COOPERATION OF PLANTS AND BACTERIA ON REMOVAL OF CHLOROBENZOIC ACIDS FROM CONTAMINATED SOIL SPOLUPRÁCE ROSTLIN A MIKROORGANISMŮ NA ODSTRANĚNÍ CHLORBENZOOVÝCH KYSELIN Z KONTAMINOVANÉ ZEMINY Blanka Vrchotová 1,2,3), Milena Dražková 1), Martina Macková 1,2), Tomáš Macek 1,2) 1) Institute of Chemical Technology Prague, Department og biochemistry and microbiology, Technická 3, 166 28 Prague 6, Czech Republic, e-mail: vrchotob@vscht.cz 2) Joint Laboratory of IOCB and ICT Prague, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic 3) ENVISAN-GEM, a.s., Dolní 2, 370 04 České Budějovice, Czech Republic Abstract: Chlorobenzoic acids are products of upper microbial polychlorinated biphenyls degradation pathway. Rare occurrence of microorganisms with upper PCB degradation pathway together with degradation pathways for chlorobenzoic acids can lead to accumulation of isomeric mixture of chlorobenzoic acids on contaminated area. Consequence of this can be interruption or slow down of microbial degradation. Soil was contaminated by mixture of eleven chlorobenzoic acids to concentration 5 mg/kg from each chlorobenzoic acid. In to this soil one month old plants of black nightshade (Solanum nigrum) were planted. Bacterial strains A18 (Pseudomonas sp.) and UH82 (Arthrobacter sp.), earlier isolated from PCB contaminated soil, were added. After 180 days of cultivation experiment was terminated and amount of microorganisms, concentration of chlorobenzoic acids in soil and plant biomass were determined. The results do not prove positive impact of plants on survival of microorganisms. In soil 7 from 11 added chlorobenzoic acids were removed under detection limit. In plant biomass just traces of chlorobenzoic acids were detected. Keywords: Chlorobenzoic acid, black nightshade, microbial degradation, soil Abstrakt: Chlorbenzoové kyseliny jsou koncovým produktem horní mikrobiální degradační dráhy polychlorovaných bifenylů. Vzhledem k velmi vzácnému výskytu mikroorganismů obsahujících horní PCB degradační dráhu a zároveň i dráhy pro degradaci vznikajících chlorbenzoových kyselin může docházet k hromadění izomerní směsi chlorbenzoových kyselin na kontaminovém území. Důsledkem tohoto jevu může být zpomalení nebo úplné zastavení mikrobiální degradace. Zemina byla kontaminována směsí 11 chlorbenzoových kyselin do koncentrace 5 mg/kg každé chlorbenzoové kyseliny. Do takto připravené zeminy byly nasazeny měsíc staré rostliny lilku černého (Solanum nigrum) a přidány mikrobiální kmeny A18 (Pseudomonas sp.) a UH82 (Arthrobacter sp.) již dříve vyizolované ze zeminy kontaminované PCB. Po 180 dnech byl pokus ukončen a stanoveny celkové počty mikroorganismů, koncentrace chlorbenzoových kyselin v zemině a v rostlinné biomase lilku černého. Z výsledků není jednoznačně patrné, že rostliny napomáhají přežití mikroorganismů. V zemině došlo k úbytku 7 z 11 přidaných chlorbenzoových kyselin pod mez detekce. V rostlinné biomase byly zaznamenány stopy stejných chlorbenzoových kyselin, které byly detekovány v zemině na konci pokusu.
