UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Sinice výskyt, produkované látky a dopady na zdraví

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakognozie Bakalářská práce Sinice výskyt, produkované látky a dopady na zdraví (rešeršní práce) Školitelka: RNDr. Anna Polášková Hradec Králové 2011 Hana Studená

Tímto bych ráda poděkovala své školitelce paní RNDr. Anně Poláškové za její vstřícnost, trpělivost, cenné rady a připomínky, díky kterým mohla být tato práce napsána a dokončena. 2

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Dne 12. 5. 2011 v Hradci Králové podpis 3

Obsah 1 Úvod a cíl práce... 7 2 Sinice cyanobakterie... 8 2.1 Terminologie... 8 2.2 Evoluce sinic... 8 2.3 Stavba sinic... 8 2.3.1 Thylakoidy... 9 2.4 Taxonomické zařazení sinic... 10 2.4.1 Systém sinic... 10 2.5 Výskyt sinic... 16 2.6 Legislativní opatření... 16 3 Látky produkované sinicemi... 18 3.1 Cyanotoxiny... 18 3.2 Rozdělení cyanotoxinů... 18 3.3 Účinky sinic... 18 3.4 Peptidy... 19 3.4.1 Hepatotoxické cyklické peptidy... 19 3.5 Alkaloidy... 21 3.5.1 Neurotoxické alkaloidy... 21 3.5.2 Cytotoxické alkaloidy... 24 3.5.3 Dermatotoxické alkaloidy... 24 3.5.4 Lipopolysacharidy dráţdivé toxiny... 24 3.5.5 Neznámé bioaktivní sloučeniny v sinicích... 25 4 Mechanismy a projevy toxicity sinic... 26 4.1 Mechanismus účinku microcystinu... 26 4.2 Toxicita nodularinu... 27 4.3 Mechanismy účinku anatoxinů... 27 4.3.1 Anatoxin a... 27 4.3.2 Homoanatoxin a... 28 4.3.3 Anatoxin a(s)... 28 4.4 Mechanismus účinku cylindrospermopsinu... 28 4

4.5 Toxicita saxitoxinu... 28 4.6 Mechanismus účinku lipopolysacharidů... 28 5 Dokumentované případy poškození zdraví... 31 5.1 Epidemiologické důkazy... 31 5.2 Toxikologické studie... 32 6 Metody hodnocení bezpečnosti vod... 33 6.1 Odběr vzorků... 33 6.2 Laboratorní příprava vzorků pro mikroskopické hodnocení... 33 7 Analýza cyanotoxinů... 35 7.1 Chromatografické metody... 35 7.2 Imunochemická analýza... 35 7.3 Optické techniky... 36 8 Vývoj a mezinárodní srovnání obsahu cyanotoxinů ve vodách... 38 9 Prevence expanze sinic... 39 9.1 Přehled některých moţností omezení rozvoje cyanobakterií... 40 9.1.1 Eliminace přísunu ţivin z povodí... 40 9.1.2 Opatření na přítoku... 40 9.1.3 Opatření v nádrţi... 41 10 Závěr... 42 11 Literatura... 44 5

Abstrakt V této rešerši je uveden stručný přehled nejběţnějších typů sinic a jejich toxinů, které zahrnují poměrně rozsáhlou skupinu chemicky i toxikologicky odlišných látek. Taxonomické zařazení sinic z mikrobiologického hlediska cyanobakterií, z botanického hlediska oddělení cyanofyta, není dosud zcela jednotné. Práce popisuje stavbu buňky, základní mechanismy a projevy toxicity. Dále je obsaţen souhrn nejvyuţívanějších metod, jak cyanotoxiny detekovat a analyzovat. Jedná se převáţně o metody chromatografické, imunochemické a optické. Nejvíce pozornosti je věnováno toxicitě těch druhů sinic, které se mohou vyskytovat v našich vodách a legislativním prostředkům (normám a limitům) pro omezení zdravotních dopadů na populaci. Příčinou masivního rozvoje sinic je stále se zvyšující eutrofizace vod, proto se část práce také zabývá způsoby, jak tomuto neţádoucímu vývoji zabránit nebo ho alespoň zmírnit. Práce je doplněna vlastními mikrofotografiemi vzorků sinic, dokumentujícími stav vodních nádrţí v okolí Hradce Králové. Cílem bylo vytvořit základní přehled informací, který můţe být pouţit i pro další studium sinic a jimi produkovaných účinných látek, protoţe z farmaceutického hlediska dosud nebyla tomuto aktuálnímu a zajímavému tématu u nás věnována příliš velká pozornost. 6

1 Úvod a cíl práce Jak bude uvedeno, sinice jsou velmi rozšířenou skupinou jednoduchých prokaryontních organismů ţijících na nejrůznějších místech, především ve vodním prostředí. Vyskytují se jak v čistých horských oblastech, tak v odpadních a znečištěných vodách. Jsou schopny fotosyntetické asimilace. Produkují širokou škálu biologicky aktivních látek, kterými mohou ovlivňovat své okolí i sebe navzájem. Díky masovému výskytu tzv. vodního květu řas a sinic v důsledku eutrofizace vod se sinice v posledních letech dostaly do centra pozornosti veřejnosti i odborníků. Jde o velmi adaptabilní, významné a zároveň velmi problematické bakterie, které jsou schopny přeţívat v nepříznivých podmínkách. Proto se s nimi těţko bojuje. Pokud nejsou pod kontrolou, mohou způsobit zamoření pitných vod toxickými metabolity. Tento problém nabývá celosvětového měřítka, problematika cyanotoxinů je intenzivně studována, jde o rychle se rozvíjející vědní oblast, zaměřenou nejen na metody likvidace sinic, ale i na jejich vyuţívání. Jsou-li některé druhy sinic řízeně kultivovány, mohou být uţitečným zdrojem např. biologických pesticidů, cytostatik, virocidních látek apod. Přestoţe tedy jde o farmaceuticky významnou skupinu organizmů, nebyla dosud výzkumu sinic a jejich metabolitů věnována větší pozornost v rámci našich farmaceutických fakult. Hlavním cílem této rešeršní práce bylo shromáţdit základní informace o látkách produkovaných sinicemi a jejich analýze. Dále je tato práce zaměřena na mechanismy a projevy toxicity sinic. Cílem práce je příprava literárních podkladů pro vývoj nových, bezpečných, spolehlivých a jednoduchých metod stanovení nejběţnějších cyanotoxinů. Zdrojem informací pro tuto práci byla odborná literatura a internetové informační databáze Current Contents Connect (Web of Knowledge SM ), Science Direct. Pro vyhledávání byla nejčastěji volena klíčová slova: sinice, cyanobacteria, cyanotoxiny. Velmi dobrým zdrojem informací byly také internetové stránky (www.sinice.cz) a dostupné publikace českých vědeckých a zdravotnických institucí (Sdruţení Flos- Aquae, Státní zdravotní ústav), orientovaných na problematiku sinic v našich vodách. Informace pro rešeršní práci byly čerpány ze zdrojů publikovaných v letech 1967-2011. 7

