Metodické doporučení SZÚ ke sjednocení metody kvantifikace fytoplanktonu v koupalištích ve volné přírodě

Metodické doporučení SZÚ ke sjednocení metody kvantifikace fytoplanktonu v koupalištích ve volné přírodě Autoři: Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc. Mgr. Petr Pumann RNDr. Petr Marvan, CSc. Spolupracovali: MUDr. František Kožíšek, CSc., RNDr. Petr Vágner Pracovní verze 21.5.2002 Prohlášení: Odkazy na konkré tní znač ky výrobků slouží pouze jako příklad a lze je v metodice nahradit jinými výrobky se stejnými č i podobnými vlastnostmi. 1

Účel doporučení: Výskyt planktonních sinic (cyanobakterií) v koupalištích ve volné přírodě je každoroč ně se opakujícím problé mem mnoha našich lokalit. Toto metodické doporuč ení by mělo usnadnit odpovědným orgánům rozhodování o dalším postupu v případě zvýšené koncentrace těchto organismů. Zvlášt ě pak: 1. rozhodnout, zda zvýšit č etnost odběru podle 84(1f) zákona 258/2000 Sb. 2. rozhodnout, zda zakázat používání vody v koupališti podle 84(g) zákona 258/2000 Sb., respektive 254/2001Sb. 3. upřesnit poznámku: v případě vodních kvě tů je koupá ní zaká zá no z přílohy 1 u ukazatele živé organismy - fytoplankton z vyhlášky MZ 464/2000 Sb. 4. upřesnit a sjednotit postup odběru vzorku 5. upřesnit metodu pro laboratorní zpracování podle Č SN 757112 Vzhledem k převládající praxi, kdy vzorek odebírají, zpracovávají a výsledky interpretují jiné týmy, je metodické doporuč ení děleno na 3 části: 1. Metodika odběru, přepravy, popřípadě konzervace vzorku 2. Metodika laboratorního zpracování 3. Vyhodnocení a interpretace analýz, formulace závěrů Použitelnost té to metodiky je pochopitelně širší. Část 2 lze použít např. pro kvantifikaci sinic ve vzorcích z vodárenských nádrží. Definice termínů : Cyanobakterie (sinice, cyanofyta, cyanoprokaryofyta, cyanoprokaryonta) jsou gramnegativní fotosyntetizující eubakterie. Obsahují chlorofyl, fykocyanin a fykoerytrin. Nemají jádro buněč né a buněč ná stěna obsahuje (jako jiné gramnegativní bakterie) lipopolysacharidy. Odlišujeme několik ekologických skupin bentické, pikoplanktonní, nanoplanktonní, epifytické, epizoické popř. endobiotické cyanobakterie a cyanobakterie vodního květu. Všechny tyto ekologické skupiny jsou schopny produkovat širokou škálu biologicky aktivních látek, jako jsou hormony, vitamíny, antibiotika, nebo toxiny. Vzhledem k nejasnosti a různorodosti pojmu vodní kvě t sinic a vegetační zákal, zavádíme definici, kterárespektuje hydrobiologicko-hygienické aspekty masové ho rozvoje cyanobakterií: Cyanobakterie vodního kvě tu jsou koloniální nebo vláknité typy, charakterizované schopností vytvář et v buň kách plynové měchýřky, které umožňují vznášení a kumulaci biomasy u hladiny. Cyanobakterie vodního květu nemusí být okem viditelné. Proto je důležité laboratorní vyšetření. Vodním kvě tem cyanobakterií rozumíme pouhým okem viditelné shluky sinic u hladiny. Protože nelze přesně popsat hranici, kdy už lze situaci nazvat vodním květem, a kdy ještě ne, doporuč ujeme v případě pochybností vždy odebrat vzorek pro kvantifikaci a rozhodnout až na základě laboratorního vyšetření. O masovém rozvoji cyanobakterií hovoříme, je-li koncentrace buněk v 1 ml vody v profilu hladina-30 cm vyšší než 100 000 buněk/ml. 2

Z hygienické ho hlediska působí významné riziko také masový rozvoj cyanobakterií, které sice mají plynové měchýřky, ale neshlukují se při hladině - sem patří typicky rody Planktothrix 1 a Limnothrix. Poslední výzkumy poukazují na schopnost pikocyanobakterií tvořit koloniím podobné shluky se schopností kumulace u hladiny (např. Synechococcaceae). Z hlediska produkce toxinů jsou srovnatelné s klasickými cyanobakteriemi vodního květu. Vysoce toxická jsou tzv. oscillatorieta = shluky bentických řas spojených vláknitými bentickými cyanobakteriemi a nadnášené produkcí kyslíku. V zahraničí jsou známy jako koláč e smrti a jsou příč inou úhynu skotu, psů a ovcí napájených vodou s bentickými sinicemi. Souč asné vědě není známo, že by masový rozvoj sladkovodních řas (ať je definovaný jako vodní květ nebo vegetač ní zákal) produkoval toxiny. Výjimkou jsou alergické reakce na masový rozvoj zelené řasy Botryococcus braunii. 1 Neplatí to však univerzálně. U nás málo rozšíř enáplanktothrix rubescens vytváří mohutné č ervené květy v chladnějších částech roku. U hojné P. agardhii byly příležitostně pozorovány příhladinové vodní květy. 3