Klíčová slova: Chlorbenzoová kyselina, lilek černý, mikrobiální degradace, půda Úvod Chlorbenzoové kyseliny jsou koncovým produktem horní mikrobiální degradační dráhy polychlorovaných bifenylů. Vzhledem k velmi vzácnému výskytu mikroorganismů obsahujících horní PCB degradační dráhu a zároveň i dráhy pro degradaci vznikajících chlorbenzoových kyselin může docházet k hromadění izomerní směsi chlorbenzoových kyselin na kontaminovém území (Adebusoye et al., 2008). Důsledkem tohoto jevu může být zpomalení nebo úplné zastavení mikrobiální degradace výchozí látky. Proto je nutné hlouběji prozkoumat možnosti degradace chlorbenzoových kyselin. Je známo několik mikrobiálních degradačních drah chlorbenzoových kyselin. V základu se dělí na ortho-, meta- a para- degradační dráhu podle pozice chloru v molekule chlorbenzoové kyseliny. Během degradace dochází buď nejdříve k dehalogenaci a poté k degradaci benzenového jádra (u para- degradační dráhy) (Scholten et al., 1991), nebo je nejdříve rozrušena struktura benzenového kruhu a teprve potom dochází k dehalogenačnímu kroku (ortho- a meta- degradační dráha) (Hickey et al., 1990). Tyto dráhy jsou ovlivněny ať již pozitivně či negativně přítomností dalších chlorbenzoových kyselin (Hernandez et al., 1991). Proto je užitečné zkoumat degradační potenciál se směsí chlorbenzoových kyselin, a ne jen s jednotlivými chlorbenzoovými kyselinami. Rostlinný metabolismus chlorbenzoových kyselin ještě není znám přesto, že existuje mnoho publikací potvrzujících schopnost rostlin metabolisovat chlorbenzoové kyseliny (Deavers et al., 2010; Mackova et al., 2007). Ve většině těchto publikací se jedná o sledování metabolismu jedné chlorbenzoové kyseliny u rostlin pěstovaných hydroponicky, či o jinak zjednodušený systém zkoumání rostlinného metabolismu. Spolupráce rostlin a mikroorganismů může být prospěšná pro oba organismy. Rostliny mají schopnost napomáhat přežívání mikroorganismů ve své rhizosféře tím, že zvyšují vlhkost půdy a její aeraci, v neposlední řadě také obohacují půdu o látky, které mohou sloužit jako živiny. Naopak mikroorganismy mohou díky svému širokému enzymatickému aparátu a rychlejšímu přizpůsobení měnícím se podmínkám napomáhat rostlině v přežití na kontaminovaném území. Metodika Půda byla kontaminována směsí 11 chlorbenzoových kyselin (2-, 3-, 4-, 2,3-di, 2,4-di, 2,5-di, 2,6-di, 3,4- di, 3,5-di, 2,3,5-tri a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina) do koncentrace 5 mg na kg půdy od každé chlorbenzoové kyseliny. Do 450 g takto připravené půdy byly nasazeny měsíc a půl staré rostliny lilku černého (Solanum nigrum), které byly buď pěstovány samotné, nebo byl do půdy přidán bakteriální kmen A18 (Pseudomonas sp.) (Pavlů et al., 1999) či UH82 (Arthrobacter sp.) (Demnerová et al., 2003). Oba přidané kmeny dříve prokázaly schopnost degradovat chlorbenzoové kyseliny. Jako kontrola růstu rostlin sloužily rostliny lilku černého nasazené do půdy bez kontaminace chlorbenzoových kyselin. Všechny možnosti byly nasazeny ve třech paralelách. Takto připravené květináče byly pěstovány při 24 C a 16hodinové fotoperiodě po dobu 180 dní se zálivkou 150 ml týdně tak, aby nedošlo k vymývání chlorbenzoových kyselin z půdy (protečení květináče). Na konci pokusu byly