Státní zdravotní ústav Expertní skupina pro zkoušení způsobilosti Organizátor programů zkoušení způsobilosti akreditovaný ČIA, reg. č. 7001 Šrobárova 48, 100 42 Praha 10 Vinohrady Závěrečná zpráva Zkoušení způsobilosti v lékařské mikrobiologii (Externí hodnocení kvality) PT#M/34/2010 (č. 684) Průkaz DNA HSV a VZV Praha, leden 2011 Zařazeno do Národního programu zkoušení způsobilosti
Obsah 1. Souhrnné informace o přípravě a hodnocení PT (Proficiency Testing) 3 2. Hodnocení 4 3. Výsledky zúčastněných laboratoří 4 4. Závěr 5 5. Příloha výsledkový protokol jednotlivé laboratoře 6 Program zkoušení způsobilosti PT#M/34/2010 byl zaměřen na průkaz DNA virů HSV a VZV. Návrh a realizace PT#M/34/2010 byly prováděny podle standardního operačního postupu SOP M/34 na pracovišti Expertní skupiny pro zkoušení způsobilosti (ESPT) Státního zdravotního ústavu (SZÚ). Toto pracoviště je akreditováno Českým institutem pro akreditaci, o.p.s. jako organizátor programů způsobilosti č. 7001. S veškerými informacemi dodanými účastníky je zacházeno jako s důvěrnými a nejsou bez souhlasu účastníka poskytovány třetím stranám. Nedílnou součástí závěrečné zprávy je výsledkový protokol jednotlivé laboratoře. Koordinátor: Ing. Hana Hrbáčková Tel: 267 082 247(2476) Zprávu vypracoval: Ing. Hana Hrbáčková, NRL pro herpetické viry, SZÚ Praha Zprávu schválil: Ing. Hana Hrbáčková Dne: 14.1.2011 Pracoviště 2 ESPT (AP OML - Akreditační pracoviště Odboru mikrobiologických laboratoří): www.szu.cz/espt email: apcem@szu.cz Státní zdravotní ústav Praha 2/6
1.Souhrnné informace o přípravě a hodnocení Identifikace kola/cyklu: Název: Organizátor: Vedoucí ESPT Koordinátor: Subdodavatel: Charakteristika materiálu: Podstata a účel PT/EHK: Kritéria pro účast na PT/EHK: Způsob přípravy: Množství připravovaného test. materiálu: Označení vzorků: Zabezpečení kvality vzorku: Testy homogenity a stability: Podmínky distribuce a uchovávání vzorků: Možné zdroje chyb: PT#M/34/2010 Průkaz DNA HSV a VZV SZÚ Centrum laboratorních činností - ESPT Šrobárova 48, Praha 10, 100 42 tel.: + 420 267082575, fax.: + 420 267082271 Ing. Věra Vrbíková Ing. Hana Hrbáčková není 7 + 1 vzorek lyofilizovaného supernatantu tkáňové kultury obsahující některý z testovaných virů nebo jen médium. Detekce DNA viru HSV1, HSV2 nebo VZV metodou PCR kvalitativním nebo kvantitativním způsobem. Vyšetření všech zaslaných vzorků a odeslání výsledků ve stanoveném termínu. Výchozím materiálem pro přípravu vzorků je tkáňová kultura buněk LEP zainfikovaná některým z virů nebo čistá. Po dostatečném pomnožení viru a jeho uvolnění do média je oddělen supernatant, který se ředící řadou naředí, otestuje a vybraný vzorek kvantitativně rozplní do lyofilizačních lahviček á 1 ml. Nejméně 30 ml od každého vzorku ESPT SZÚ PT # M/34/2010 EHK 684 DNA HSV a VZV Pro zajištění stability jsou výchozí vzorky lyofilizovány. Výchozí materiál a finální (rozplněný a lyofilizovaný) vzorek je testován na přítomnost cílových markerů metodami kvantitativní PCR dle SOP- NRL/HV-05 a -06. Distribuce v předepsaném obalu. Přeprava a uchovávání vzorků před rekonstitucí v chladničce při teplotě 2-8 0 C, uchovávání po rekonstituci á 1 ml destilované vody při -18 až -24 C. Nedodržení správné laboratorní praxe, lidský faktor, u kvantitativního testování neexistence jednotného kvantitativního standardu. 