1 Odbě r a př eprava vzorku 1.1 Odkazy Č SN ISO 5667-2 Jakost vod - Odběr vzorků Část 2: Pokyny pro konzervaci vzorků a manipulaci s nimi Č SN ISO 5667-4 Jakost vod - Odběr vzorků Část 4: Pokyny pro odběr vzorků z vodních nádrží. 1.2 Pomů cky a materiál 1.2.1 Trubkový vzorkovač Pro tyto úč ely lze doporuč it průhlednou plastovou trubici o průměru 4,5 cm a o dé lce cca 1 m, kterou lze prodlužovat novodurovými trubkami, nebo některý z komerč ně vyráběných vzorkovačů 1.2.2 Odbě rové nádoby o objemu 500 ml z PE na odběr vzorků pro kvantifikaci biomasy 2 1.2.3 Odbě rové nádoby o objemu 100 ml z tmavého skla na odběr vzorků pro konzervaci Lugolovým č inidlem 1.2.4 Odbě rové nádoby nejméně o objemu 1000 ml skleněné nebo plastové na odběr vzorků pro stanovení chlorofylu a 1.2.5 Nádoba o dostatečném objemu na smíchání dílčích vzorků 1.3 Odbě rová perioda a doba odbě ru Odběry vzorků pro hygienické hodnocení fytoplanktonu v koupalištích situovaných na nádržích se provádějí v koupací sezóně ve 14 denních intervalech. Optimální denní doba pro odběr je dopoledne, mezi 6-11 hodinou, což souvisí se schopností cyanobakterií regulovat svou pozici ve vodním sloupci. V případě dosažení limitních koncentrací je odběrováperioda urč ena výsledkem kvantifikace dle tohoto metodické ho doporuč ení (Část 3). 1.4 Volba odbě rového místa Stálé odběrové místo volíme s ohledem na maximální reprezentativnost pro sledovanou lokalitu, maximální expozici rekreantů (plavci, vodní sporty jako potápění, kanoing, windsurfing, vodní lyže apod.), dále jen rekreaci. Stabilní odběrové místo reprezentuje lokalitu, kteráje lokálně známájako místo s maximálním výskytem rekreantů), kde dochází k masové mu výskytu cyanobakterií (hráz, zátoka apod.). Vždy musí být zohledněna heterogenita populací fytoplanktonu, hydrologické poměry sledované lokality (vodní proudy) a dynamika přesunu populací vodních květů větrem. Koupací místa, kterápředstavují délku břehů delší než 1 km, nebo hydrologicky odlišné lokality (záliv, hráz, tzv. zóny nádrže), musí být vzorkovány zvlášť. Vzorky odebíráme z lodě, odběrové ho mola, nebo u břehu, kde je hloubka vody minimálně 1m. 1.5 Způ sob odbě ru vzorku Pro kvantifikaci cyanobakterií odebíráme vzorek směsný, plošně integrovaný z horizontu 0-30 cm. Postupujeme tak, že trubkový vzorkovač vnořujeme kolmo do vodního sloupce a 2 Objem pouhých 100 ml vzorku vody obsahující velké koloniální sinice nemusí být pro kvantitativní stanovení poč tu sinicových buněk dostač ující, neboť výsledek stanovení může být zatíž en velkou statistickou chybou. 4

v hloubce 3 30 cm uzavřeme jeho horní konec. Před vytažením odběrové ho zařízení nad hladinu jej uzavřeme také na dně. Na odběrové m místě odebereme dle heterogenity lokality cca 3-5 dílčích vzorků z okruhu 3-4 m, slijeme, promícháme a naplníme vzorkovnice (pro mikroskopický rozbor, chlorofyl a). Lahve plníme do 4/5 objemu. Při výskytu souvislé příhladinové husté vrstvy cyanobakterií vodního květu lze předpokládat, že koncentrace biomasy přesahuje stanovené hygienické limity. Mocnost vrstvy biomasy cyanobakterií je většinou velmi různorodá, a proto v tomto případě postupujeme tak, že tyčí nebo pádlem promícháme (zhomogenizujeme) kumulovanou biomasu (opisujeme osmič ku o průměru cca 1m a odpočítáme tři vteřiny). Poté necháme cca 10-20 sekund uklidnit hladinu a kolmo zasouváme odběrovou trubici. 1.6 Konzervace a př eprava Vzorky přepravujeme ve tmě, chlazené v chladícím boxu při teplotě 2-5 C. Vzorky zpracujeme téhož dne. Nelze-li tuto podmínku splnit, konzervujeme vzorek přímo v místě odběru Lugolovým č inidlem resp. fixač ním č inidlem dle Utermöhla (kap. 2.4.1). Vzorek po fixaci mámít slabě žluté zbarvení. 1.7 Kontrola míst s možnou kumulací biomasy Osoba odpovědnáza odběr, je-li to možné 4, projde místa, kde lze oč ekávat kumulaci biomasy fytoplanktonu. V praxi to znamenáinspekci zálivů, hráze na té straně, kam foukal/foukávítr. Do protokolu je nutno uvé st i ojedinělé výskyty vodních květů u břehů s poznámkou o rozsahu/ploše infikované hladiny, přítomnost kolonií ve vodním sloupci (předstupeň kumulace u hladiny). 1.8 Odbě rový protokol. V zájmu zásad opakovatelnosti odběru, zásad správné laboratorní praxe, kontroly a hodnocení kvality práce by měl odběrový protokol obsahovat minimálně tyto údaje: číslo vzorku/ interní označ ení, konkretizace/popis odběrové lokality, jmé no osoby odpovědné za odběr a kontakt (telefon, E-mail), den/hodina odběru, typ vody/nádrže, poč et dílčích vzorků způsob přepravy, způsob konzervace, parametry měřené na lokalitě: ph, teplota vody a vzduchu, průhlednost, kyslík (mg/l a % nasycení), vizuální pozorování lokality, jako zbarvení vody, neč istota/předměty/pěna, tvorba vodních květů na dalších místech nádrže, směr větru v době odběru (boč ní, směrem k/od místa odběru), zápach vody, 3 Odběrový horizont 0-30 cm neodporuje požadavkům vyhlášky 464/2000 Sb. neboť sinice vodního květu jsou v některých případech lehčí než voda, někdy ne. Proto se nedájednoznač ně rozhodnout, který z obou horizontů udávaných vyhláškou v 3(3) použít. Hloubka odběru není zatím mezinárodně zcela sjednocena. Například American Public Health Association (APHA/AWWA/WPCF 1992) uvádí profil 0-30 cm, zatímco WHO/UNEP (1994) popisuje původní hloubku odběru 0-25 cm, přičemž v roce 2001 zač ala a je protokolována diskuze o optimální hloubce s ohledem na kontakt plavců (především dětí) se sinicemi vodního květu. Předběž né závěry se kloní k hloubce 0-50 cm. V případě stratifikovaných nádrží a nádrží s rozvojem Planktothrix nebo Limnothrix je vhodné vzorkovat alespoň 1 v době letního maxima také vertikální profil nádrže, protože tyto cyanobakterie se č asto kumulují v hloubce 5-8 m. 4 Místo nemusí být přístupné (nebezpečí úrazu) nebo cesta na návětrnou stranu může být velmi zdlouhavá (desítky km). 5