stanoveny celkové počty mikroorganismů v půdě, koncentrace chlorbenzoových kyselin v půdě a v rostlinné biomase lilku černého. Půda z květináčů s rostlinou byla rozdělena na vrchní V (do hloubky 5 cm), na půdu z oblasti kořenů rostliny - K a na spodní půdu - S. Půda v květináčích bez rostlin byla rozdělena na vrchní a spodní. Před stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v půdě byla půda vysušena při laboratorní teplotě, zhomogenizována a přesáta přes síto s průměrem ok 0,1 mm. Takto připravená půda byla analyticky
CFU * 10 7 v 1 g půdy navážena (4 g) a extrahována redestilovanou vodou upravenou na ph 2 přídavkem kyseliny sírové (3 ml extrakční roztok). Extrakce probíhala 24 hodin při teplotě 28 C a 130 RPM. Po extrakci byly vzorky odstředěny (6 minut 10 000 x g). Před stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v supernatantu na HPLC byly vzorky uchovávány při -18 C. Každé stanovení bylo provedeno v 6 nezávislých měřeních od každé ze tří paralel. Rostlinná biomasa byla před extrakcí rozdělena na květy, plody, listy, stonky a kořeny, vysušena při laboratorní teplotě, analyticky navážena a extrahována methanolem o HPLC čistotě. Extrakce probíhala 24 hodin při teplotě 28 C a 130 RPM. Po extrakci byly vzorky odstředěny (6 minut 10 000 x g). Před stanovením koncentrace chlorbenzoových kyselin v supernatantu na HPLC byly vzorky uchovávány při - 18 C. Stanovení chlorbenzoových kyselin na HPLC (HP 1100) bylo prováděno izokraticky na koloně Kinetex C18 100A (150 mm x 2,1 mm x 2,6 μm) od firmy Phenomenex. Pro měření byl použit průtok mobilní fáze 0,115 ml/min o složení methanol: pufr (H 3 BO 3 3,45 g/l; H 3 PO 4 2,85 ml/l; CH 3 COOH 3,15 ml/l a NaOH 2 g/l) o ph 3,15 v objemovém poměru 45:55. Chlorbenzoové kyseliny byly detekovány při λ = 205 nm. Výsledky Dle výsledků celkových počtů mikroorganismů (graf 1) nelze usuzovat na pozitivní vliv rostlin na přežívání mikroorganismů, ať už potencionálně degradujících chlorbenzoové kyseliny, či ne. Je patrné jen, že v oblasti kořenů je množství mikroorganismů mírně zvýšené. 100 90 80 PCA PCA OD MM MM OD 70 60 50 40 30 20 10 0 V S K V S K V S V S K V S V S K V S SNC SNC MIX MIX SNC A18 MIX A18 SNC UH82 MIX UH82 Graf 1.: Celkové počty mikroorganismů v půdě po 180 dnech kultivace. PCA-plate count agar, MM minimální médium s benzoovou kyselinou (200 mg/l), SNC lilek černý (Solanum nigrum), MIX půda kontaminována směsí chlorbenzoových kyselin, A18 - Pseudomonas sp., UH82 - Arthrobacter sp., V vrchní půda (do hloubky 5 cm), K půda z oblasti kořenů rostliny a S spodní půda. Rostliny měly pozitivní vliv na úbytek chlorbenzoových kyselin v půdě (graf 2). Dle výsledků došlo ve všech měřených možnostech k poklesu 7 z 11 chlorbenzoových kyselin pod mez detekce. V půdě byly detekovány jen 2,3-di, 2,6-di, 2,3,5-tri a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina. Obecně se dá říci, že v květináčích nevegetovaných lilkem černým, je koncentrace těchto 4 chlorbenzoových kyselin vyšší než ve vegetovaných. Nejvyšší zbytkové koncentrace byly stanoveny v případě 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny, po ní následovala 2,6-dichlorbenzoová kyselina, po ní 2,3-dichlorbenzoová kyselina a nejméně bylo 2,3,5-trichlorbenzoové kyseliny.
MIX SNC V MIX SNC S MIX SNC K MIX V MIX S A18 SNC V A18 SNC S A18 SNC K A18 V A18 S UH82 SNC V UH82 SNC S UH82 SNC K UH82 V UH82 S Zůstatek chlorbenzoových kyselin v půdě [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2-CBA 3-CBA 4-CBA 23-CBA 24-CBA 25-CBA 26-CBA 34-CBA 246-CBA 235-CBA 35-CBA 34-CBA 26-CBA 25-CBA 24-CBA 23-CBA 4-CBA 3-CBA 2-CBA 35-CBA 235-CBA 246-CBA Graf 2.: Procenta zůstatku chlorbenzoových kyselin v půdě po 180 dnech. CBA - chlorbenzoová kyselina, SNC lilek černý (Solanum nigrum), MIX půda kontaminovaná směsí chlorbenzoových kyselin, A18 - Pseudomonas sp., UH82 - Arthrobacter sp., V vrchní půda (do hloubky 5 cm), K půda z oblasti kořenů rostliny a S spodní půda. Stanovení chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase (graf 3) je jen orientační vzhledem k vysokému pozadí způsobenému velkou koncentrací látek absorbujících při 205 nm v extraktech z rostlinné biomasy a koncentracemi chlorbenzoových kyselin v okolí meze detekce. Z tohoto důvodu byly jednotlivé chlorbenzoové kyseliny stanoveny pouze na základě retenčního času, bez možnosti ověření pomocí knihovny spekter. Lze říci, že tímto způsobem byly v rostlinné biomase identifikovány všechny přidané chlorbenzoové kyseliny, až na 2,6-dichlorbenzoovou kyselinu. Nejvyšší koncentrace byly naměřeny u 2- a 2,4,6-trichlorbenzoové kyseliny. Obr. 1.: Ovlivnění vzhledu rostliny lilku černého (Solanum nigrum) růstem v půdě s přídavkem směsi chlorbenzoových kyselin. Vlevo rostlina v nekontaminované půdě, vpravo rostlina v půdě s přídavkem chlorbenzoových kyselin.
SNC Kořen SNC Stonek SNC List SNCPlod SNC Květ SNC A18 Plod SNC A18 Květ SNC MIX Kořen SNC MIX Stonek SNC MIX List SNC MIX Plod SNC MIX Květ SNC UH82 Stonek SNC UH82 List SNC UH82 Květ SNC A18 Kořen SNC A18 Stonek SNC A18 List SNC UH82 Kořen 140 120 100 Koncentrace [ug/gbiomasy] 80 60 40 20 0 246-CBA 235-CBA 35-CBA 34-CBA 26-CBA 25-CBA 24-CBA 23-CBA 4-CBA 3-CBA 2-CBA 2-CBA 3-CBA 4-CBA 23-CBA 24-CBA 25-CBA 26-CBA 34-CBA 35-CBA 235-CBA 246-CBA Graf 3.: Koncentrace chlorbenzoových kyselin v biomase lilku černého po 180 dnech. CBA - chlorbenzoová kyselina, SNC lilek černý (Solanum nigrum) pěstovaný v půdě bez kontaminace chlorbenzoovými kyselinami, SNC MIX lilek černý pěstovaný v půdě kontaminované směsí chlorbenzoových kyselin, SNC A18 lilek černý pěstovaný v půdě kontaminované směsí chlorbenzoových kyselin s přídavkem kmene A18 (Pseudomonas sp.), SNC UH82 - lilek černý pěstovaný v půdě kontaminované směsí chlorbenzoových kyselin s přídavkem kmene UH82 (Arthrobacter sp.). Přítomnost chlorbenzoových kyselin se projevila i na vzhledu rostlin (obr. 1). Rostliny v kontaminované půdě špatně tvořily nové listy, u stávajících listů došlo k zvětšení jejich povrchu oproti kontrole a měly výrazně tmavší barvu. Kontaminace chlorbenzoových kyselin měla vliv i na schopnost rostlin kvést. Do pokusu byly použity rostliny před začátkem kvetení. Rostliny v kontaminované půdě začaly kvést později a nebyly schopné tvořit plně vyvinuté květy. Zároveň s tím tyto nedokonalé květy po odkvětu opadávaly bez vzniku plodů. Plody byly rostliny schopné tvořit až v posledním měsíci pokusu, a to tvarově jiné než rostliny rostoucí v nekontaminované půdě. To je také důvod, proč u stanovení koncentrací chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase chybí stanovení