2 Sinice cyanobakterie 2.1 Terminologie Termín sinice je tradiční český název. Pochází ze slova siný, coţ znamená modrý a stejný význam má i v řeckém překladu cyanos. Někdy se sinice nesprávně nazývají modrozelené řasy. V posledních letech je velmi hojně uţíván název cyanobakterie nebo cyanoprokaryota. Tato označení jsou terminologicky správná a v souladu s Mezinárodním bakteriologickým kódem. Třetím vhodným termínem v souladu s Mezinárodním kódem botanické nomenklatury (ICBN International Code of Botanical Nomenclature) jsou cyanofyta. Český název sinice je neutrální vzhledem k oběma kódům (1) (2) (5) (14). 2.2 Evoluce sinic Z hlediska evoluce se jedná o nejstarší a nejprimitivnější formy ţivota na Zemi, které se na naší planetě objevily jiţ v prekambriu před 3,5 miliardami let (13). Dominující skupinou organizmů se staly před 2 miliardami let. Podle nalezených fosilií se pravděpodobně velmi významně podílely na utváření kyslíkaté atmosféry Země. Za jejich předky jsou povaţovány anaerobní fotosyntetizující bakterie (chlorobakterie a purpurové bakterie) (1) (6) (7) (9) (10) (14). 2.3 Stavba sinic Podle stavby buňky jsou sinice bakterie. Buňka sinic postrádá jádro, chloroplasty i mitochondrie. Genetická informace je uloţena v buněčné struktuře zvané genofor. Molekula DNA je kruhová a v několika kopiích, neobsahuje histoproteiny. Na plazmatickou membránu je připojena pomocí RNA a bílkovin, a tímto spojením je dosaţeno přibliţného symetrického rozdělení DNA mezi dvě dceřiné buňky. Při buněčném dělení nevzniká dělící vřeténko. Buněčná stěna se skládá ze čtyř vrstev obsahující lipopolysacharidy a peptidoglykany murein a kyselinu diaminopimelovou. Na povrchu se nachází slizová vrstva často nápadně vybarvená karotenoidem. Mezi vrstvami byly objeveny tzv. 8

kontraktilní mikrofibrily zajišťující klouzavý pohyb. Plazmatická membrána, která se nachází pod povrchem stěny, je místem dýchacích enzymů a zřejmě se z ní odškrcují thylakoidy. Dále zabezpečuje aktivní transport iontů, exkreci látek a hraje důleţitou roli při dělení dceřiných buněk. Unikátní strukturní částí buněk sinic jsou plynové vezikuly shlukované do aerotopů. Jsou to válcovité struktury vyplněny směsí vzduchu a dusíku. Jejich funkcí je sníţit specifickou hmotnost buněk, a tak umoţnit buňkám sinic vznášení ve vodním sloupci. Dále jsou v buňce obsaţeny drobné útvary označované jako karboxyzómy. Mají tvar mnohostěnu a obsahují enzymy, které umoţňují fixaci oxidu uhličitého v Calvinově cyklu (1) (8) (12). Sinice se mohou vyskytovat ve formě jednotlivých buněk, vláknité stélky nebo kolonií různé velikosti a tvaru. U vláknitých sinic se kromě vegetativních buněk vyskytují heterocyty, které slouţí k fixaci molekulárního dusíku, a artrospory neboli akinety, které pomáhají překonat buňce nepříznivé podmínky (8) (14). Nejvýznamnější struktury z funkčního hlediska jsou thylakoidy, které plní funkci obdobnou chloroplastům (viz odstavec 2.3.1) Sinicový škrob, který je hlavní zásobní látkou, se podobá glykogenu. U sinic známe pouze nepohlavní rozmnoţování. Kokální cyanobakterie se mnoţí prostým zaškrcením a rozdělením na dvě dceřiné buňky (11). Vláknité sinice se rozmnoţují hormogoniemi rozpadem na několikabuněčné články, které odpadnou z mateřské buňky (15). 2.3.1 Thylakoidy Thylakoidy se nacházejí v cytoplazmě u okraje buňky. Membrána thylakoidů obsahuje fotosyntetická barviva - chlorofyl a, α- i β-karoten a xanthofyly (echinenon, myxoxanthofyl, zeaxanthin). Na povrchu thylakoidního váčku jsou drobné útvary fykobilizomy, obsahující barvivo fykobiliproteiny. Existují tři typy těchto barviv. Fykocyanin (Microcystis, Aphanizomenon, Anabaena) a allofykocyanin jsou modré barvy, fykoerythrin (Planktothrix rubescens) je červený a některým sinicím můţe chybět. Jejich funkcí je zachycovat světlo. Takto velmi efektivně umoţňují fotosyntézu i hluboko pod vodní hladinou, kde je minimální světlo. Poměr fotosyntetických pigmentů není stabilní a určuje zabarvení sinic. Barevný odstín je pro jednotlivé druhy 9

sinic příznačný, mění se podle sloţení světla a vlivem výţivy. Tento jev se označuje chromatická adaptace. Thylakoidy v podstatě plní funkci chloroplastů, umoţňují sinicím fotosyntézu (1) (8) (12) (13). 2.4 Taxonomické zařazení sinic Cyanobakterie jsou jednoduché organizmy o velikosti buněk většinou kolem 1 10 μm (3) (4). Některé druhy umoţňují fixovat dusík. Jsou schopny fotosyntézy. O sinice se podrobně zajímají a studují je nejen mikrobiologové ale i botanikové, kteří upřednostňují označení sinice, dle nové terminologie cyanoprokaryofyta či cyanofyta. Vzhledem k tomu, ţe sinice patří mezi gramnegativní bakterie, mikrobiologové preferují termín cyanobakterie (1) (9). Stavbou buněčné stěny se řadí do říše Prokaryot, kde vytváří jedno oddělení Cyanophyta, jednu třídu Cynophyceae a čtyři řády Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales, Stigonematales (10) (14). Dosud je známo asi 2000 druhů, 150 rodů sinic. Popsáno je jen 130 druhů. V rámci fylogeneze představují slepou vývojovou řadu. Předpokládá se však, ţe se sinice staly základem chloroplastů eukaryontních řas a rostlin (11) (19) (21). 2.4.1 Systém sinic Existuje několik moţností třídění sinic, pro tuto práci byl vybrán systém od A. Poulíčkové a J. Jurčáka (11). Očekává se, ţe v krátké době dojde k přepracování celého systému cyanobakterií na základě celkového (cytologického + fenotypového + molekulárního) vyhodnocení (1) (19). Říše: Prokaryota Oddělení: Cyanobacteria (Cyanophyta) Třída: Cyanophyceae Řád: Chroococcales Jednobuněčné sinice, ţijící samostatně nebo v koloniích, obklopených slizem. Nemají heterocyty ani artrospory. Tvar buněk je kulovitý, vejčitý. Rozmnoţují se příčným dělením v jedné, ve dvou, zřídka ve třech na sebe kolmých rovinách. 10

Rod: Gloeobacter Buňky zelené barvy bez thylakoidů. Fotosyntetická barviva jsou uloţena v plazmatické membráně. Rod: Synechococcus Sinice nemají slizovou vrstvu, patří sem sladkovodní i mořské druhy. Obsahují thylakoidy. Rod: Prochlorococcus Rod: Aphanocapsa (viz obrázek č.: 2) Rod: Microcystis (viz obrázek č.: 1 a 3) Sinice rodu Microcystis vytvářejí kulovité, oválné aţ nepravidelné kolonie obklopené podle druhu různě silnou vrstvou slizu. V letním období je běţnou součástí vodního květu mnoha vodních nádrţí České republiky. Produkují nebezpečné toxiny. Známe asi 10 druhů. Microcystis má kosmopolitní rozšíření. Obrázek č. 1 kolonie Microcystis sp., Sříbrný rybník, Hradec Králové (vzorek odebraný 14. 9. 2009, stabilizovaný Lugolovým roztokem viz odstavec 6.1). Foto: H. Studená, identifikace provedena podle (34); mikroskop OLYMPUS BX 41 11