v závěru protokolu je uveden den a hodina předání vzorku k analýze a jaký je důvod odběru/cíl analýz, jmé no a kontakt, komu byl vzorek předán. 6

2 Laboratorní zpracování vzorku 2.1 Stručný popis postupu: Po provedení vizuálního hodnocení a kvalitativní analýzy se podle přítomných sinic vybere nejvhodnější postup pro kvantifikaci buněk (případně buněč né ho objemu). Pokud je nutné vzorek koncentrovat a jsou přítomné sinice vodních květů, je nutné použít membránové filtrace 5. 2.2 Odkazy Č SN 757712 Jakost vod Biologický rozbor Stanovení biosestonu Č SN ISO 10260 Jakost vod - Měření biochemických ukazatelů - Spektrofotometrické stanovení koncentrace chlorofylu-a CHORUS I., BARTRAM J. (1999): Toxic Cyanobacteria in Water. E&FN Spon. 416 s. Návod k aparatuře na kvantitativní stanovení fytoplanktonu pomocí ultrafiltrace. LIMNI Brno 2.3 Materiál a pomů cky 2.3.1 Cyrusova komů rka (alternativně jiné počí tací komů rky) 2.3.2 Ultrafiltrační aparatura s možností zahustit 5-10 ml vzorku na přesně definovaný objem menší než 1ml (LIMNI Brno nebo ekvivalentní) + membránové filtry (póry o průměru nejvýše 1,2 µm) 2.3.3 Mikroskop umožňující práci s počítací komůrkou se zvětšením nejmé ně 400 2.3.4 Pasteurovy pipety či kapátka 2.3.5 5 ml automatická pipeta či alternativní zařízení k dezintegraci vzorku 2.4 Chemikálie 2.4.1 Lugolovo činidlo dle Utermö hla. 10 g jodidu draselné ho se rozpustí ve 20 ml vody, přidáse 5 g krystalické ho jódu a smícháse s 50 ml 10% kyseliny octové. Po promíchání se nechá1 den ustát. Skladuje se v lahvích z tmavé ho skla. 2.4.2 0,1M KOH 0,5611 g KOH rozpustíme v 100 ml destilované vody. 2.4.3 Formalín 40% 2.5 Č asový rozvrh práce Vzorky zpracováváme v den odběru. Nelze-li tuto podmínku splnit (např. kvůli velké mu jednorázové mu přísunu vzorků), snažíme se prové st téhož dne alespoň kvalitativní rozbor a smyslové hodnocení. Zbytek vzorku co nejdříve fixujeme několika kapkami Lugolova č inidla dle Utermöhla a kvantitativní stanovení provádíme později. U fixované ho vzorku však nelze využít fluorescence (kap. 2.11.1). 2.6 Pracovní postup 2.6.1 Ú daje z odbě rového protokolu Prohlé dneme údaje na odběrové m protokolu. Především jsou důležité informace o průhlednosti, barvě a výskytu vodního květu. 5 Centrifugace je pro tento úč el nepřípustnákvůli různě velkým ztrátám planktonních sinic. 7

