkèního genu pro TRPA1 receptor u experimentálních zvíøat vede ke sníženému vnímání tepelných, mechanických a chemických podnìtù (Bautista et al., 2006; Kwan et al., 2006). Je tedy velmi pravdìpodobné, že hlavní fyziologická úloha TRPA1 v nervovém systému spoèívá v zajištìní adekvátní odpovìdi na úèinky rùzných zánìtlivých mediátorù. Rozsáhlá distribuce TRPA1 receptorù v dýchacím systému a zjištìní, že inhalace rùzných aktivátorù TRPA1 má silnì dráždivé úèinky, orientuje souèasný výzkum na vyhledávání látek s možnými analgetickými a antitusivními úèinky. Ve fázi preklinického výzkumu se nalézá již první látka, antagonista TRPA1 receptoru, který na zvíøecím modelu prokázal vysokou úèinnost proti mechanické pøecitlivìlosti u experimentálnì vyvolané diabetické neuropatie (Wei et al., 2009). Skuteènost, že TRPA1 je aktivován 7

5 velmi rùznorodými látkami s mnoha dalšími úèinky nesouvisejícími s aktivací tohoto receptoru, však svìdèí o tom, že výzkum v oblasti mechanizmù aktivace TRP kanálù má ještì podstatnou èást cesty pøed sebou. Práce byla podpoøena Centrem neuropsychiatrických studií (výzkumné centrum MŠMT 1M0517). Autoøi byli dále podpoøeni granty Výzkumným zámìrem MSM (V.Z.), MŠMT centrem LC554 (L.S.), GAUK (F.T.), Grantovou agenturou Èeské republiky 305/09/0081 (V.V., F.T. a L.S.) a Výzkumným projektem AV ÈR (AV0Z ). LITERATURA RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc. Fyziologický ústav AV ÈR Vídeòská Praha 4 vlachova@biomed.cas.cz Akopian AN, Ruparel NB, Jeske NA, Patwardhan A, Hargreaves KM. Role of ionotropic cannabinoid receptors in peripheral antinociception and antihyperalgesia. Trends Pharmacol Sci 2009;30: Andre E, Campi B, Materazzi S, Trevisani M, Amadesi S, Massi D, Creminon C, Vaksman N, Nassini R, Civelli M, Baraldi PG, Poole DP, Bunnett NW, Geppetti P, Patacchini R. Cigarette smoke-induced neurogenic inflammation is mediated by alpha,beta-unsaturated aldehydes and the TRPA1 receptor in rodents. J Clin Invest 2008;118: Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 2004;41: Banke TG, Chaplan SR, Wickenden AD. Dynamic changes in the TRPA1 selectivity filter lead to progressive but reversible pore dilation. Am J Physiol Cell Physiol 2010;298:C Baraldi PG, Preti D, Materazzi S, Geppetti P. Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) Channel as Emerging Target for Novel Analgesics and Anti-Inflammatory Agents. J Med Chem Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, Poblete J, Yamoah EN, Basbaum AI, Julius D. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 2006;124: Benedikt J, Samad A, Ettrich R, Teisinger J, Vlachova V. Essential role for the putative S6 inner pore region in the activation gating of the human TRPA1 channel. Biochim Biophys Acta Mol Cell Research 2009;1793: Boukalova S, Vlachova V. TRP receptory jako transdukèní molekuly nociceptivních podnìtù. Bolest 2008;4: Brone B, Peeters PJ, Marrannes R, Mercken M, Nuydens R, Meert T, Gijsen HJ. Tear gasses CN, CR, and CS are potent activators of the human TRPA1 receptor. Toxicol Appl Pharmacol 2008;231: Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997;389: Cesare P, McNaughton P. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93: Doerner JF, Gisselmann G, Hatt H, Wetzel CH. Transient receptor potential channel A1 is directly gated by calcium ions. J Biol Chem 2007;282: Gaudet R. A primer on ankyrin repeat function in TRP channels and beyond. Mol Biosyst 2008;4: Hinman A, Chuang HH, Bautista DM, Julius D. TRP channel activation by reversible covalent modification. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103: Hohmann AG, Suplita RL, 2nd. Endocannabinoid mechanisms of pain modulation. Aaps J 2006;8:E Chen J, Kim D, Bianchi BR, Cavanaugh EJ, Faltynek CR, Kym PR, Reilly RM. Pore dilation occurs in TRPA1 but not in TRPM8 channels. Mol Pain 2009;5:3. Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. An ankyrin-like protein with transmembrane domains is specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem 1999;274: Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Hogestatt ED, Meng ID, Julius D. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 2004;427: Karashima Y, Talavera K, Everaerts W, Janssens A, Kwan KY, Vennekens R, Nilius B, Voets T. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106: Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf CJ, Corey DP. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron 2006;50: Latorre R. Perspectives on TRP channel structure and the TRPA1 puzzle. J Gen Physiol 2009;133: Latorre R, Brauchi S, Orta G, Zaelzer C, Vargas G. ThermoTRP channels as modular proteins with allosteric gating. Cell Calcium 2007;4-5: Macpherson LJ, Dubin AE, Evans MJ, Marr F, Schultz PG, Cravatt BF, Patapoutian A. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature 2007;445: Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. More than cool: promiscuous relationships of menthol and other sensory compounds. Mol Cell Neurosci 2006;32: Matta JA, Cornett PM, Miyares RL, Abe K, Sahibzada N, Ahern GP. General anesthetics activate a nociceptive ion channel to enhance pain and inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105: Montell C. The TRP superfamily of cation channels. Sci STKE 2005;2005:re3. Nagata K, Duggan A, Kumar G, Garcia-Anoveros J. Nociceptor and hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J Neurosci 2005;25: Nagatomo K, Kubo Y. Caffeine activates mouse TRPA1 channels but suppresses human TRPA1 channels. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105: Nilius B, Owsianik G, Voets T, Peters JA. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev 2007;87: Patwardhan AM, Jeske NA, Price TJ, Gamper N, Akopian AN, Hargreaves KM. The cannabinoid WIN 55,212-2 inhibits transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) and evokes peripheral antihyperalgesia via calcineurin. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103: Ramsey IS, Delling M, Clapham DE. An introduction to TRP channels. Annu Rev Physiol 2006;68: Saito S, Shingai R. Evolution of thermotrp ion channel homologs in vertebrates. Physiol Genomics 2006;27: Salazar H, Jara-Oseguera A, Hernandez-Garcia E, Llorente I, Arias O, II, Soriano- Garcia M, Islas LD, Rosenbaum T. Structural determinants of gating in the TRPV1 channel. Nat Struct Mol Biol 2009;16: Sawada Y, Hosokawa H, Hori A, Matsumura K, Kobayashi S. Cold sensitivity of recombinant TRPA1 channels. Brain Res 2007;1160: Staruschenko A, Jeske NA, Akopian AN. Contribution of TRPV1-TRPA1 interaction to the single channel properties of the TRPA1 channel. J Biol Chem 2010;285: Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 2003;112: Susankova K, Ettrich R, Vyklicky L, Teisinger J, Vlachova V. Contribution of the putative inner-pore region to the gating of the transient receptor potential vanilloid subtype 1 channel (TRPV1). J Neurosci 2007;27: Sušánková K, Vlachová V. Molekulární mechanizmy modulace vaniloidního receptoru TRPV1. Bolest 2006;9: Talavera K, Gees M, Karashima Y, Meseguer VM, Vanoirbeek JA, Damann N, Everaerts W, Benoit M, Janssens A, Vennekens R, Viana F, Nemery B, Nilius B, Voets T. Nicotine activates the chemosensory cation channel TRPA1. Nat Neurosci 2009;12: Wang H, Woolf CJ. Pain TRPs. Neuron 2005;46:9-12. Wang YY, Chang RB, Waters HN, McKemy DD, Liman ER. The Nociceptor Ion Channel TRPA1 Is Potentiated and Inactivated by Permeating Calcium Ions. J Biol Chem 2008;283: Wei H, Hamalainen MM, Saarnilehto M, Koivisto A, Pertovaara A. Attenuation of mechanical hypersensitivity by an antagonist of the TRPA1 ion channel in diabetic animals. Anesthesiology 2009;111: Wong GY, Gavva NR. Therapeutic potential of vanilloid receptor TRPV1 agonists and antagonists as analgesics: Recent advances and setbacks. Brain Res Rev 2009;60: Zurborg S, Yurgionas B, Jira JA, Caspani O, Heppenstall PA. Direct activation of the ion channel TRPA1 by Ca2+. Nat Neurosci 2007;10: