REPLIKACE A REPARACE DNA

REPLIKACE A REPARACE DNA 1

VÝZNAM REPARACE DNA V MEDICÍNĚ Příklad: Reparace DNA: enzymy reparace nukleotidovou excizí Onemocnění: xeroderma pigmentosum 2

REPLIKACE A REPARACE DNA: Replikace DNA: 1. Podstata replikace DNA 2. Replikon a replikační vidlice 3. DNA polymeráza 4. Další proteiny replikační mašinérie 5. Mechanismus replikace DNA 6. Replikace konců eukaryontních chromozómů 7. Proofreading Reparace DNA: 8. Mismatch repair 9. Mechanismy náhodného poškození DNA 10. Mechanismy reparace náhodně poškozené DNA 4

1. PODSTATA REPLIKACE DNA: Replikace DNA: zdvojení DNA. Z jedné dvoušroubovice DNA vzniknou dvě identické dvoušroubovice DNA (veškerá genetická informace je zachovaná). Semikonzervativní charakter replikace DNA: ke každému z obou původních vláken se dosyntetizuje nové vlákno na principu komplementárního párování (komplementární vlákno). Původní vlákna fungují jako předloha (templát). [FIG.] [FIG.] [FIG.] 5

2. REPLIKON A REPLIKAČNÍ VIDLICE: Replikon (úsek DNA): replikační jednotka s vlastním replikačním počátkem. Prokaryontní chromozóm: jeden replikon Eukaryontní chromozóm: mnoho (stovky až tisíce) replikonů Replikační počátek: specifická sekvence DNA (bohatá na A-T páry), kde začíná replikace. [FIG.] Replikační vidlice: replikace postupuje z replikačního počátku v obou opačných směrech dvě rozestupující se replikační vidlice (tvar písmene Y). [FIG.] Prokaryontní chromozóm: replikační vidlice se pohybuje rychlostí 1000bp/s. Eukaryontní chromozóm: replikační vidlice se pohybuje rychlostí 100bp/s. 9

3. DNA POLYMERÁZA: DNA polymeráza: katalyzuje vznik fosfodiesterové vazby mezi dvěma nukleotidy (3 konec a 5 konec deoxyribóz) prostřednictvím příslušného fosfátu. Nově připojovaný nukleotid rostoucího vlákna DNA: napřed komplementární párování s bází příslušného nukleotidu templátu potom vznik fosfodiesterové vazby s předchozím nukleotidem rostoucího vlákna Nukleotid vstupuje do reakce jako nukleosidtrifosfát. Energie uvolněná odštěpením pyrofosfátu (PP i ) je použitá pro polymerizační reakci. [FIG.] 14

Dvě důležité limitující vlastnosti DNA polymerázy: Umí syntetizovat ve směru 5 3 (podle templátu ve směru 3 5 )! [FIG.] Neumí zahájit syntézu nového vlákna DNA, umí pouze prodlužovat existující vlákno nukleové kyseliny. DNA polymerázy eukaryontní buňky: DNA polymeráza α DNA polymeráza δ a další typy (DNA polymeráza β) 16

Dvě důležité limitující vlastnosti DNA polymerázy: Umí syntetizovat ve směru 5 3 (podle templátu ve směru 3 5 )! [FIG.] Neumí zahájit syntézu nového vlákna DNA, umí pouze prodlužovat existující vlákno nukleové kyseliny. DNA polymerázy eukaryontní buňky: DNA polymeráza α DNA polymeráza δ a další typy (DNA polymeráza β) 18

4. DALŠÍ PROTEINY REPLIKAČNÍ MAŠINÉRIE: Helikáza: po navázání v replikačním počátku rozvine dvoušroubovici DNA (využívá energii z ATP). Single-strand binding protein : molekuly proteinu navázáním stabilizují jednovláknovou DNA. Primáza: zahajuje replikaci vytvořením krátkého vlákna RNA (primer). Primer poslytuje 3 konec pro DNA polymerázu, která pokračuje syntézou nového vlákna DNA podle templátu. primer prokaryontní buňky: 5 bp primer eukaryontní buňky: 10 bp Protein sliding clamp : udržuje DNA polymerázu napojenou na vlákno templátu a umožňuje DNA polymeráze po něm klouzat. 19

5. MECHANISMUS REPLIKACE DNA: Syntéza nového vlákna 5 3 na templátu 3 5 : vedoucí vlákno ( leading strand ) syntéza zde probíhá kontinuálně (DNA polymeráza δ) Syntéza nového vlákna 3 5 na templátu 5 3 : zpožďující se vlákno ( lagging strand ) syntéza zde probíhá diskontinuálně (DNA polymeráza α) 20

Lagging strand : DNA polymeráza zde přeskočí dopředu po templátu a syntetizuje potom nazpátek ve správném směru 5 3. Syntéza nového vlákna probíhá po částech označovaných jako Okazakiho fragmenty (každý začíná vlastním primerem). [FIG.] RNA primery jsou potom odstraněny, chybějící DNA je dosyntetizována příslušnou DNA polymerázou a nakonec jsou jednotlivé fragmenty pospojovány DNA ligázou. Okazakiho fragmenty prokaryontní buňky: asi 1000 nukleotidů Okazakiho fragmenty eukaryontní buňky: asi 200 nukleotidů [FIG.] [FIG.] 21