v plodech lilku pěstovaného s přídavkem kmene UH82. Diskuse Pokus prokázal, že v půdě dochází k poměrně účinné degradaci chlorbenzoových kyselin. Během 180 dní došlo k odstranění 7 z 11 přidaných chlorbenzoových kyselin a u zbylých 4 došlo ve většině případů k jejich výraznému úbytku. Také dle výsledků v půdě vegetované rostlinami byl úbytek těchto 4 chlorbenzoových kyselin větší než v půdě bez přítomnosti rostlin. Vliv přídavku mikroorganismů se na výsledcích projevil velmi málo a jednoznačně pozitivní vliv se nepodařilo prokázat. Spíše se dá
předpokládat, že za úbytek jsou zodpovědné mikroorganismy v půdě přítomné ještě před její kontaminací směsí chlorbenzoových kyselin. Na základě výsledků získaných měřením koncentrací chlorbenzoových kyselin v rostlinné biomase je zřejmé, že nedochází k výraznému hromadění žádné z testovaných chlorbenzoových kyselin. Nejvyšší koncentrace byly zjištěny v květech (2- a 2,4,6-trichlorbenzoová kyselina) a ve stoncích (2-chlorbenzoová kyselina), u ostatních částí rostlin byla zjištěna jen stopová množství chlorbenzoových kyselin. Je možné, že zvýšená koncentrace chlorbenzoových kyselin v květech by mohla být příčinou pozdějšího kvetení rostlin pěstovaných v půdě s přídavkem chlorbenzoových kyselin a také špatného vývoje květů u těchto rostlin. Závěr Po půl roce došlo v půdě k úbytku všech testovaných chlorbenzoových kyselin z toho u 7 pod mez detekce. Rostliny lilku černého měly pozitivný vliv na velikost úbytku. Pozitivní vliv přidaných mikroorganismů se nepodařilo jednoznačně prokázat. Poděkování Tato práce vznikla za podpory grantů Centrum 1M06011, Z 40550506, MSM 6046137305 a ME 09024. Literatura: Adebusoye S. A., Picardal F. W., Ilori M. O., Amud O. O. 2008. Influence of chlorobenzoic acids on the growth and degradation potentials of PCB-degrading microorganisms. World J. Microbiol. Biotechnol 24, pp.1203-1208. Daevers K., Macek T., Karlson U. G., Trapp S. 2010. Removal of 4-chlorobenzoic acid from spiked hydroponic solution by willow trees (Salix viminalis). Environ Sci Pollut Res 17 pp. 1355-1361. Demnerová K., Stiborová H., Leigh M. B., Pieper D., Pazlarová J., Brenner V., Macek T., Macková M. 2003. Bacteria degrading PCBs and CBs isolated from long-term PCB contaminated soil. Water, Air, and Soil Pollut: Focus 3, pp. 47-55. Hernandez B. S., Higson F. K., Kondrat R., Focht D. D. 1991. Metabolism of and inhibition by chlorobenzoates in Pseudomonas putida P111. Appl Environ Microbiol 57/11, pp. 3361-3366. Hickey W. J., Focht D. D. 1990. Degradation of mono-, di- and trihalogenated benzoic acids by Pseudomonas aeruginosa JB2. Appl Environ Microbiol 56/12, pp. 3842-3850. Macková M., Vrchotová B., Frančová K., Sylvestre M., Tomaniová M., Lovecká P., Demnerová K., Macek T. 2007. Biotransformation of PCBs by plants and bacteria - consequences of plant-microbe interactions. Europ J Soil Biol 43, pp. 233-241. Pavlů L., Vosáhlová J., Klierová H., Prouza M., Demnerová K., Brenner V. 1999. Characterization of chlorobenzoate degraders isolated from polychlorinated biphenyl-contaminated soil and sediment in the Czech Republic. J Appl Microbiol 87, pp. 381-386. Scholten J. D., Chang K., Babbitt P.C.,Charest H., Sylvestre M., Donaway-Mariano D. 1991. Novel enzymatic hydrolytic dehalogenation of chlorinated aromatic. Science 253/12, pp. 182-185.