Testování in vivo Jana Horáková 9.1.2017
Proces tkáňového inženýrství 1. Návrh nosiče Seznámení se s problematikou dané tkáně/orgánu Návrh nosiče pro danou aplikaci 2. Příprava a charakterizace nosiče 5. Klinické testy Klinické testy Klinická praxe 3. Testování in vitro 4. Testování in vivo Cytotoxicita nosiče Testy adheze a proliferace, migrace Testy buněčné de/diferenciace Testování in vivo
Obsah přednášky Definice pojmů in situ, in silico, in vitro, ex vivo, in vivo Historie in vivo pokusů Platná legislativa Modelové organismy Konkrétní příklady in vivo testování scaffoldů
Přehled testovacích metod v biomedicíně
Testování na zvířatech Použití zvířecích modelů pro experimenty Základní výzkum: zkoumání reakcí na podněty, vliv různých faktorů na organismus Aplikovaný výzkum: testování léčiv, chemických látek, hnojiv, pesticidů, barev, prostředků pro domácnost, kosmetických složek, geneticky modifikovaných organismů, přírodních látek a jejich směsí; výzkum léčebných postupů a operací, produkce různých látek (imunologie) výuka na středních a vysokých školách ekologické i etologické studie Ročně 50-100 milionů zvířat (375 091 v ČR 2011)
Historie první písemné zmínky Řecko 2.-4. století př.n.l. Aristoteles a Erasistratus první experimenty na zvířatech Galen otec tzv. vivisekce = chirurgický zákrok prováděný za účelem získání informace (výzkum), ne pro zlepšení zdravotního stavu
Avenzoar (Ibn Zuhr) 12. století, Arábie, testování chirurgických zákroků na zvířatech Louis Pasteur (1880) demonstrace tzv. germ theory na ovci nakažené antraxem Ivan Pavlov (1890) pokusy se psy (podmíněné, nepodmíněné reflexy; NC za fyziologii a medicínu 1904)
1922 izolace insulinu ze psů revoluce v léčbě diabetu (NC) 1957 pes Laika ve vesmíru 1970 léčba lepry (atb, vakcíny) testována na pásovcích 1996 ovce Dolly první naklonovaný živočich
20. století studium toxikologie díky zpřísnění zákonů ohledně prodeje léčiv - 1937 aféra Elixir sulfanilamid (antibakteriální lék proti streptokokovým infekcím smrt 100 lidí) - 50.-60. léta 20. století Conterganová aféra (thalidomide) sedativum a hypnotikum pro těhotné ženy X teratogen, karcinogen
Legislativa První zmínky o zákonech na ochranu zvířat se objevují ve Velké Británii od roku 1822 1876 regulace experimentů na zvířatech (The Cruelty to Animals Act) V USA založena skupina ASPCA (American Society for Prevention of Cruelty to Animals) 60. léta 19. století 1966 The Laboratory Animal Welfare Act (AWA)
Legislativa v ČR Akreditace od Ústřední komise na ochranu zvířat Každý projekt musí být schválen odbornou komisí daného zařízení a rezortní komisí ministerstva V zemích EU směrnice 2010/63/EU V ČR zákon č.246/1992 Sb na ochranu zvířat proti týrání
Principy 3R Poprvé popsány roku 1959 (W.M.S.Russel a R.L.Burch) 1. Replacement (nahrazení) náhrada testování na zvířatech jinou metodou pro dosažení stejného vědeckého poznatku 2. Reduction (snižování) použití méně zvířat pro získání dostatečné informace, popř. získání více informací z daného počtu testovaných zvířat 3. Refinement (zmírňování) zmírnění potenciálního utrpení zvířat během experimentů, zajištění vhodných podmínek pro zvířata
Replacement Test kožní dráždivosti in vitro EpiDerm model
Zvířecí modely v biomedicíně základní výzkum mechanismů onemocnění vývoj nových terapeutických strategií vývoj a objev léčiv, sér, očkovacích látek preklinické studie testováni toxicity vývoj nových zvířecích modelů dle potřeby a zájmu
Výběr vhodného modelu 1) vhodný na sledování zvoleného onemocnění 2) reaguje podobně jako člověk 3) správný design experimentu (demonstrace odpovědi, vhodná velikost, délka života, adekvátní kontroly, dostatečné množství zvířat - statistické vyhodnocení) 4) validace modelu
Požadavky na ideální modelový organizmus a) biologické dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách dostatečně rychlý vývoj nekomplikovaný životní cyklus produkce většího množství potomků b) metodické možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a cílená mutageneze, reverzní genetika) velikost, životnost
Mikrobiálního osídlení zvířat Zvířata konvenční nedefinovaná mikroflóra, otevřený chov za dodržení základních hygienických podmínek. SPF - "specific pathogen free " mikróflora zvířat prokazatelně neobsahuje specifické patogeny (salmonela, tuberkulóza, hepatitida ), jinak není přesně definována. Axenická - germ free bez mikroflóry v trávicím traktu a na povrchu těla. Mláďata - hysterektomie do bezmikrobního prostředí izolátoru. Gnotobiotická velmi dobře definovaná střevní mikroflóra. První generace očkování mikroflóry axenickým zvířatům. Chov ve sterilním prostředí bezmikrobní izolátory.
bezmikrobní (axenická) GNOTOBIOTICKÁ DEFINOVANĚ ASOCIOVANÁ monoxenická dixenická polyxenická bezmikrobní A A+B A+B+C SPF bez specifikovaných patogenů -P 1 -P 2 -P 3 konvenční
Systém chovu zvířat Otevřený vstup i výstup zvířat, osob i materiálu je bez bariéry Bariérový prostor pro zvířata je oddělen od vnějšího prostředí a vstup zvířat, osob i materiálu je možný jen způsobem zajišťujícím ochranu před průnikem nežádoucích vlivů z vnějšího prostředí (sterilizace vody, potravy, podestýlky, zvýšená osobní hygiena ošetřovatelů). Izolátorový prostor pro zvířata je trvale oddělen bariérou od vnějšího prostředí a osob, které se zvířetem manipulují.