Rod: Chamaesiphon Řád: Oscillatoriales Nevětvené trichomy nebo vlákna v rozplývajících se pochvách. Nemají heterocyty ani artrospory. Ţijí jednotlivě nebo v koloniích. U některých druhů byl pozorován drkavý nebo plíţivý pohyb. Rod: Arthrospira Rod: Oscillatoria Rod: Planktothrix Rod: Planktolyngbya (viz obr. č. 2) Vyskytuje se v teplotně stratifikovaných vodách ve střední vrstvě. 12

Obrázek č. 2 - a) stočená vlákna (pravděpodobně sinic rodu Planktolyngbya) b) nepravidelné shluky koloniálních sinic (pravděpodobně Aphanocapsa sp.), rybník Cikán, Hradec Králové (vzorek odebraný 5. 8. 2010). Foto: H. Studená, identifikace provedena podle (34) a (37) (vlastnosti a výskyt taxonů) Řád: Nostocales Vlákna jsou přímá nebo s nepravým větvením ve slizových pochvách, jednotlivě i v koloniích. Vytváří artrospory i heterocyty. Většina druhů má schopnost fixovat plynný dusík v anaerobních podmínkách. Rod: Anabaena 13

Vytváří přímá nevětvená nebo šroubovitě vinutá vlákna, obklopená řídkým slizem. Můţe tvořit propletené shluky. Výskyt v našich vodách je poměrně častý. Rod: Aphanizomenon (viz obrázek č.: 3) Během sezóny vytváří kolonie různě rozmístěné ve vodním sloupci (jako i Microcystis a Anabaena). Vlákna se ke konci zuţují a vytváří svazečky. Obrázek č. 3 a) kolonie Microcystis sp. b) pravděpodobně vlákna Aphanizomenon sp., rybník Biřička, Hradec Králové (vzorek odebraný 5. 8. 2010). Foto: H. Studená, identifikace podle (34) a (37) (vlastnosti a výskyt taxonů) Rod: Cylindrospermopsis V našich vodách je značně rozšířený. Tvoří jednoduchá vlákna. Velmi toxický je druh Cylindrospermopsis raciborskii. Rod: Gloeotrichia 14

Podobně jako Anabaena a Aphanizomenon se vyskytuje i ve vodách s nízkým obsahem rozpuštěného dusíku díky schopnosti vázat vzdušný dusík. Rod: Nodularia Podobá se druhům rodu Anabaena. Vyskytuje se v brakických vodách Baltského moře. Společně s druhy rodu Aphanizomenon vytváří vodní květ a produkují 20-30% biologicky dostupného dusíku. Rod: Nostoc Má nevětvená vlákna s heterocyty ponořená do ţlutavého či olivově zeleného slizu. Buňky tvoří řetízky. Rod: Rivularia Některé druhy jsou kalcifikovány a vytváří vápenaté krusty. Rod: Tolypothrix Nacházíme nepravé větvení. Řád: Stigonematales Vlákna i s několika řadami buněk a pravým větvením. Jsou přítomny jak heterocyty tak i artrospory. Často mají hnědavé zbarvení (8) (11) (14). Tabulka č. 1 Třída Cyanophyceae se čtyřmi řády a následujícími typickými znaky Řád Typ stélky Heterocyty Akinety Zástupci Chroococcales kokální (kulovitá) ne ne Microcystis, Chroococcus Oscillatoriales vláknitá nevětvená ne ne Planktothrix, Planktolyngbya, Oscillatoria, Spirulina Nostocales Nostoc, Anabaena, vláknitá nevětvená Aphanizomenon, nebo s nepravým ano ano Tolypothrix, větvením Gleotrichia Stigonematales vláknitá s pravým větvením ano ano Stigonema 15

2.5 Výskyt sinic Sinice osidlují po celém světě nejrůznější biotopy, především sladkovodní a mořské prostředí, a to jak tekoucí tak stojaté vody. Jsou součástí planktonních (volně se pohybující ve vodě nebo u hladiny) i bentických (přisedlé na dně) společenstev. Např. rod Microcystis se v průběhu roku můţe vyskytovat v obou formách (1). Sinice tvoří velkou část mořského planktonu. Vyskytují se v povrchových vrstvách půdy, kde mají důleţitou funkci při zachování cirkulace ţivin. Sinice se dále nalézají i na místech s nedostatkem ţivin, jako holé skály, sopečný prach, pouštní písek a kamení. Dokáţí přeţívat ve velmi extrémních podmínkách, coţ dokazuje i výskyt sinic v horských vřídlech, pramenech, arktických jezerech, sněhu a ledu (1). Jsou známé druhy sinic, které ţijí v symbióze s rostlinami i ţivočichy. Mohou existovat v širokém rozmezí teplot 2-74 C (16) (18) (19). Sezóna vodního květu sinic se odvíjí od klimatických podmínek dané oblasti. V mírných podnebných pásech jsou vodní květy sinic významné během pozdního léta a začátkem podzimu. Toto období můţe trvat 2-4 měsíce. V tropických a subtropických oblastech se sinice mohou objevovat téměř po celý rok (21). V posledních letech dochází ke zvýšenému výskytu a k rychlému rozvoji sinic prakticky po celém světě. Je to způsobeno procesem eutrofizace vod, kdy vlivem lidské činnosti dochází ke zvyšování přísunu ţivin do vodního prostředí. Zejména se jedná o zvýšené koncentrace dostupných forem fosforu a dusíku, na které sinice reagují masivním a intenzivním růstem a tvorbou vodního květu. To má negativní dopad na kvalitu vody a celý ekosystém. Zhoršují se moţnosti vyuţití vodních rezervoárů člověkem (zdroj pitné vody, rekreace,..) (1). 2.6 Legislativní opatření Podle naší legislativy se měří a zveřejňují údaje o přítomnosti sinic v koupacích nádrţích. V pětibodové škále je odstupňováno doporučené chování veřejnosti. Při vyšším výskytu sinic je vyhlášen zákaz koupání. Pro pitnou vodu je stanovena nejvyšší přípustná koncentrace microcystinu jako typické látky indikující případné nedokonalé odstranění produktů sinic v průběhu úpravy pitné vody. 16

Základní cestou k odstranění nebo alespoň sníţení nebezpečného výskytu sinic je radikální sníţení obsahu ţivin, především fosfátů ze všech vodních nádrţích. Lze k tomu dospět jednak omezením přísunu těchto látek, pocházejících hlavně z mycích a pracích prostředků a hnojiv, a jednak sníţením dostupnosti fosfátů obsaţených ve všech vodách a sedimentech (převedením na méně rozpustné sloučeniny) (1). 17

3 Látky produkované sinicemi 3.1 Cyanotoxiny Sinice produkují a následně uvolňují do svého okolí širokou paletu chemicky unikátních sekundárních metabolitů, tzv. cyanotoxinů. Většina z nich je velmi toxických nebo jinak biologicky aktivních. Pro člověka a jiné organismy mohou být velice nebezpečné. Dosud není přesně známo, proč sinice produkují tyto toxiny. Předpokládá se, ţe plní ochrannou funkci (17). Toxiny sinic jsou velmi stabilní látky a nelze je z vody odstranit klasickými procesy úpravy vody jako je flokulace, sedimentace, písková filtrace, chlorování či pouhým varem atd. (9) (21). Velmi obtíţně se při úpravě povrchových vod dosahuje hygienických limitů povolených pro pitnou vodu, např. 1 μg/l pro microcystin-lr dle (33). 3.2 Rozdělení cyanotoxinů Zařazení cyanotoxinů do přehledného systému je velice obtíţné. Často mívají smíšenou biologickou aktivitu. Nejběţnější rozdělení je na dvě kategorie, a to dle chemické struktury a podle působení toxinu (biodetekce). Po chemické stránce jde o peptidy, alkaloidy a lipopolysacharidy (1). 3.3 Účinky sinic Bylo zjištěno, ţe metabolity izolované ze sinic vykazují široké spektrum aktivit proti bakteriím, houbám, prvokům, řasám i savčím tkáním. V dnešní době je preferován modernější systém dělení, a to podle působení toxinu, který rozděluje cyanotoxiny na neurotoxiny, hepatotoxiny, cytotoxiny, dermatotoxiny, embryotoxiny, genotoxiny a mutageny, imunotoxiny a imunomodulátory a promotory nádorového bujení (tumor promoting factors). Podle počtu publikací největší pozornost vědců zaujímají hepatotoxiny a neurotoxiny. Byl ale také zjištěn pozitivní vliv na lidský organizmus. V případě rodu Nostoc můţe jít o protinádorový účinek (1) (20) (21). 18