Lagging strand : DNA polymeráza zde přeskočí dopředu po templátu a syntetizuje potom nazpátek ve správném směru 5 3. Syntéza nového vlákna probíhá po částech označovaných jako Okazakiho fragmenty (každý začíná vlastním primerem). [FIG.] RNA primery jsou potom odstraněny, chybějící DNA je dosyntetizována příslušnou DNA polymerázou a nakonec jsou jednotlivé fragmenty pospojovány DNA ligázou. Okazakiho fragmenty prokaryontní buňky: asi 1000 nukleotidů Okazakiho fragmenty eukaryontní buňky: asi 200 nukleotidů [FIG.] [FIG.] 23

6. REPLIKACE KONCŮ EUKARYONTNÍCH CHROMOZÓMŮ: Problém dosyntetizování lagging strandu na konci chromozómu (telomera): řeší telomeráza Telomeráza: přidává opakovaně krátké sekvence DNA k 3 konci používá RNA templát, který je součástí enzymu Repetitivní DNA sekvence potom slouží jako templát pro dokončení replikace konce lagging strandu. [FIG.] 26

7. PROOFREADING : Proofreading : korigující aktivita DNA polymerázy na novém vláknu DNA ve směru 3 5, přičemž syntetizuje nové vlákno ve směru 5 3. Postup DNA polymerázy před připojením nového nukleotidu: zkontroluje, jestli předchozí připojený nukleotid nese bázi komplementární k templátu pokud ano, pokračuje v připojení nového nukleotidu pokud ne, odstraní zpětně chybný nukleotid a připojí místo něj odpovídající nukleotid [FIG.] Proofreading aktivita DNA polymerázy vysvětluje, proč má pouze 5 3 polymerázovou aktivitu a proofreading ve směru 3 5. Proofreading ve směru 5 3 (hypotetická polymerace ve směru 3 5 ) není z chemického hlediska možný. [FIG.] 28

7. PROOFREADING : Proofreading : korigující aktivita DNA polymerázy na novém vláknu DNA ve směru 3 5, přičemž syntetizuje nové vlákno ve směru 5 3. Postup DNA polymerázy před připojením nového nukleotidu: zkontroluje, jestli předchozí připojený nukleotid nese bázi komplementární k templátu pokud ano, pokračuje v připojení nového nukleotidu pokud ne, odstraní zpětně chybný nukleotid a připojí místo něj odpovídající nukleotid [FIG.] Proofreading aktivita DNA polymerázy vysvětluje, proč má pouze 5 3 polymerázovou aktivitu a proofreading ve směru 3 5. Proofreading ve směru 5 3 (hypotetická polymerace ve směru 3 5 ) není z chemického hlediska možný. [FIG.] 30

8. MISMATCH REPAIR : Mismatch repair : opravuje nesprávně spárované báze na nově syntetizovaném vlákně DNA (opravuje chyby replikační mašinérie). [FIG.] Proteiny mismatch repair rozeznávají nekomplementární párování ( mismatch ) v důsledku deformace dvoušroubovice DNA. Následně odstraní chybnou část vlákna DNA a dosyntetizují tuto část znovu. [FIG.] Replikační mašinérie: 1 chyba/10 7 nukleotidů Mismatch repair : oprava 99% chyb replikační mašinérie Celková přesnost replikace DNA: 1 chyba/10 9 nukleotidů 32

9. MECHANISMY NÁHODNÉHO POŠKOZENÍ DNA: Depurinace: uvolnění guaninu nebo adeninu z DNA (spontánní) Deaminace: přeměna cytosinu na uracil (spontánní) [FIG.] Formování pyrimidinových (thyminových) dimerů: způsobené UV zářením [FIG.] 37

9. MECHANISMY NÁHODNÉHO POŠKOZENÍ DNA: Depurinace: uvolnění guaninu nebo adeninu z DNA (spontánní) Deaminace: přeměna cytosinu na uracil (spontánní) [FIG.] Formování pyrimidinových (thyminových) dimerů: způsobené UV zářením [FIG.] 39

10. MECHANISMY REPARACE NÁHODNĚ POŠKOZENÉ DNA: Postup při reparaci poškozené DNA: rozeznání poškození na vlákně DNA odstranění (excize) poškozené DNA specifickými nukleázami dosyntetizování odstraněné DNA podle komplementárního vlákna pomocí opravných DNA polymeráz znovuspojení dosyntetizované části DNA s reparovaným vláknem DNA pomocí DNA ligázy (ligace) [FIG.] Stabilita DNA a tím i genetické informace závisí na mechanismech reparace DNA. 41

10. MECHANISMY REPARACE NÁHODNĚ POŠKOZENÉ DNA: Postup při reparaci poškozené DNA: rozeznání poškození na vlákně DNA odstranění (excize) poškozené DNA specifickými nukleázami dosyntetizování odstraněné DNA podle komplementárního vlákna pomocí opravných DNA polymeráz znovuspojení dosyntetizované části DNA s reparovaným vláknem DNA pomocí DNA ligázy (ligace) [FIG.] Stabilita DNA a tím i genetické informace závisí na mechanismech reparace DNA. 43

LITERATURA: Alberts B. et al.: Základy buněčné biologie. Espero Publishing. Ústí nad Labem, pp. 189-205, 1998 Alberts B. et al.: Essential Cell Biology. Garland Science. New York and London, pp. 197 217, 2010 44