Bariérový systém
Izolátorový systém
Vybrané modelové organizmy Bezobratlí: háďátko (Caenorhabditis elegans) octomilka (Drosophila melanogaster) Obratlovci: drápatka (Xenopus laevis) danio (Danio rerio) zebrafish myš (Mus musculus) potkan (Ratus norvegicus) králík (Oryctolagus cuniculus)... psi, kočky, prasata, primáti - opice
Bezobratlí Testování nepodléhá legislativě Výhody: možnost testování mnoha jedinců, dostupnost, finančně nenáročné, krátký životní cyklus Nevýhody: velké odlišnosti ve stavbě a funkcích orgánů
háďátko (Caenorhabditis elegans) - především vývojová biologie - přesně definovaný počet buněk a jejich osud, průhledné - model studia nikotinové závislosti - studium molekulární genetiky stárnutí octomilka (Drosophila melanogaster) - především genetické studie - množství mutantů a genetických modifikací - studium genetiky poruch srdce a neurodegenerativních onemocnění - alternativa k savcům, zrychlení studia a testování terapie
Obratlovci
drápatka (Xenopus laevis) - vývojová biologie, toxikologie - studium lidských genů - dříve těhotenské testy danio (Danio rerio) - využití: vývojová biologie, onkologie, toxikologie, teratologie, výzkum kmenových buněk, regenerativní medicína,... - Glofish první GMO na trhu
Myš (Mus musculus var. alba) Albinotická forma myši domácí Polyfázické zvíře, hmotnost 40-50 g Nejčastěji používané (vhodná velikost, nízké náklady, snadná manipulace, relativně rychlá reprodukce) 99% shodných genů Genetická modifikace studium lidských nemocí
Potkan (Rattus norvegicus var. alba) větší než myš (více buněk, větší orgány,...) Několik forem: čistě bílý s červenýma očima, černý či žlutavě bílý s černýma očima Krotkost, malá biologická variabilita, hmotnost 250 g Studium fyziologie, toxikologie, rakoviny Složitější genetické manipulace pouze základní výzkum
Králík (Oryctolagus cuniculus) výhoda velikost, podobnost operační techniky Hmotnost 1,5-6 kg model aterosklerózy, spontánní mutace lipidového metabolismu, srdečná hypertrofie, testy iritace oka, produkce polyklonálních protilátek geneticky podmíněný glaukom
Kočky a psi Kočky - Výzkum neurologie Bíglové studium kardiologie, endokrinologie, kostí a chrupavek Český strakatý pes (Horákův laboratorní pes) studium epilepsie, sledování dědičnosti chybění zubů, transplantace ledvin
Prasata Domácí prasata (60 kg) x miniprasata (30 kg)
Primáti Toxikologie, studium AIDS, hepatitidy, neurologie, chování, reprodukce, genetika, xenotransplantace
Hlavní biologická data laboratorních zvířat Pes Kočka Králík Potkan Myš Morče Březost (dny) 58-66 56-64 30-33 21-23 19-21 65-72 Chromozomy (počet) 78 38 44 42 40 64 Rekt. teplota ( C) 38,3 38,6 39,2 38 37,4 38,6 Srdeční frekvence 70-100 110-200 200-230 260-400 500-600 130-190 Respirační frekvence 12-20 18-25 35-60 70-150 100-210 90-150 Krevní tlak (mm Hg) 115/60 120/75 110/80 120/80 115/80 90/56 Erytrocyty (10 12 /l) 4-8 6-10 4-6 5-11 6-12 4-6 Hemoglobin (g/l) 149 (120-180) 110 (80-140) 120 (80-150) 150 (120-180) 150 (100-200) 140 (110-170) Leukocyty (10 9 /l) 7-18 6-15 6-12 8-14 7-15 4-15 % neutrof. 60-80 30-90 30-50 18-36 10-40 18-60 % lymfoc. 12-30 10-70 35-70 60-70 35-90 55-80 % eosinof. 2-8 4-9 1-3 1-4 0-7 1-5 Trombocyty 200-600 170-700 110-400 400-800 100-400 85-160 Glukóza (mmol/l) 4,9 3-5 3,5-7 5-8 5 -
Podmínky ve viváriích Teplota: myš, potkan 22 C; králík, pes 18 C; prase, ovce 17 C Vlhkost vzduchu: relativní vlhkost 55% (30-70%) Světlo: 12h světlo 12h tma (důležitá i intenzita osvětlení) Aklimatizace zvířat: min. 5 dnů po dodání z chovného zařízení Voda: ad libitum Potrava: standardní peletovaná krmná směs
Design experimentu Výběr vhodného modelového organismu Místo implantace Doba implantace Metody sledování během experimentu Metodika hodnocení po ukončení experimentu (histologie, toxikologie, mechanika)