V současnosti se výzkumy zaměřují především na sloučeniny, které mají určitý vliv na člověka nebo hospodářská zvířata, ať uţ jako jedy nebo farmaceuticky uţitečné látky. Sinice mají potenciál pro poskytování uţitečných farmakologických látek. Vědci spekulují a i některé výzkumy to částečně potvrzují, ţe by toxiny sinic mohly nalézt uplatnění v medicíně například jako léčiva proti rakovině (viz zmíněný rod Nostoc) (7) (17). Rody Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Microcystis, Nodularia aj. se řadí mezi nejvýznamnější producenty cyanotoxinů. Celosvětově nejčastějšími toxiny sinic jsou microcystin a nodularin (22). 3.4 Peptidy 3.4.1 Hepatotoxické cyklické peptidy Do této skupiny toxinů se řadí cyklický heptapeptid microcystin neboli cyanogynosin a cyklický pentapeptid nodularin. Nejčastěji se vyskytují ve sladkovodních nebo brakických vodách. Obsahují mimo jiné i atypické aminokyseliny. Jsou to stabilní, netěkavé a ve vodě dobře rozpustné látky s molekulární hmotností okolo 800 1100 Da (21) (22). Jejich hlavním účinkem je hepatotoxicita, degradace jaterních hepatocytů (10). Aţ na výjimky nemohou pronikat přímo přes lipidové membrány do buněk. Pro navození toxického účinku vyuţívají přenašeče, které jinak transportují esenciální látky a ţiviny (22). Microcystin Microcystin je produkován několika rody Anabaena (A. flos-aquae), Mycrocystis (M. aeruginosa, M. viridis, M. wesenbergii), Oscillatoria (O. agardhii, Planktothrix) i z řad rodu Nostoc. Obecná struktura je cyklo-(d-alanin-x-d-measp-z- Adda-D-glutamat-Mdha), kde X a Z jsou různé L-aminokyseliny. Obsahuje neobvyklou hydrofobní aminokyselinu Adda: (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl- 10-fenyldeka-4,6-dienoová kyselina) (21) (22). Rozlišujeme přes 60 různých variant microcystinů, například cyanogynosin LA, LR, YA, YZ, YM, RR atd. (písmenné zkratky označují aminokyseliny v polohách 2 a 4, například u microcystinu LR jde o leucin-l a arginin-r) (viz obrázek č.: 4) (1) (10) (21) (22). 19

Obr. č.: 4 Chemická struktura některých běţných microcystinů (21) Nejen vysoká stabilita ale i odolnost vůči rozkladu velmi ztěţuje jejich odstranění z pitné vody. Některé bakterie ţijící běţně ve vodě mají schopnost odbourávat microcystiny (23). Kromě akutních hepatotoxických účinků jsou genotoxické a také stimulují rozvoj karcinogeneze. Cyanobakterie mohou souběţně produkovat několik variant microcystinu. Microcystin se obvykle uvolňuje do vodního prostředí při zániku buněk (1). Nodularin Toxin nodularin byl poprvé izolován z Nodularia spumigena. Nachází se ve sladkých i mořských vodách (Baltské moře) a jeho výskyt stále stoupá. Jeho obecný vzorec je cyklo-(d-measp-larg-adda-d-glu-mdhb) (viz obrázek č.: 5). Toxicita i podobnost s microcystiny je téměř srovnatelná (1). 20

Obr. č. 5 Chemická struktura nodularinu (21) 3.5 Alkaloidy 3.5.1 Neurotoxické alkaloidy Do této skupiny zahrnujeme anatoxin a, anatoxin a(s), anatoxin b, homoanatoxin, saxitoxin, neosaxitoxin, aphantoxin 1-5. Nástup účinku je velice rychlý. U testovaných myší způsobují zástavu dechu do 3-30 minut. Do organizmu se mohou dostat přes gastrointestinální trakt nebo plícemi při vdechování (20). Anatoxin a (2-acetyl-9-azabicyklo(4.2,1)non-2-en) Anatoxin a je produkován cyanobakterií Anabaena flos-aquae. Jedná se o malou molekulu s dvěma heterocykly a nízkou molekulární hmotností. Je to látka dobře rozpustná ve vodě. Do těla můţe proniknout vdechnutím nebo přes kůţi. 21

Obr. č.: 6 Chemická struktura anatoxinu a (22) Anatoxin a(s) (2-amino-4,5.dihydro-1-[(hydroxymethoxyfosfinyl)oxy]-N,Ndimethyl-1H-imidazol-5-methanamin Jeho výskyt je ojedinělý. Prozatím byl detekován v Dánsku, Kanadě, USA a Skotsku. Způsobuje nadměrné slinění salivaci (proto označení S). Hlavním producentem tohoto toxinu je Anabaena flos-aquae a A. lemmermannii. Je to fosfátový ester cyklického N-hydroxyguaninu. Homoanatoxin je homologem anatoxinu a, který je izolován z Oscillatoria formosa. Liší se propionylovou skupinou na uhlíku C2 místo acetylové skupiny. Výskyt anatoxinů byl potvrzen v evropských vodách (Finsko, Itálie, Irsko, Německo, Skotsko), v Kanadě a v Japonsku. V České republice nejsou podrobně studovány, protoţe nebyly detekovány (22). Obr. č.: 7 Chemická struktura anatoxinu a(s) (22) 22

Obr. č.: 8 Chemická struktura homoanatoxinu (22) Saxitoxin Patří do skupiny karbamanových alkaloidů s nula aţ dvěma atomy síry. Byly nalezeny u Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii. Můţeme je rozdělit na saxitoxiny (bez síry), gonyatoxiny (obsahují jeden atom síry) a C-toxiny (se dvěma atomy síry). Působí jako blokátory sodíkových kanálků nervových buněk, sniţují tedy vstup sodíku do buňky. Člověk můţe být intoxikován po poţití kontaminovaného jídla, kontaminovanou pitnou vodou nebo při rekreaci u vody (22). Obr. č.: 9 - Obecná struktura saxitoxinu (22) 23

