Návrhování experimentů pro biomedicínský výzkum pomocí metod DOE Libor Beránek, Rudolf Dvořák, Lucie Bačáková Abstrakt V minulých desetiletích se v medicíně rozšířilo použití umělých materiálů, ať už v orthopedii, zubní či rekonstrukční chirurgii. Jedním z řady potenciálních materiálů uvažovaných pro tato použití je i uhlíkový kompozit CFRC. Uhlíkové kompozity jsou však náchylné k uvolňování částic uhlíkového materiálu do okolního prostředí, které se mohou kumulovat v tkáních a poškodit je. Dalším faktorem ovlivňujícím proliferaci buněk může být i jejich doménové uspořádání. Proto bylo rozhodnuto, že za pomoci statistických metod DOE bude navržen experiment, který má zhodnotit vliv a přínos různých zpracování povrchu, na biokompatibilitu tohoto kompozitního materiálu. Adhese a proliferace buněk jsou obvykle ovlivňovány morfologií povrchu, popsanou například drsností povrchu. Pro možnost využití umělých materiálů jako biomateriálů je potřeba pochopit vliv drsnosti a jiných faktorů ovlivňujících vlastnosti povrchu na biokompatibilitu daného materiálu. Klíčová slova: DOE, navrhování experimentů, CFRC, PACVD Úvod Kompozitní materiály, například kompozity s uhlíkovou či polymerní matricí vyztuženou uhlíkovými vlákny, jsou považovány za perspektivní pro konstrukci kostních a kloubních náhrad, kostních implantátů, pomůcek pro osteosyntézu i kostních fixací. Jejich nevýhodou však často bývají povrchové fyzikální a chemické vlastnosti méně vhodné pro adhesi buněk a následnou integraci implantátu do okolní kostní tkáně, jako je například nevhodná povrchová topografie materiálu, vysoká hydrofobicita apod.
Uhlíkové kompozity jsou navíc náchylné k uvolňování částic uhlíkového materiálu do okolního prostředí, které se mohou kumulovat v okolních tkáních a poškodit je. Proto je důležitým odvětvím konstrukce materiálů pro dlouhodobou implantaci do lidského organismu povrchová úprava těchto materiálů, například broušením, leštěním a pokrýváním mechanicky odolnými biokompatibilními vrstvami. Biokompatibilní materiál Aby mohl být materiál považován za biokompatibilní měl by mít podobné mechanické vlastnosti jako okolní materiál a nedocházelo tak k aseptické nekróze. Dále nesmí uvolňovat žádné toxické nebo kancerogenní částice a musí splňovat požadovanou interakci s buňkami, tedy mohou být inertní anebo mohou podporovat adhesi v závislosti na jejich zamýšleném použití (např. čočky, klouby vs. cévy, kosti). Kompozitní materiál Carbon-Fiber Reinforced Carbon CFRC byl připraven v Ústavu struktury a mechaniky hornin AVČR (pí Křížková, ing. Gregor) z komerčně dostupné uhlíkové tkaniny (Toray T 800) infiltrované prekursorem uhlíkové matrice (fenolická pryskyřice UMAFORM LE, Synpo a. s., Pardubice). Materiál byl karbonizován při 1000 o C a grafitizován při 2200 o C. Na konci výrobního procesu tedy obdržíme materiál, jehož chemické složení je téměř 100% C. Mechanické vlastnosti mohou být modifikovány ve velkém rozsahu, použitím různých typů tkaní a počtem vrstev. Návrh experimentu Po důkladném rozboru situace byl navržen statistický experiment, který v sobě zahrnuje tři faktory a každý faktor se třemi úrovněmi neboli verzemi. Jedná se o úplný návrh typu 3 3, tedy návrh obsahuje celkem 27 jednotlivých běhů, které pokrývají všechny možné kombinace jednotlivých verzí faktorů. Dále bylo rozhodnuto z důvodu získání odhadu všech možných interakcí mezi faktory,