22 laboratoří Počet účastníků: Termín distribuce: 2.11.2010 Způsob distribuce: Rozvoz přepravní službou Přílohy: pokyny účastníkům Písemně vyplněním tabulek a dotazníku distribuovaných spolu se vzorky Předání výsledků: a doručením doporučeným dopisem do 2.12.2010. Za vztažnou hodnotu kvalitativního vyhodnocení je považován výsledek Určení přijaté vztažné získaný v NRL, u kvantitativních výsledků je to průměr získaných hodnoty: výsledků bez nejmenší a největší odlehlé hodnoty. Způsob vyhodnocení výsledků: Určení maximální směrodatné odchylky: Termín rozeslání zprávy účastníkům: Kvalitativní hodnocení přiděluje každému shodnému výsledku 2 body. Hranice úspěšnosti se obvykle nachází mezi 80 až 90%. Kvantitativně hodnotíme shodu se vztažnou hodnotou +- jeden řád, případně půl řádu dvěma body, v případě větší diference jedním nebo žádným bodem. Nepoužívá se Leden 2011 Státní zdravotní ústav Praha 3/6
2. Hodnocení Série EHK 684 obsahovala 7 testovacích lyofilizovaných vzorků a jeden neoznačený edukativní (všechny k rekonstituci á 1 ml). Vzorky byly odeslány k testování 2.11.2010, termín pro ukončení testování byl 2.12.2010. K sérii 684 se přihlásilo 22 laboratoří, výsledky vrátily všechny laboratoře. Pro vyhodnocení jsou podstatné výsledky NRL, ale přihlíží se také k výsledkům všech zúčastněných laboratoří jako celku. Kvalitativně je shodný výsledek každého vzorku hodnocen dvěma body. Následně jsou porovnány hodnoty získaných součtů a stanovena hranice úspěšnosti v procentuálním vyjádření. Pro sérii 684 byla stanovena hranice 90%. Kvantitativně jsou porovnávány výsledky s průměrem všech zúčastněných bez nejvyšší a nejnižší hodnoty a hodnocena shoda do +- jeden řád dvěma body, případně u vzorků s výborně reprodukovatelnými výsledky +- půl řádu. Odchylka větší než jeden řád je hodnocena jedním bodem, větší než 2 řády bez přidělení bodu. Falešná pozitivita je sankcionována -1 až -2 body dle míry pozitivity, protože se jedná o závažný jev, který nelze tolerovat a je třeba mu maximálně předcházet. Správné výsledky Vzorek HSV výsl. kvalitativní Vztažná hodnota (průměr) Kvant. rozsah pro 2 body [kopie/ml] VZV výsl. kvalitativní 1/2010 HSV2 363765 36400-3,64.10 6 negativní Vztažná hodnota (průměr) Kvant. rozsah pro 2 body [kopie/ml] 2/2010 negativní pozitivní 16040 1604-160397 3/2010 HSV1 9203 920-92030 negativní 4/2010 negativní negativní 5/2010 negativní pozitivní 60406 30205-302030 6/2010 HSV1 37515 3751-375150 negativní 7/2010 HSV2 2800 280-28000 negativní Neoznače ný negativní slabě pozitivní 3063 _ Souhrnné vyhodnocení Všechny přihlášené laboratoře se série 684 zúčastnily a zaslaly výsledky. Kvalitativní část série dopadla výborně, pouze jedna laboratoř měla bodovou srážku a to za jednu slabou falešnou pozitivitu HSV2. Všechny laboratoře uspěly. Kvantitativní výsledky ukázaly rozdílné nastavení metod s rozdíly u většiny vzorků až o tři nebo dokonce čtyři