3.5.2 Cytotoxické alkaloidy Cylindrospermopsin V současné době velmi intenzivně studovaný toxin. Jedná se o polycyklický guanidinový alkaloid s jednou sulfoxylovou skupinou. Je produkován druhem Cylindrospermopsis raciborskii a Aphanizomenon ovalisporum. Tento toxin je blokátorem syntézy proteinů. V čisté formě postihuje převáţné játra. Surový extrakt podávaný myším způsoboval patologické příznaky u ledvin, sleziny, brzlíku i srdce. Byly izolovány tři formy demethoxycylindrospermopsin, deoxycylindrospermopsin a 7-epicylindrospermopsin. Tento toxin je dobře rozpustný ve vodě, stabilní ve tmě, při změně ph, odolává i varu. Je schopný absorbovat UV světlo (22). Má cytotoxické účinky a je to potenciální karcinogen. Cylindrospermopsin je na rozdíl od microcystinu v určité fázi růstu buněk transportován do jejich okolí (27). 3.5.3 Dermatotoxické alkaloidy Dermatotoxiny dráţdí kůţi, způsobují těţké dermatitidy. Jsou povaţovány za moţné promotory nádorů a aktivátorů proteinkináz C. Do této skupiny alkaloidů řadíme heterocyklické sloučeniny aplysiatoxiny (produkován Lyngbya, Oscillatoria) a modifikovaný cyklický dipeptid lyngbyatoxin nalezen u Lyngbya majuscula. Jsou produkované mořskými sinicemi (22). 3.5.4 Lipopolysacharidy dráţdivé toxiny Lipopolysacharidy byly poprvé izolovány ze sinic Anacystis nidulans. Jsou součástí vnějších membrán buněčné stěny gramnegativních bakterií, včetně sinic, kde tvoří s proteiny a fosfolipidy komplexy. U ţivočichů mohou vyvolávat dráţdivou nebo alergickou reakci. Jejich sloţení se odvíjí od rodu popř. druhu. Jak jiţ název napovídá, strukturně se jedná o komplexy polymerů sloţených z cukrů a lipidů. Při přemnoţení sinic se lipopolysacharidy nacházejí ve vodě ve vysokých koncentracích a mohou tak být významné po toxikologické stránce. Zatím není dostatek informací o přesné struktuře a hlavně efektech těchto látek (1) (22). 24

3.5.5 Neznámé bioaktivní sloučeniny v sinicích Neustále jsou objevovány další desítky nových cyanotoxinů. Převáţně se jedná o lineární a cyklické peptidy nebo o peptidy obsahující esterovou vazbu (depsipeptidy), ale i o jiné sloučeniny. Často se stává, ţe toxicita sinic nekoreluje s výsledky analýzy, tj. s obsahem známých cyanotoxinů. Můţe být ovlivněna doposud neznámými cyanotoxiny (1) (24) (26). 25

4 Mechanismy a projevy toxicity sinic U velké části cyanobakterií jsou toxiny z buněk vylučovány do okolí aţ po jejich smrti a následné lyzi. Proto se nedoporučuje, zejména ve fázi masivního rozvoje vodního květu, aplikace baktericidních a fungicidních přípravků, např. měďnatých solí. Zdánlivé vyčištění nádrţe můţe být doprovázeno výrazným zvýšením obsahu cyanotoxinů. 4.1 Mechanismus účinku microcystinu Nejčastějším toxinem sinic v České republice jsou microcystiny, zvláště forma microcystinu-lr, jehoţ LD 50 je 40-45 μg.kg -1 ţivé hmotnosti. Ostatní formy se vyskytují jen vzácně a v nízkých koncentracích. Microcystin je hlavní ukazatel znečištění pitné vody cyanotoxiny. Jsou velmi toxické. LD 50 po intraperitoneální injekci (i. p.) u myší se pohybuje v rozsahu 50-1200 μg.kg -1 ţivé váhy pro většinu variant microcystinu. Přípustná koncentrace microcystinu podle Světové zdravotnické organizace (WHO) je do 1 μg na 1 l vody. V naší legislativě platí stejná hodnota (1) (26). U obratlovců je microcystin kumulován hlavně v játrech. Po jeho vstupu do organismu je aktivně vychytáván z krve hepatocyty prostřednictvím specifických přenašečů (například přenašečem pro ţlučové kyseliny) (21). Dochází k nevratné inhibici proteinfosfatáz 1 a 2A, kdy vzniká silná kovalentní vazba na podjednotku serin/threonin fosfatáz. Tyto proteinfosfatázy se podílejí na regulačních dějích a při vnitrobuněčné signalizaci. Intoxikace microcystinem vzniká v důsledku nekontrolované fosforylace proteinů. Následkem toho dochází k destrukci jaterního parenchymu, histopatologickým změnám jaterní tkáně, hmotnost jater je 2-3x větší, cytoskeletární struktura hepatocytů se hroutí, vznikají nekrózy, edémy. Značnou roli v těchto procesech hraje atypická aminokyselina Adda, která má charakteristické absorbční spektrum v UV oblasti s maximem při 238 nm a je odpovědná za biologickou aktivitu. Změna v této oblasti spektra je provázena sníţením nebo úplným vymizením biologické aktivity. Při biotransformačních reakcích jsou produkovány konjugáty oxidovaných Adda dienů, glutathionové a cysteinové produkty. Tyto látky jsou z organismu vylučovány do 26

moči nebo ţluči. Výsledkem těchto změn je vnitřní krvácení jater, pokles krevního tlaku, hemodynamický šok, selhání srdce a smrt. Poškozené mohou být nejen játra, ale i ledviny, plíce a střeva. U zvířat i lidí byla prokázána akutní i chronická toxicita microcystinů. Pro většinu variant microcystinů se hodnoty LD 50 akutní toxicity po intraperitoneální injekci udávají v rozmezí 50-300 μg.kg -1 ţivé váhy a při orálním podáváním více neţ 5000 μg.kg -1. Ukázalo se, ţe chronická toxicita (dlouhodobá opakovaná expozice niţším dávkám) je daleko závaţnější neţ jednorázová expozice vyšší dávce. Microcystiny jsou pravděpodobně promotory nádorového bujení (tumor promoting factors). Uvaţuje se i o moţných neurotoxických efektech a moţnosti indukovat poškození DNA, tj. genotoxicitě (1) (21) (28) (29). 4.2 Toxicita nodularinu Nodularin (stejně jako microcystin) inhibuje enzymy odpovědné za fosforylaci proteinfosfatáz a to zejména 1 a 2A. Jeho hodnota LD 50 se pohybuje v rozpětí 50-2000 μg.kg -1. Stejně jako microcystin působí hepatotoxicky a je zde moţná nádorově promoční aktivita. Hlavním cílovým orgánem jsou opět játra (21). 4.3 Mechanismy účinku anatoxinů 4.3.1 Anatoxin a Anatoxin a a jeho analog homoanatoxin a byly podrobně studovány spíše v jiných zemích. V České republice dosud nebyly detekovány, a proto u nás nebyly zkoumány. Jedná se o malé molekuly, které jsou rychle absorbovány při orálním podání. Hodnota LD 50 u myši po i.p. se uvádí 375 μg.kg -1 ţivé hmotnosti. Anatoxin je silný postsynaptický neuromuskulární blokátor, nikotinový agonista, který se váţe na neuronální nikotinové receptory na nervosvalových ploténkách a způsobuje trvalou stimulaci, která vede k blokování dalších přenosů. Takové přenosy jsou nezbytné pro činnost kosterního svalstva, můţe dojít k ochrnutí končetin, ale i dýchacích svalů, a to vede k udušení. Dalšími klinickými příznaky je cyanóza, křeče. Smrt nastává během několika minut nebo několika hodin. 27