uvažovat dvě replikace návrhu, tj. celkem 54 běhů. Jedná se tedy o celkem komplikovaný návrh, ale jeho provedení nám poskytne velice důkladnou informaci o vlivu jednotlivých faktorů. Zvolené faktory jsou Faktor A opracování povrchu - úrovně: neopracovaný povrch opracování pomocí laseru opracování broušením Faktor B perforace laserem - úrovně: bez perforace kombinace I (0,1;0,2;0,3) (průměr, hloubka, rozteč) kombinace II (0,4;0,8;1,2) Faktor C deponovaná ochranná vrstva úrovně: bez vrstvy DLC při předpětí -50V DLC při předpětí -100V Celkem tedy bylo připraveno 54 destiček (9x9 mm) s odpovídající úpravou povrchu podle plánu experimentu. Jako response budou sloužit hodnoty počtů buněk třetí den po nasazení a jejich plocha. Měření drsnosti povrchu Měření bylo prováděno na profiloměru Taylor- Hobson Talysurf 6 bez použití kluzné bodky. Měření bylo provedeno na každém z 54 vzorků v 6ti řezech (3 rovnoběžné řezy ve 2 na sebe navzájem kolmých směrech). Byly sledovány následující parametry Ra, Rq, Ry, Rtm, Rv, Rp, Sm, DELQ, Rsk, Rku, S, R3z, Rpm, R3y včetně jejich výběrových směrodatných odchylek. Což nám poskytuje veliké množství dat, které budeme analyzovat ve fázi statistického vyhodnocování experimentu. Vliv opracování povrchu na vybrané ukazatele
[µm], bezrozměrné 70 60 50 40 30 20 10 0 Ra -10 Rq Ry Neupravované vzorky Rtm Broušené Rsk Laserované Rku vybrané ukazatele Graf 1. Vliv opracování povrchu na vybrané ukazatele Vybrané modifikace povrchu Obr.1 broušený povrch Obr.2 laserovaný povrch Obr. 3 broušený + perforace 1+ DLC 2 Obr. 4 broušený + perforace 2 +DLC 2
Obr. 5 laserovaný + perforace 2 Obr. 6 laserovaný + perforace 2 První čtyři snímky byly pořízeny na dílenském mikroskopu vybaveném CCD kamerou při 40ti násobném zvětšení. Snímky 5 a 6 byly pořízeny na elektronovém řádkovacím mikroskopu při zvětšení 35x resp. 150x. Závěr Momentálně jsou vzorky spolu s plánem experimentu ve Fyziologickém ústavu AV ČR, kde na nich bude provedena kultivace a následné vyhodnocení počtů a ploch buněk. Údaje poté budou podrobeny statistické anylýze, za účelem určení rohodujících faktorů, které mají nejvýraznější vliv na růst buněk. Dále bude určena optimální varianta opracování povrchu kompozitního materiálu. Literatura [1] Bačáková L., Nosková L., Filová E., Švorčík V., Koutná E., Starý V., Horník J., Glogar P.: Adhese cévních a kostních buněk na umělé materiály vyvíjené pro tkáňové inženýrství (Adhesion of vascular and bone cells on synthetic materials developed for tissue engineering), Československý časopis pro fyziku 56: 74-79, 2006 [2] Bačáková L: Tkáňové inženýrství nový trend v současné medicíně a biotechnologiích. Předneseno na akci Týden vědy a techniky, 6.-12. 11. 2006, Praha
Adresy autorů: Ing. Libor Beránek, České vysoké učení technické v Praze, fakulta strojní, Ústav strojírenské technologie, Technická 4, 160 00 Praha 6. e-mail: libor.beranek@fs.cvut.cz Doc.Ing. Rudolf Dvořák, CSc., České vysoké učení technické v Praze, fakulta strojní, Ústav strojírenské technologie, Technická 4, 160 00 Praha 6. e-mail: rudolf.dvorak@fs.cvut.cz MUDr. Lucie Bačáková, CSc., Fyziologický ústav AV ČR. Tato práce byla vytvořena za podpory projektu MŠMT 1M06047 - CQR