2.6.2 Smyslové hodnocení Před započ etím mikroskopických analýz vzorek vizuálně hodnotíme. Zaměříme se na výskyt viditelných kolonií (Aphanizomenon flos-aquae, Microcystis spp.). Dále sledujeme, zda a kde se biomasa ve vzorku kumuluje (hladina, dno), barvu, zákal a pach vzorku. Vše poznamenáme do laboratorního protokolu. 2.6.3 Zahuště ní vzorku membránovou filtrací (pro filtrační aparaturu 2.3.2) Filtr před použitím namočíme. Tím se usnadní jeho umístění na ploše spodní části aparatury. Z dobře promíchané ho vzorku nasajeme do pipety potřebné množství vody. Pro běž né typy vod bez silnějšího anorganické ho zákalu býváoptimální objem 10 ml, u silněji oživených vod je vhodné už předem objem k filtraci sníž it. Z odebrané ho množství napipetujeme do dobře utěsněné ho filtrač ního nástavce asi 1 ml vzorku a nasadíme pipetu tak, aby její spodní část zasahovala pod hladinu. Poté otevřeme kohout odsávač ky. Při tomto postupu probíháfiltrace pod tlakem vodního sloupce v pipetě, a není tedy nutno v odsávač ce vyvolat podtlak. Zpomalí-li se rychlost poklesu hladiny v pipetě, můžeme filtraci urychlit tak, že vyvoláme pod filtrem slabý podtlak odsátím části vzduchu v odsávač ce a kohout uzavřeme. Dojde-li k výrazné mu zpomalení filtrace, můžeme usnadnit průchod vody přes filtr přechodným vyvoláním přetlaku v odsávač ce. Přitom se vrátí urč itý malý objem vody přes filtr zpět a uvolní vrstvič ku zachycenou na filtru. Nepomůže-li to, je nutné celou koncentraci opakovat. Probíhá-li naopak filtrace i po přefiltrování 10 ml rychle, je možno přefiltrovat i další objem vody. Po poklesu hladiny pod ústí pipety a sejmutí pipety filtraci přerušíme (vyvoláním slabé ho přetlaku v odsávač ce) hned, jak poklesla hladina vody ve filtrač ním nástavci pod horní (nebo dolní) rysku. Poté doplníme kapátkem objem filtrátu po rysku (můžeme zpravidla použít analyzovaný vzorek: změna objemu je zanedbatelně malá). Vzorek promícháme (mechanickým pohybem kapátka, ale i velmi opatrným nasáváním suspenze do kapátka a zpět) a jeho část přeneseme do počítací komůrky (kvantitativní rozbor) nebo na podložní sklo (kvalitativní rozbor). 2.6.4 Kvalitativní rozbor Pro kvalitativní (taxonomické ) hodnocení je většinou vhodné cca 10-50 koncentrovat 6. K tomu použ ijeme membránovou filtraci (kap. 2.6.3). Kvalitativní analýza (taxonomická determinace) fytoplanktonu začínápři malé m zvětšení, zapisujeme velikost kolonií, poté provedeme při zvětšení 200-250 taxonomickou determinaci. Vždy končíme při zvětšení minimálně 400 a soustředíme se na přítomnost pikocyanobakterií a pikoplanktonu (zde je vhodné použít fluorescenč ní mikroskop, viz bod 2.11.1). Není-li pikoplankton přítomen, poznamenáme i to do laboratorního protokolu. Urč ení u sinic se snažíme provádět, je-li to možné, alespoň do úrovně rodu, u ostatních organismů se můžeme spokojit s urč ením do skupin (Cryptophyta, Chlorophyta atd.), vždy je však lepší urč it přítomné organismy co nejpřesněji (především více zastoupené taxony). V případě pochybností při urč ování vždy tyto pochybnosti vyjádříme v protokolu (otazníkem, písmeny cf. mezi druhovým a rodovým jmé nem, apod.). 2.6.5 Způ sob př edúpravy pro kvantifikaci Z údajů získaných při kvalitativním rozboru, z vizuálního hodnocení a z údajů na odběrové m protokole rozhodneme o způsobu kvantifikace: 6 Je vhodné upravovat zahuštěný vzorek na známý objem, protože pokud nebudeme sinice dezintegrovat, můžeme použít tento zahuštěný vzorek i ke kvantifikaci. 8