4.3.2 Homoanatoxin a Homoanatoxin je neuromuskulární blokátor způsobující zvýšený tok vápenatých iontů do cholinergních nervových zakončení. 4.3.3 Anatoxin a(s) Anatoxin a(s) je méně studovaným toxinem. Vyskytuje se jen velmi zřídka. Je inhibitorem acetylcholinesterázy v nervových spojích, narušuje správný přenos nervového vzruchu. Hodnota LD 50 u myší po aplikaci i.p. je asi 20 μg.kg -1 ţivé váhy. Působí pouze na periferiích. Jeho stálost a odolnost ovlivňuje teplota. Při 40 C se rychle degraduje (21) (30). 4.4 Mechanismus účinku cylindrospermopsinu Cylindrospermopsin ve své molekule obsahuje pyrimidinový kruh, který je zodpovědný za jeho toxicitu. Do buněk pravděpodobně proniká pomocí prosté difuze nebo póry. Jeho LD 50 u myši po i.p. aplikaci je 200 μg.kg -1 ţivé váhy. Při podání orální cestou je LD 50 6000 μg.kg -1. Blokuje syntézu proteinů vazbou na ribozomy nebo na proteiny, které se účastní translace. V játrech inhibuje syntézu glutathionu a omezuje tak schopnost detoxikace. Tento toxin má i genotoxické účinky. Jeho struktura s reaktivní sulfátovou skupinou se podobá nukleotidům, a proto můţe být pro tento toxin terčem i DNA. Prvními klinickými příznaky jsou selhání jater a ledvin, kde se cylindrospermopsin hromadí. Po orálním podání způsobuje gastroenteritidy a hepatitidu. Karcinogenita zatím nebyla jednoznačně potvrzena ani vyloučena (21). 4.5 Toxicita saxitoxinu Saxitoxiny znemoţňují přenos nervových vzruchů tím, ţe blokují sodíkové kanálky. To způsobuje ochrnutí svalů. LD 50 (myš, i.p.) je 10 μg.kg -1 ţivé váhy. Smrt nastává během pěti minut (21). 4.6 Mechanismus účinku lipopolysacharidů Po vstupu do organismu jsou lipopolysacharidy schopny vyvolat silnou imunitní reakci, která vede například ke zvýšení tělesné teploty, k průjmům nebo aţ 28

k multiorgánovému kolapsu. Lipopolysacharidy můţou poškozovat buňky jater, ledvin i srdce. Toxické účinky lipopolysacharidů cyanobakterií jsou však niţší neţ u lipopolysacharidů patogenních bakterií. Pokud dojde k přemnoţení sinic, stávají se lipopolysacharidy toxikologicky významné, protoţe se jejich koncentrace zvýší (21). Tabulka č. 2 Přehled základních informací o nejvýznamnějších cyanotoxinech (22) Toxin LD 50 (μg.kg -1 ) Microcystin 50-1200 Nodularin 50-2000 Toxicita hepatotoxicita, tumor promoting factor, embryotoxicita, genotoxicita hepatotoxicita, tumor promoting factor Anatoxin a 200-250 neurotoxicita Anatoxin a(s) 20 neurotoxicita Saxitoxiny 10 neurotoxicita Cylindrospermopsin 200 cytotoxicita Mechanismus účinku inhibice proteinfosfatáz 1 a 2A inhibice proteinfosfatáz 1 a 2A agonisté v nikotinových a acetylcholinových receptorech inhibitor acetylcholinesterázy blokace sodíkových kanálků blokace proteinové syntézy, kumulativní toxicita Cílový orgán u savců játra (ledviny, plíce, střeva) játra nervové synapse nervové synapse axony neuronů játra, ledviny,.. Lyngbyatoxin dermatotoxicita aktivace proteinkinázy C kůţe, trávicí systém Lipopolysacharidy dráţdivé účinky iritant exponované tkáně 29

Cyanotoxiny sice nepatří k nejtoxičtějším látkám (daleko toxičtější jsou botulin produkovaný bakterií Clostridium botulinum nebo tetanotoxin izolovaný z Clostridium tetani), ale například hodnota LD 50 anatoxinu je stejná jako jed z kobry Naja naja, jejíţ uštknutí je pro člověka smrtelné. U nás nejběţnějším cyanotoxinem je microcystin LR, který je asi desetkrát toxičtější neţ kurare a čtyřicetkrát nebezpečnější neţ strychnin z rostliny Strychnos nux-vomica (1) (14). 30

5 Dokumentované případy poškození zdraví Informace o poškození zdraví nalézáme v několika zdrojích. Jsou to epidemiologické a toxikologické studie, třetím typem jsou tzv. informace o náhodných otravách zvířat (1). 5.1 Epidemiologické důkazy Jejich základem je studium lidských populací, u kterých se objevily příznaky otrav nebo poškození zdraví následkem působení cyanotoxinů v pitné vodě, v koupacích nádrţích atd. Sbírají se informace o expozici, počtu organismů, typu a koncentraci toxinů a vyvozují se určité spojitosti mezi toxicitou cyanotoxinů a vlivy na zdraví lidí. Tyto zdroje informací jsou většinou studovány retrospektivně. Vyskytly se případy, kdy došlo k poškození zdraví cyanotoxiny obsaţenými v pitné vodě. Vlivem algicidního zásahu, úpravy a čištění vody došlo k uvolnění toxinů. V roce 1931 vodní květy Microcystis v řece Ohio a Potomac intoxikovaly kolem 5000-8000 lidí, přičemţ postiţení trpěli převáţně gastroenteritidami. O několik let později se stejný případ vyskytl v Zimbabwe. Po algicidním zásahu v Austrálii onemocnělo střevní chřipkou přes 140 obyvatel. Klinickými příznaky byla malátnost, nechutenství, nauzea, bolest hlavy, zvětšená játra, průjmy, dehydratace. Následné rozbory krve a moče prokázaly poškození ledvin a zvýšené hladiny jaterních enzymů. Další případy otravy cyanotoxiny byly zaznamenány po expozici při plavání či vodních sportech a zvláštním případem byla intravenózní expozice toxiny v jednom brazilském hemodialyzačním centru. Asi 130 pacientů trpělo poruchou zraku, nevolností, svalovou slabostí. U 100 z nich došlo k selhání jater a 56 pacientů intoxikaci nepřeţilo. U pacientů, kteří byli vystaveni toxinům při plavání, se objevovaly alergické koţní reakce, dermatitidy i systémové poruchy při náhodném polknutí vody. V roce 1995 probíhala v Austrálii studie, která zahrnula přes 800 účastníků. Zjistila zvýšenou frekvenci dermatitid, vředů v ústech, horeček, podráţdění očí, uší a kůţe, průjmů, zvracení během 2-7 dnů po intoxikaci při koupání. Intenzita a četnost příznaků se zvyšovala v závislosti na době koupání a míře přítomnosti vodního květu (1). 31

5.2 Toxikologické studie Tyto studie vyuţívají různé druhy zvířat a provádí se za přesně definovaných a přísně kontrolovaných podmínek. Informují o mechanismech účinků toxinů, srovnávají jejich toxicitu. Jak jiţ bylo řečeno, nejvíce pozornosti je věnováno microcystinu, který představuje riziko jak z hlediska akutní, tak i chronické expozice (viz odstavec 4.1) (1). 32

