Viková, M. : MIKROSKOPIE V Mikroskopie V M. Viková

Transkript

1 Mikroskopie V M. Viková LCAM DTM FT TU Liberec, martina.vikova@tul.cz

2 Hloubka ostrosti problém m velkých zvětšen ení tloušťka T vrstvy vzorku kolmé k optické ose, kterou vidíme ostře zobrazenou Objektiv 5x Objektiv 50x Objektiv 100x

3 Minskyho patent Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání. Marvin Minsky

4 Konfokáln lní mikroskopie I Rozdělení: 1. LSCM (Laserová skenovací konfokální mikroskopie) 2. TSM (Tandemová skenovací mikroskopie) Emisní filtr pozadí sledovaný objem Fotodetektor Eliminační apertura Polopropustné zrcadlo Expanze paprsku Objektiv mikroskopu Zaostřená rovina laser Odlišnosti konfokálního způsobu od klasického SM osvětlen je jen jeden bod a signály od okolních bodů (vedle, pod a nad) jsou omezeny otvorem - eliminační aperturou režim osvětlení: epi (reflexní) nebo fluo (fluorescenční) konfokální kondenzor = objektiv (méně odrazů) skenování: rozmítání laserového svazku, příčné posouvání vzorku před objektivem, případně posouvání objektivu nad vzorkem konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem (pro λ = 488 nm tloušťka = 0,4 μm)

5 Využívá Nipkowův disk: Viková, M. : MIKROSKOPIE V Tandemová konfokáln lní mikroskopie I Aperturní otvory jsou uspořádány v Archimédových spirálách Původní Petráňův systém

6 Tandemová konfokáln lní mikroskopie II vzorek se většinou pozoruje okem (nebo chlazenou CCD kamerou) v reálném čase (okulárem) Důležitý doplněk: Nipkowův kotouč desítkyažstovkytisíc otvorů (200 tis) uspořádaných v Archimedových spirálách kotouč rotuje (až desítky Hz) otvory konjugované (v dopadajícím a detekovaném světle) světlo může procházet také stejným souborem otvorů

7 LSCM (laserová skenovací konfokáln lní mikroskopie) Laserový Paprsek (488nm) Dichroické zrcadlo Emisní filtr Detektor řádkovací zrcadla Dírková clona Spektrální charakteristika dichroického zrcadla objektiv Fokální rovina

8 Řádkovací zrcadla Vzorek 2D scanning X Y optika X Y Laser pohyblivé zrcadlo Y 3D scanning X Z

9 Konfokáln lní mikroskopie II Fluorescenční mikroskop Konfokální mikroskop

10 Konfokáln lní mikroskopie III

11 Konfokáln lní mikroskopie vs. Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční m. Konfokální m.

12 Komerční realizace konfokáln lní mikroskopie I Olympus FluoViewTM FV300 Nikon D-ECLIPSE C1/E600

13 Komerční realizace konfokáln lní mikroskopie II

14 Multifluorescenční konfokáln lní mikroskopie I (nahrazení fotonásobi sobiče spektrometrem) Klasický přístup pomocí pásmových filtrů Využití spektrometru umožňuje odlišení jednotlivých struktur i v případě fluorochromů s blízkými emisními maximy. (Zeiss LSM510 Meta, Leica TCS SP2 ) Dr. Bernhard Zimmermann, Product Management Laser Scanning Microscopy, Advanced Imaging Microscopy, Carl Zeiss Jena GmbH

15 Multifluorescenční konfokáln lní mikroskopie II rekonstrukce dendritické buňky dierencované z kostní dřeně geneticky modifikované myši

16 Multifluorescenční konfokáln lní mikroskopie III Spetrální verze konfokální hlavy fy Olympus Skenovací jednotka pro inverzní mikroskop OLYMPUS IX81 3 lasery (multi line Ar laser, HeNe-G and HeNe-R)

17 Multifluorescenční konfokáln lní mikroskop ZEISS

18 Konfokáln lní mikroskopie v materiálov lovém m výzkumu I

19 Konfokáln lní laserový rastrovací mikroskop OLYMPUS LEXT OLS 3000 materiálový výzkum

20 Rastrování I

21 Rastrování II SM KM

22 Rastrování III

23 Identifikace vláken Tuz. Vlna nepraná Austr. Vlna PVD -Ag Mohér. koza nepraná Austr. Vlna PVD úpr. omaku

24 3D zobrazení vláken na LSCM Vlákno bavlny Vlákno Alpaky

25 Tiskařsk ské síto 2D obraz RAW data

26 Tiskařsk ské síto 3D obraz vliv filtrování obrazu I 3D obraz vzorku před úpravou Odstranění šumu z hladkého povrchu

27 Tiskařsk ské síto 3D obraz vliv filtrování obrazu II Odstranění šumu z výstupku Odstranění šumu ze zubatého povrchu

28 Tiskařsk ské síto 3D obraz vliv filtrování obrazu III Odstranění šumu pro polokulové tvary Odstranění šumu pomocí kombinace filtrů + barevné rozlišení tloušťky vzorku

29 Porovnání konfokáln lní a světeln telné mikroskopie Světelná mikroskopie dopadající světlo BF OLYMPUS LEXT KM

30 Porovnání konfokáln lní a elektronové mikroskopie

31 Porovnání AFM a konfokáln lního mikroskopu v případp padě nanovláken PSIA XE - AFM TESCAN VEGA SEM OLYMPUS LEXT KM

32 Tiling 16x.

33 PIXEL From Source Omezení konfokáln lní mikroskopie Laterální rozlišení: Airyho funkce n 1 photons δ y VOXEL δ x α 1 λ 1 x,y,z δ z Kde k je vlnočet. α 2 n 2 photons λ 2 To Detector Rozlišení CM:

34 Mikrotomografie I Mikrotomografie představuje neinavzivní mikroskopickou techniku založenou na absorpci rentgenového záření

35 Mikrotomografie II Princip mikrotomografie je založen na rekonstrukci 3D zobrazení získaného semikruhovým plošným snímačem

36 Mikrotomografie III Ukázka animací 3D rekonstrukcí C-C kompozitu a aktivního uhlíku