A) Pokud ve vzorku dominují sinice, které můžeme počítat bez dezintegrace, můžeme použít zahuštěný vzorek pro kvalitativní rozbor a naplnit s ním počítací komůrku. B) Pokud jsou ve vzorku při kvalitativním hodnocení zaznamenány hojně kolonie Microcystis, Woronichinia, případně Anabaena s kroucenými vlákny, vzorek musíme dezintegrovat. Vzorek homogenizujeme standardním třepáním v ruce (dle potřeby, např. pro uvolnění sedimentů). Z homogenizované ho vzorku přelijeme nebo odebereme pipetou s otvorem alespoň 2 mm 5 ml do zkumavky. K 5 ml vzorku přidáme 0,1 až 0,2 ml (dle koncentrace biomasy) 0,1M KOH. Automatickou pipetou o objemu 5 ml 10 prudce nasajeme, vytlačíme a necháme 1-2 minuty stát při laboratorní teplotě a poté 30 prudce nasajeme a vytlačíme. Je mimořádně důležité, aby při vytlač ování vzorku byla špič ka co nejvíce přitlač ena ke dnu zkumavky. Tento postup je dostač ující pro 90% populací Microcystis v ČR. V případě, že ve vzorku zůstaly útvary větší než 50 buněk, je nutno postup opakovat s přidáním dalších 0,2 ml 0,1M KOH, popřípadě vzorek mírně zahřát. Pro precizní kvantifikaci jsou shluky buněk na závadu, protože ruší homogenní rozložení buněk v zorné m poli. Pro kolonie se silným slizem (např. na podzim) se osvědč ilo postavit zkumavku na 3-4 minuty do kádinky s horkou vodou 90 C (např. z rychlovarné konvice). Během 3-4 minut klesne teplota lázně na 60-70 C, vzorek se ohřeje na 40-50 C a kolonie jsou spolehlivě dezintegrovány mechanickým nasáváním, viz výše. Vzorek po zahřátí obsahuje buň ky poč itatelné, ale většinou mrtvé a proto zahřívání používáme jen v krajních případech. Podle potřeby (dle koncentrace buněk v dezintegrované m vzorku) vzorek zkoncentrujeme membránou filtrací (bod 2.6.3). C) Při kvalitativní analýze nebyly zjištěny žádné sinice nebo ojediněle velké kolonie Microcystis spp. nebo Aphanizomenon flos-aquae a při vizuálním hodnocení vzorku byly pozorovány velké kolonie sinic. Nelze předepsat přesný objem, který se má použít. Vhodné však je, aby bylo ve vzorku, který dezintegrujeme, alespoň 30 kolonií. Vloč ky Aphanizomenon flos-aquae se snadno rozpadají a tak stačí přidat formalín nebo Lugolovo č inidlo a vzorek protřepat. Dle koncentrace buněk v dezintegrované m vzorku můžeme (ale nemusíme) vzorek koncentrovat membránou filtrací (bod 2.6.3). 2.6.6 Plně ní komů rky Promíchaný vzorek kápneme na mříž ku komůrky a rychle přikryjeme, alternativně připevníme na suchou komůrku krycí sklíč ko a vzorek přikápneme ke straně a necháme nasát do komůrky. Pro nedezintegrované vzorky však druhý způsob nelze použít, protože větší kolonie se nenasají do komůrky. 2.6.7 Počí t á n í v komů rce Údaj pro výpoč et koncentrace planktonních organismů by měl být založen na propoč tení nejmé ně 100 jedinců (pod pojmem jedinec se zde rozumí jednotlivábuň ka, kolonie, vlákno atp. ve vzorku, který je mikroskopován; tedy např. až v dezintegrované m vzorku). Pro přesnější výsledek můžeme taxony hojně zastoupené počítat na menší ploše komůrky než taxony zastoupené méně. To je zvlášt ě důležité, když nejvíce zastoupený taxon mávýrazně menší buň ky než taxony zastoupené mé ně. Jednotlivé typy sinic počítáme následujícím způsobem: 2.6.7.1 Sinice, u nichž počítá me přímo buň ky Microcystis, Woronichinia (případně jaké koli kokální sinice zástupci pikoplanktonu): počítáme jednotlivé buň ky, případně buň ky v ne zcela dezintegrovaných koloniích. Mezivýsledkem je poč et buněk na plochu komůrky. 9

Anabaena (a další vláknité sinice, u nichž jsou dobře vidět jednotlivé buň ky): stanovujeme poč et buněk v každé m vláknu. Mezivýsledkem je poč et buněk na propočítanou plochu komůrky. Koloniální sinice, u nichž jdou dobře počítat jednotlivé buň ky: stanovujeme poč et buněk v každé kolonii. Mezivýsledek je poč et buněk na propočítanou plochu komůrky (typicky Snowella, Merismopedia ad.). 2.6.7.2 Sinice, u nichž měříme délku vlá ken (kolonií) Planktothrix (a další vláknité sinice u nichž jsou špatně vidět buněč né přepáž ky Aphanizomenon, Pseudanabaena, Limnothrix): měříme délku vláken. Mezivýsledkem je celková délka vláken na propočítanou plochu komůrky. Délku vláken měříme buď okulárovým mikrometrem nebo srovnáním s mříž kou počítací komůrky (Kapitola 2.11.3). Koloniální sinice s velmi drobnými buň kami a pravidelným tvarem kolonií (např. Aphanocapsa incerta): měříme velikost jednotlivých kolonií. Mezivýsledkem je poč et a průměrnávelikost kolonie na propočítanou plochu komůrky. I přes výše uvedený postup se může stát, že některé sinice nepůjdou objektivně spočítat (např. u velmi drobných koloniálních sinic rodů Aphanocapsa a Aphanothece). V některých případech nemusí být úspěšná ani dezintegrace kolonií Microcystis a Woronichinia. V takové m případě se buď rozhodneme poč et buněk v koloniích co nejpřesněji odhadnout (že se jednáo odhad, musí být poznamenáno ve výstupním protokolu), nebo od kvantifikace pod mikroskopem upustíme (a v rozhodovacím procesu pak použijeme pouze hodnoty chlorofylu a). Problematické je, že se sinice s aerotopy zpravidla vznášejí u krycího sklíč ka komůrky. Pokud je obraz zaostřen v rovině vznášejících se buněk, mříž ka komůrky je vidět velmi neostře. Pomoci může co největší uzavření clony na kondenzoru. Návrh pracovního protokolu pro zápis počítaných organismů je uveden v Příloze č. 1. 2.6.8 Výpočet koncentrace sinic v buňkách U taxonů, kde přímo nepočítáme buň ky, musíme mezivýsledky v dé lkách vláken a rozměrech kolonií nejprve převé st na buň ky. Buď zjistíme velikost buněk v počítané populaci nebo použijeme domluvené hodnoty (tabulka 1): Tabulka 1: Návrh standardních hodnot pro některé č astější planktonní sinice způ sob Taxon standardní hodnota 1 Aphanizomenon spp. dé lka buň ky L B 8 µm 1 Cylindrospermopsis raciborskii dé lka buň ky L B 8 µm 1 Planktothrix spp. dé lka buň ky L B 5 µm 1 Raphidiopsis mediterranea dé lka buň ky L B 8 µm 1 Pseuanabaena sp. dé lka buň ky L B 8 µm 1 Limnothrix sp. dé lka buň ky L B 11 µm 2 Aphanocapsa incerta průměr buň ky D B 1,3 µm 10