6 Metody hodnocení bezpečnosti vod Od roku 2000 se vědci snaţí pracovat na metodice, jejímţ cílem je sjednotit postupy při odběrech, zpracování a interpretaci výsledků ze vzorků získaných z různých koupacích a vodárenských nádrţí atd. Jiţ v roce 2001 byly Státním zdravotním ústavem (SZÚ) publikované první návrhy a v dnešní době vedle metodických doporučení SZÚ existují také odvětvové technické normy vodního hospodářství (TNV), které jsou stále aktualizovány (37). 6.1 Odběr vzorků Podle České technické normy (ČSN) 75 7717 musí odběr vzorku probíhat v místě, kde je hloubka minimálně 1 m. Pro koupací nádrţe je vhodná doba odběru stanovena mezi 6. a 11. hodinou ve čtrnáctidenních intervalech. V případě zvýšeného výskytu sinic nad 20 000 buněk/ml se provádí hodnocení v pěti aţ sedmidenních intervalech. U vodárenských nádrţí se odběry provádí jednou za 7 dní. Vzorky jsou získány trubkovým vzorkovačem z horizontu 0-30 cm. Z jednoho odběrového místa se odeberou nejméně 3 vzorky. Do laboratoře jsou dopravovány ve tmě v chladicím boxu o teplotě 1 5 C. Ke zpracování by mělo dojít do 24h po odebrání. Vzorky vláknitých sinic a vzorky pro eventuální pozdější kontrolní hodnocení se stabilizují Lugolovým činidlem (roztok elementárního jodu a jodidu draselného ve vodě). Při odběru je nutné vyplnit protokol, kde se zaznamenává počasí při odběru (zejména směr větru a oblačnost), počet vzorků a na stupnici od 0 do 3 se posuzuje vizuální výskyt sinic, kde 3. stupeň značí masový výskyt sinic (1). 6.2 Laboratorní příprava vzorků pro mikroskopické hodnocení K laboratornímu zpracování dochází ve čtyřech krocích kvantitativní rozbor, zahuštění vzorku, dezintegrace kolonií a počítání v komůrce. Zahuštění a dezintegrace se nemusí provádět ve všech případech. Nejprve vizuálně pozorujeme, zda jsou přítomny kolonie či zákal. Následně provedeme kvantitativní rozbor. K tomu je někdy zapotřebí zahuštění membránovou 33

filtrací pod tlakem nebo odstředěním vzorku. Při tomto kroku můţe docházet ke ztrátám, proto k němu přistupujeme jen v případech, kdy je to nutné. Následuje dezintegrace, kterou provádíme pomocí několika kapek 0,1M KOH v kónické zkumavce a opakovaným nasávání automatické pipety. Vlivem alkalického prostředí a mechanického působení dojde k rozdělení kolonií na jednotlivá vlákna nebo buňky a k destrukci aerotopů. Tím jednotlivé buňky klesnou na mříţku počítací komůrky. Tento krok se pouţívá v případě, kdy jsou ve vzorku přítomny cyanobakterie tvořící kolonie například Microcystis nebo Anabaena. Protoţe některé sinice snadno lyzují, je vhodné tyto vzorky, kde dominují vláknité sinice, stabilizovat Lugolovým činidlem (viz odstavec 6.1). Buňky lépe sedimentují a tím se i ulehčuje počítání v komůrce. U kokálních a vláknitých sinic rodu Anabaena, Anabaenopsis a Microcystis přímo počítáme jednotlivé buňky. U vláknitých sinic rodu Planktothrix nebo Aphanizomenon stanovujeme délku vláken. Výsledkem je vyjádření abundance cyanobakterií jako počtu buněk v 1 ml (nebo objemová abundance v mm 3 /l). U sinic, kde se měří délka vláken, se musí délka přepočítat na buňky. Pro všechny vláknité sinice byla zvolena standardní délka buňky 5 μm. Tímto způsobem nezjistíme přesný počet buněk, ale pro hodnocení abundance sinic v koupacích nádrţích je to dostačující (1) (31). 34

7 Analýza cyanotoxinů Existuje mnoho metod a technik jak kvantifikovat cyanotoxiny, ale ne všechny jsou vhodné, jednoduché na provedení a finančně i časově nenáročné. Je důleţité vybrat správnou metodu podle typu toxinu, který chceme studovat. Analýza cyanotoxinů můţe probíhat několika základními instrumentálními technikami. Nejčastější metody jsou chromatografické, optické nebo metoda ELISA (1). 7.1 Chromatografické metody Tyto techniky jsou zaloţeny na fyzikálně-chemických vlastnostech stanovovaných látek (molekulární hmotnost, charakter funkčních skupin atd.). V současné době je v praxi pro stanovení microcystinů nejvíce vyuţívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ve spojení s UV, PDA (PhotoDiode detectors) nebo hmotnostním detektorem a plynová chromatografie (GC) s plamenovým nebo také s hmotnostním detektorem. K detekci microcystinů byla vyuţita i tenkovrstvá chromatografie (TLC). Vedle chromatografických metod byla pouţita kapilární zónová elektroforéza. Analýzám předchází extrakční a přečišťovací postupy, které zlepšují citlivost a selektivitu metod. Vzorek se nejprve přefiltruje. Filtrát i biomasa z filtru se extrahují odděleně na pevné fázi (SPE). Extrakce na pevné fázi je základem stanovení microcystinu dle ČSN ISO 20179. Vyuţívá se SPE kolonek naplněných předepsaným typem sorbentu (C-18) a zakoncentrované eluované cytotoxiny se analyzují metodou HPLC, např. na koloně C-18, s mobilní fází acetonitril/0,05% vodný roztok TFA s detekcí pomocí detektorů (UV-VIS, PDA, DAD, fluorescenční detektor atd.) (33). Byla publikována celá řada dalších metod HPLC stanovení microcystinů, některé firmy doporučují své separační techniky a zařízení, např. (36) aj. Jiným způsobem přečištění jsou metody, které vyuţívají gelové kolony s definovanými póry a umoţňují oddělení sloţek ze směsi na základě molekulové hmotnosti (33). 35

7.2 Imunochemická analýza Je zaloţena na detekci látek (v tomto případě toxinů) pomocí specifických protilátek, které jsou produkovány experimentálními zvířaty po imunizaci příslušným typem cyanotoxinu. Tyto metody jsou velmi vyuţívány například pro stanovení microcystinu. Protilátky proti microcystinům lze komerčně získávat z různých zdrojů. Například polyklonální protilátky jsou získávány imunizací velkých zvířat, kdy těmto zvířatům je opakovaně podávána taková dávka, která nevyvolává toxický účinek. Po úspěšné imunizaci se zvířeti odebere sérum obsahující protilátky proti původnímu imunogenu. Dalším zdrojem je zisk monoklonální protilátky z myšího séra. Tyto protilátky jsou izolované z jediného klonu buněk na rozdíl od polyklonálních protilátek. Nejběţnější imunochemickou metodou je tzv. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Principem této metody je kompetice o vazbu na specifickou protilátku mezi neznámým cyanotoxinem ve vzorku a známým přídavkem značeného cyanotoxinu. Ke značení se nejčastěji vyuţívá enzym křenová peroxidáza (HRP horseradish peroxidase). Při enzymatické reakci s HPR dojde k navázání značeného microcystinu na specifickou protilátku. Výsledkem je vznik barevného produktu, ze kterého na základě absorbance lze určit koncentraci cyanotoxinu ve vzorku. Intenzita barevného produktu odpovídá mnoţství enzymu a současně mnoţství navázaných označených cyanotoxinů. Výhodou ELISA je rychlost stanovení. Lze detekovat látky s nízkými detekčními limity. Nevýhodou je neschopnost rozlišit jednotlivé varianty microcystinů a negativní vliv matrice při vazbě toxinu na protilátku, kdy můţe docházet k neenzymatické přeměně substrátu nebo jeho přeměna můţe být inhibována. Tak mohou vznikat falešně pozitivní i negativní výsledky. 7.3 Optické techniky Do těchto technik se řadí tradiční mikroskopické analýzy, které sice nedokáţí určit toxické a netoxické formy sinic, ale zato umoţňují identifikovat buňky cyanobakterií a informují o počtu buněk. 36