řády. Následující tabulka naznačuje, že odlišnost může souviset s diagnostickou soupravou (systém Gene Proof) nebo s individuálními podmínkami v jednotlivých laboratořích (soupravy Artus). Dvě laboratoře měly téměř všechny výsledky silně podhodnoceny a mají proto nízké bodové ohodnocení. Z pohledu konkrétních vzorků nevytvořily výsledky jednu hlavní skupinu s jednotlivými odlehlými hodnotami, ale spíše se rozdělily na dvě skupiny slabší a silnější pozitivita plus občasný extrém nízký či vysoký. Výjimku tvoří výsledky VZV u vzorku 5, které byly natolik podobné, že bylo možné a správné použít náročnější bodové ohodnocení (dvoubodové optimum v intervalu +- půl řádu). U ostatních vzorků, ať nízkých či vysokých, to přínosné nebylo. VZV slabě pozitivní neoznačený nebodovaný vzorek až na jednu výjimku určili všichni, laboratoř která ho nezachytila se VZV EHK účastnila kvalitativně. Státní zdravotní ústav Praha 4/6
3. Výsledky EHK Průkaz DNA HSV dle použitých souprav Výrobce Vz1- Vz2 Vz3- Vz4 Vz5 Vz6- Vz7- kitu/izol. HSV2 HSV1 HSV1 HSV2 Gene Proof 1,53.10 6-19 740 - - 2,27.10 5 4 100 - - 1,25.10 6 35 300 41 300 18 800 / MP 2,02.10 5 7 975 1,62.10 5 3 800 Artus / MP 46 000 12 000 25 000 250 / Q 1 960 443 733 401 /auto Q 6 450 257 1 240 100 / Q 4,22.10 5 34 500 61 000 7 650 /Q,viral 1,7.10 5 7 900 32 000 700 / Q 1,78.10 5 1 250 2 350 119 / Q 48 000 NT 6 350 1445 TMB / MP 90 000 2 000 4 000 <100 Argene /Q 1,57.10 5 2 330 14 300 1 260 in house/q 2,77.10 5 3 892 27 652 4 271 / MN 3,5.10 5 3 700 20 000 750 / Q 1,6.10 6 14 700 90 500 11 550 Q= Qiagen, auto Q= automat magn. Qiagen, MP= Magna Pure Roche, viral=high Pure Viral kit Roche, MN= Nucleospin Blood Macherey Nagel. Koncentrace jsou vyjádřeny dle formuláře v poču kopií virové DNA na 1 ml vzorku. NT= netestováno. Výsledky EHK Průkaz DNA VZV dle použitých souprav Vz1 Vz2 Vz3 Vz5 Vz6 Vz7 Neozn. Výrobce kitu/izol. Gene Proof - 89 000-82 500 - - 4 500 - - 3,42.10 5 91 250 12 722 Artus / Q 29,6 182 7 /auto Q 150 2,42.10 5 3 / Q 16 900 80 500 424 / Q 2 000 25 000 140 TMB / MP 10 000 62 000 4 200 / Q 785 15 400 170 / Q 22 950 68 800 NT Argene / Q 7 510 56 800 4 200 in house /Q 5 202 34 813 1 208 / MN 5 600 87 000 40 000 Komentář: Ve skupině výsledků s kvantifikací nebyl žádný falešně negativní výsledek. Ojediněle bylo laboratořemi poskytnuto více sad výsledků (v souvislosti s použitím dvou izolačních nebo detekčních systémů). Státní zdravotní ústav Praha 5/6
4. Závěr Letošní série Průkaz DNA HSV, VZV ukázala celkově velmi dobrou úroveň PCR diagnostiky virů HSV a VZV v laboratořích v ČR. Kvantitativní vyhodnocení naopak ukazují příliš velké rozdíly způsobené odlišným kvantifikačním nastavením, odlišným charakterem výsledků některé komerční souravy a dalšími vlivy. Přesto je nezbytné, aby laboratoře se silně podhodnocenými výsledky optimalizovaly PCR reakci a systém vyhodnocení, neboť hrozí riziko falešné negativity u slabě pozitivních vzorků a zcela diskrepantní výsledky při zaslání vzorků pozitivního pacienta do různých laboratoří (například při kontrole po návratu z centralizované léčby aj.). Státní zdravotní ústav Praha 6/6