Přepoč et se děje podle vzorců v tabulce 2: Tabulka 2 způ sob měří se standardní hodnota vzorec 1 celkovádé lka vlákna L V dé lka buň ky L B n = L V / L B 2 průměr kolonie D K průměr buň ky D B n = 0,74 (D K / D B ) 3 Koncentraci buněk sinic pro jednotlivé taxony potom vypočítáme podle následujícího vzorce: Poč et buněk/ml = B * P k * V z * (V d +V KOH ) P p * V p * V k * V d B poč et napočítaných buněk P p propočítanáplocha komůrky vyjádřenáv mm 2, poč tem polí, pásů, aj. P k celkováplocha komůrky uvedenáve stejných jednotkách jako P p V d objem vzorku použitý k dezintegraci v ml V KOH objem přidané ho dezintegrač ního č inidla v ml (KOH, formalín) V p objem vzorku použité ho ke koncentraci v ml V z objem zahuštěné ho vzorku v ml V k objem komůrky v ml 7 Koncentraci všech buněk sinic ve vzorku zjistíme seč tením koncentrací všech přítomných taxonů sinic. 2.7 Objemová biomasa Použití objemové biomasy lze doporuč it zvlášt ě ve vzorcích s hojným výskytem piko- a nanoplanktonu. Zde totiž může být poč et buněk výrazně nadhodnocen. Data, kterájsme získali pro stanovení buněk, lze použít i ke stanovení objemové biomasy. Musíme však doměřit některé rozměry (tabulka 2). Díky velké variabilitě nelze použít tabulkových hodnot. Proměříme dostateč né množství organismů (pokud jsou rozměry přibližně stejné, stačí změřit požadované parametry u 10 jedinců (buněk, vláken, kolonií), u populací s většími rozdíly je lepší proměřit 20 jedinců. K měření je nutné mít proměřený mikroskop (viz bod. 2.11.3) a použít největší možné zvětšení. Organismy můžeme proměřit již při kvalitativním rozboru nebo dodateč ně. U jednotlivých typů sinic měříme údaje uvedené v tabulce 3. Tabulka 3 typ sinice co se měří tvar buňky vzorec rovná vlákna, u kterých nepočítáme šíř ka vlákna (s), jednotlivé buň ky (např. Planktothrix, dé lka vlákna (d) Aphanizomenon, Pseudanabaena)) válec 3,14 (s/2) 2 d Microcystis (kolonie z n buněk) průměr buň ky (d) koule 4 / 3 3,14 (d/2) 3 n Anabaena (vlákno z n buněk) průměr buň ky (d) koule 4 / 3 3,14 (d/2) 3 n sinice s kulatou kolonií z těsně u sebe nahlouč ených buněk (Aphanocapsa incerta) šíř ka (s) a dé lka buň ky (d) válec 3,14 (s/2) 2 d n průměr kulaté kolonie (d k ) koule 0,74 4 / 3 3,14 (d k /2) 3 Woronichinia (kolonie z n buněk) šíř ka (s) a dé lka (d) buň ky elipsoid 4 / 3 3,14 (s/2) 2 d/2 n 7 Pro komůrku Cyrus I je objem 0,01ml. 11

2.8 Stanovení chlorofylu a Stanovení chlorofylu a se provádí dle Č SN ISO 10260. 2.9 Archivace Pro případ sporů a případných revizí kvantifikace je nutno archivovat analyzované vzorky po dobu 21 dnů. Do 100ml lahví z tmavé ho skla převedeme zbytek vzorku použité ho ke kvantifikaci a konzervujeme několika kapkami Lugolova č inidla dle Utermöhla (2.4.1). 2.10 Laboratorní protokol V případě dokumentace laboratorního zpracování vzorku platí stejný systé m, jako pro odběrový protokol (Část 1). Laboratorní protokol by měl v zájmu zásad opakovatelnosti kvantifikace, zásad správné laboratorní praxe a kontroly a hodnocení kvality práce obsahovat minimálně tyto údaje: den, hodina, místo převzetí vzorku, kdo předal, vizuální vzhled (velikost shluků, zda je biomasa u dna nebo u hladiny), pach, způsob koncentrace vzorku, velikost pórů použité ho filtru, způsob dezintegrace, použitá metoda kvantifikace, způsob výpoč tu buněk (od koncentrace až po koneč ný výpoč et poč tu buněk na 1 ml), seznam organismů nalezených ve vzorku a jejich kvantifikace, komentář k mikroskopické analýze (velikosti kolonií, přítomnost pikoplanktonu, zdravotní stav jedinců zejmé na podíl mrtvých, odumírajících č i rozkládajících se kolonií, zbarvení, přítomnost parazitů, struktura, neobvyklé tvary kolonií apod.). V závěru protokolu je uvedeno datum, hodina a místo zpracování, jmé no a podpis zpracovatele, komu byly výsledky předány a kde je vzorek uložen pro případ revize analýzy. 2.11 Doplňky k postupu 2.11.1 Využití fluorescence Stanovení poč tu buněk v epifluorescenč ním mikroskopu je výhodné například pro počítání vzorků s malými buň kami. Nese však s sebou 2 problé my: A) Při použití fluorescence většinou nelze zaostřit souč asně buň ky a počítací mříž ku. Zde lze doporuč it proměření velikosti zorné ho pole při urč ité m zvětšení a konkré tním objemu počítací komůrky a počítat poč ty buněk v zorné m poli s následným přepoč tem na 1 ml. Při této metodě je nutno propočítat alespoň 5 zorných polí (zde je praktické mít vzorek dostateč ně naředěný). Mříž ku komůrky a fluorescenci lze pozorovat dle našich zkušeností při maximálním uzavření clony na kondenzoru a co nejnižší intenzitě procházejícího světla (musí být ještě patrná mříž ka a zároveň nesmí procházející světlo znemožnit pozorování fluorescence). B) Při použití epifluorescence je nutno uvé st do protokolu systé m spekter excitace a emise. Nejběž nější jsou systé my s modrým excitač ním světlem (excitace 450-480 nm, dichroické zrcadlo 500 nm, barierový filtr 515 nm, které umožní dobře počítat pouze živé řasy, ale cyanobakterie a mrtvé buň ky jsou patrné pouze jako růžové nebo zelené stíny), a systé my se zeleným excitač ním spektrem (excitace 445-580 nm, dichroické zrcadlo 570 nm, barierový filtr 610 nm), které zvýrazní řasy i sinice, živé i mrtvé buň ky. Oba systé my tedy poskytují zcela odlišné výsledky. 12