Pro odhad biomasy sinic můţeme vyuţít metody dálkového průzkumu zemského povrchu, které probíhají in situ. Jedná se o metodu AVHRR (Advanced Very High Resolution Radiometer), jejíţ podstatou je fotografování zemského povrchu pomocí satelitů. Metoda je vhodná pro sledování velkých vodních ploch, kde dochází k masivnímu rozvoji vodních květů sinic. Tyto snímky lze hodnotit v průběhu jedné sezóny i víc let nebo zpětně. Nevýhodou této metody je malé rozlišení a neschopnost rozlišit jednotlivé druhy sinic. Další metodou dálkového průzkumu je LIDAR (Light Detection and Ranging). Tento průzkum probíhá z letadla, kde je umístěn zdroj laserového paprsku, který způsobuje excitaci fotosyntetických pigmentů fytoplanktonu a následně se snímá výsledné emisní spektrum. Vyuţívá se tedy fluorescence pigmentů fytoplanktonu a tím je lze odlišit od jiných látek rozpuštěných ve vodě. Prostřednictvím této metody můţeme také rozlišit jednotlivé druhy fytoplanktonu. 37

8 Vývoj a mezinárodní srovnání obsahu cyanotoxinů ve vodách V září roku 2008 se v České republice uskutečnilo první kolo mezilaboratorních zkoušek analýz microcystinů v programu zkoušení způsobilosti (PZZ) laboratoří zabývajících se stanovováním cyanotoxinů. Díky tomuto programu si laboratoře mohou ověřit kvalitu svých výsledků. Na organizaci se podílel Státní zdravotní ústav (SZÚ) ve spolupráci s Centrem pro cyanobakterie a jejich toxiny (CCT). O rok později se tyto zkoušky opakovaly. Zatím se obou kol PPZ účastnilo vţdy jen 8 laboratoří. Sedm laboratoří bylo z České republiky a jedna ze Slovenska. Přípravu vzorků vţdy obstarávalo pracoviště CCT, které má v České republice největší zkušenosti s analýzou cyanotoxinů. V obou ročnících byly připraveny celkem tři vzorky. Ve dvou se stanovovaly rozpuštěné microcystiny a v jednom microcystin v biomase sinic. Stanovováním cyanotoxinů se v České republice zabývá zatím velmi málo laboratoří, tato oblast je teprve ve vývoji. Rozdíly ve výsledcích mezi účastníky sice nebyly řádové, přesto nebyly uspokojivé. V druhém kole došlo u laboratoří k mírnému zlepšení. Další kolo PZZ proběhlo na konci roku 2010. Výsledky z těchto analýz v době zpracování této práce zatím nebyly zveřejněny. Bohuţel ani v zahraničí není mnoho příleţitostí k účasti v porovnávacích mezilaboratorních zkouškách stanovování cyanotoxinů. Informace o takových programech je často těţké dohledat, protoţe nemusí být dostupné prostřednictvím mezinárodních databází. Proto se získané výsledky někdy porovnávají s publikovanými jednorázovými studiemi (32). 38

9 Prevence expanze sinic Jednou z hlavních příčin zvýšené produkce sinic je tzv. proces eutrofizace, kdy dochází ke zvýšenému přísunu ţivin do vodního prostředí a to zejména fosforu a dusíku. Tento proces můţeme rozdělit na antropogenní, který je ovlivněn lidskou činností (např. splaškovými vodami, hnojením polí atd.) a na přirozenou, kdy k nárůstu ţivin dochází přírodními procesy vlivem přirozeného vývoje vodního ekosystému. Dalšími faktory, které vznikají zejména ex post a přispívají k rozvoji sinic, jsou například zadrţování vody, změna výšky vodního sloupce, oteplování vody atd. Fosfor je v hydrosféře zastoupen v malém mnoţství na rozdíl od jiných prvků (např. C, H, O, N, S). Nevytváří plynné sloučeniny a je uloţen na dně vod v sedimentech. Hlavním přírodním zdrojem fosforu jsou minerály zemského povrchu, ze kterých se při zvětrávání v malém mnoţství uvolňuje. Akumuluje se v půdách, kde je buď odčerpáván suchozemskými organismy, nebo se vyplavuje do povrchových i podzemních vod. Fosfor se do ekosystému dostává i z vnějších zdrojů, jako jsou prachové částice v ovzduší, například popílek ze spalování tuhých paliv, prach ze sopečné činnosti, větrná eroze zemského povrchu atd. Stejně jako jiné prvky se fosfor účastní přírodního koloběhu. A právě člověk v důsledku vyuţívání půdy, vypouštění komunálních a průmyslových odpadů přispívá k nestabilitě tohoto koloběhu a způsobuje zvyšování koncentrace fosforu v prostředí. Masový rozvoj sinic začíná být v dnešní době celosvětovým problémem. Proto se vědci snaţí zjistit příčiny tohoto vývoj a také hledají způsoby, jak mu zamezit nebo ho alespoň eliminovat. Je důleţité zdůraznit, ţe k tomu, aby byl omezen rozvoj vodního květu, nestačí eliminovat jen jeden faktor ovlivňující rozvoj cyanobakterií. Musí jít vţdy o souhrn opatření, případně jejich kombinaci a optimalizaci šitou na míru dané vodní nádrţi a povodí, protoţe kaţdý vodní systém je originální. Neznamená to ale, ţe neexistují účinné metody. Po celém světě je jich známa celá řada. Dělí se na opatření v povodí nad nádrţí a v nádrţi samotné. Aby projekt na obnovu rovnováhy fytoplanktonu, eliminaci produkce sinic a revitalizaci eutrofizovaného povodí byl úspěšný, musí začínat analýzou stavu povodí a nádrţe (1). 39

9.1 Přehled některých moţností omezení rozvoje cyanobakterií Vodní květ by sice mohl být degradován například algicidními prostředky, ale tento velmi drastický způsob je jen dočasný (2-3 týdny) a při neodborném zacházení velmi nebezpečný pro stabilitu vodního ekosystému (1). Navíc můţe při algicidním zásahu dojít k uvolnění cyanotoxinů z odumírajících buněk sinic. Mezi pouţívané algicidní látky řadíme např. kvarterní amoniové soli, herbicidy, soli některých kovů (síran měďnatý nebo zinečnatý atd.), oxidanty (peroxid, ftalocyaniny atd.) nebo byla testována i antibiotika. 9.1.1 Eliminace přísunu ţivin z povodí Zdroje ţivin můţeme rozdělit na plošné a bodové. Do plošných řadíme odnos ţivin z půdy. Obecným postupem jak zlepšit zadrţování vody a ţivin můţe být revitalizace vodních toků, obnova břehových porostů, obnovení mokřadů nebo ke zlepšení můţe přispět změna vyuţívání zemědělské půdy či způsobu hnojení. Bodovými zdroji jsou zejména výpustě odpadních vod. Takto uvolněný fosfor v současnosti představuje jednu třetinu celkového obsahu fosforu. V tomto případě má smysl z hlediska sniţování fosforu stavba nových čistíren, zavedení dalšího stupně čištění eliminující fosfor, čištění vody spíše v místě vzniku a zavedení bezfosfátových pracích a mycích prostředků. Nová evropská legislativa předepisuje u větších sídel zařazení třetího a čtvrtého stupně čištění odpadních vod, zaměřeného zejména na sníţení celkového obsahu dusíku a fosforu (nařízení vlády č. 229/2007 Sb.) (1). 9.1.2 Opatření na přítoku Další moţností, jak zredukovat obsah ţivin, jsou opatření na přítoku před vstupem do nádrţe. Takovou funkci splňují tzv. přednádrţe. Před hlavní nádrţí je vybudována menší nádrţ, která je schopna zadrţet vodu na několik dní. K zadrţení fosforu dochází biochemickou přeměnou a následnou sedimentací. Aby byla eliminace úspěšná, musí přednádrţe splňovat vhodné parametry konstrukce, designu, doby zadrţení, vstupu 40