Pro snadnější použití uvádíme příklady sestav filtrů u běž ných fluorescenč ních mikroskopů: Označ ení Excitač ní filtr Dichroické zrcadlo Barié rový filtr Nikon G-2A 510-560 575 590 Olympus Carl Zeiss Hund Pozná mka: Chybě jící ú daje budou doplně ny. 2.11.2 Zjednodušená metoda Doporuč ení WHO 2000 umožňuje použití tzv. zjednodušené metody, kdy je na podložní sklíč ko nanesena kapka o známé m objemu, ve které m jsou počítány buň ky. Dle našich zkušeností lze tuto metodu doporuč it pro nepříliš koncentrované a dobře dezintegrované vzorky. Nanášíme dle velikosti krycího sklíč ka mikropipetou 10-20 µl. Je-li vzorek dobře dezintegrován, není nutno špič ku mikropipety upravovat a tak zanášet zdroj variability. Š patnou dezintegraci poznáme již tím, že krycí sklíč ko dobře nepřilne a vytvoří se vzduchové mezery. Větší objemy většinou přináší komplikace s kumulací buněk u krajů sklíč ka a problé my se zaostřováním buněk, které jsou v několika vrstvách. Při vhodně volené koncentraci/ředění vzorku jde o urychlení práce tím, že počítáme buň ky v 5 pásech (z toho 2 krajových), vypočítáme plochu pásů, plochu krycího sklíč ka a dostaneme poč et buněk v nanesené m objemu, který přepočítáme na 1 ml. Výsledky získané touto metodou jsou zatíž eny menším rozptylem (variabilitou), než při použití této metody bez dezintegrace (počítání kolonií v kapce o urč ité m objemu), protože variabilita je ovlivněna především poč tem kolonií, které jsou přítomny v mikroskopované m vzorku. Při používaných objemech (10-50µl) je pravděpodobnost zcela homogenního vzorku malá. Při tomto postupu však můžeme použít všechny dostupné suché objektivy, tenké krycí sklo, takže objekty jsou pak lé pe vidět, což je vhodné u drobných v komůrce špatně viditelných organismů. 2.11.3 Kalibrace měření objektů v mikroskopu 2.11.3.1 Měřenídélky vlá ken srovná ním s mříž kou komůrky Dé lku vláken podle bodu 2.6.7.2 můžeme odhadovat podle velikosti mříž ky počítací komůrky. Pro komůrku Cyrus I je strana velké ho č tverce 250 µm, menšího 125 µm. Dé lky se snažíme odhadnout s přesností na 10 µm. Je velmi vhodné si odhad dé lky u některých vláken zkonfrontovat následným změřením okulárovým mikrometrem. Přesnější, ale č asově nároč nější je měřit pomocí okulárové ho mikrometru všechna vlákna. 13

3 Vyhodnocení a interpretace analýz, formulace závě rů Prognóza dalšího vývoje Zvýšení koncentrace biomasy cyanobakterií lze oč ekávat, když jde o nádrž s koncentrací celkové ho fosforu větší než 0,05 mg/l, v nádrži docházelo k masové mu rozvoji cyanobakterií v minulých letech, v nejbližším týdnu lze očekávat sluneč né poč así s teplotami nad 15 C, průhlednost vody je vyšší než 1m (minimální konkurence nanoplanktonu a vysoká abundance zooplanktonu), byla pozorována tvorba vodních květů na dalších místech nádrže (viz odběrový protokol), ph vody je vyšší než 7 jsou splněny obecné hydrobiologické podmínky pro masový rozvoj cyanobakterií Sníž ení koncentrace biomasy cyanobakterií lze oč ekávat, když je oč ekáváno deštivé poč así, dlouhodobý mírný, nebo celodenní silný vítr, ph vody je menší než 7, průhlednost vody je menší než 1m, ve fytoplanktonu dominují řasy a rozsivky, koncentrace celkové ho fosforu je menší než 0,05 mg/l, lze očekávat zvýšený pohyb vody (povodně, proplachování a jinámanipulace s vodou v nádrži), mikroskopickáanalýza prokázala přítomnost parazitů cyanobakterií apod. Mezní hodnoty kvantifikace biomasy fytoplanktonu systém rozhodování a následných opatř ení Signalizace I. stupně je vyhlášena tehdy, když je přítomno více něž 20000 buněk sinic v 1 ml nebo více něž 10 µg/l chlorofylu a při dominanci sinic nebo objemové biomasy více než 2 mm 3 /l vody v příhladinové vrstvě (0 až 30 cm tedy pravděpodobný kontakt). Při této koncentraci buněk lze očekávat pouze lehké zdravotní obtíž e v nízké frekvenci (kontaktní dermatitidy, alergické reakce očí a sliznic). Zdravotní problé my následkem microcystinů nejsou pravděpodobné. Signalizuje možnost masové ho rozvoje cyanobakterií (zejmé na při sluneč né m poč así). Proto volíme zkrácení odběrové periody další odběr do 5-7 dnů. Signalizace II. stupně je vyhlášena, je-li přítomno více než 100000 buněk sinic v 1 ml vody nebo více něž 50 µg/l chlorofylu a při dominanci sinic, popřípadě objemové biomasy více než 10 mm 3 /l v příhladinové vrstvě (0 až 30 cm). Takovákoncentrace sinic skýtápotenciál pro ohrožení zdraví koupajících se rekreantů a expozice toxiny a alergeny při vodních sportech. Jsou informovány místní úřady a správce povodí. Při této koncentraci biomasy sinic je nedoporuč eno koupání a vodní sporty zejmé na pro dětí, alergiky, těhotné ženy a pacienty s oslabeným imunitním systé mem. Na výstražné informač ní tabuli je uveden důvod omezené ho rekreač ního využ ití toxické cyanobakterie. Obyvatelé by měli být informováni formou letáků, denním tiskem a vysíláním lokálních stanic. Při přítomnosti druhů vytvář ejících mohutné příhladinové květy (hlavně Microcystis, Anabaena) hlídat vznik vodních květů (zabudovat povinnost denní kontroly do provozních řádů koupališť). Signalizace III. stupně je vyhlášena, je-li na nádrži přítomen typický vodní květ, tedy kumulace biomasy sinic vodního květu nebo kumulace bentických sinic v typických koláčích při hladině. Provozovatel nebo osoba, kteráoznač ila koupaliště, musí v místě obvyklým 14

způsobem zajistit informaci veřejnosti o tom, že vodu nelze použít ke koupání. Vhodné je uvé st typ nebezpečí a další podrobnosti o toxinech sinic. Koncentrace biomasy se přitom může velmi rychle měnit dle směru větru, dle mikroklima v zátokách apod. Zde je mimořádně důležitásprávnámetodika odběru. Nádrž, ve které byly překroč eny mezní hodnoty II. nebo III. signalizač ního stupně, je možno považovat za vhodnou pro rekreač ní úč ely bez omezení nejdříve 1 týden poté, co koncentrace biomasy klesla pod mezní hodnoty II. signalizač ního stupně. Pozná mka: Stanovení počtu buně k nenahrazuje požadavek vyhlá šky 464/2000 Sb. na stanovení ukazatele živé organismy - fytoplankton v jedincích na ml. Použití limitů v buňká ch sinic/ml (případně dalších ukazatelů biomasy) však mnohem přesně ji postihuje riziko ze sinic v koupalištích ve volné přírodě. Uvedené limity jsou převzaty z doporučení WHO. Hodnocení na základě počtu jedinců (organismů ) je velmi problematické a holé číslo počtu jedinců fytoplanktonu/ml má velmi nízkou vypovídací hodnotu. Ani v případě, že máme k dispozici doplňující ú daje (kolik je sinic, jakých a v jakém stavu - Aphanizomenon ve vločká ch nebo rozpadlý na jednotlivá vlá kna; jsou-li ve vzorku vlá knité sinice rozpadlé na velmi krá tké fragmenty; u kolonií Microcystis ú daje o velikosti atd.), však nelze zodpově dně určit konkrétní limity. Interpretace a srovnávání analýz Výsledky stanovení objemové biomasy většinou dobře korelují s kvantifikací biomasy pomocí chlorofylu a. Mezi poč tem buněk (ani jedinců) a množstvím chlorofylu a nebo objemovou biomasou přímý vztah většinou není, což znamená, že poč ty buněk mají jinou výpovědní hodnotu, než objemová biomasa a chlorofyl a. Proto je pro odpovědné rozhodování dobré mít k dispozici poč ty buněk a zároveň koncentraci chlorofylu. Je-li poč et buněk vysoký (např. na hranici 100.000 b/ml) a koncentrace chlorofylu a např. 25g/l, je nutno ověřit v protokolu, zda ve vzorku nebylo více než 30% sinic s drobnými buň kami, které nadhodnotily poč ty, ale k množství biomasy přispěly méně. V takových případech je vhodné opakovat odběr (dle aktuálního poč así) nejpozději do 1 týdne a restriktivní opatření podmíneč ně odložit. 15

Příloha 1: Návrh pracovního protokolu pro kvantitativní stanovení cyanobakterií Taxon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 16