MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2010 VOJTĚCH HUDZIECZEK
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Testování rostlin na virovou rezistenci Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Pavel Hanáček, Ph.D. Vypracoval: Vojtěch Hudzieczek Brno 2010
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Testování rostlin na virovou rezistenci vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.
PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěl srdečně poděkovat především Petru Smýkalovi, mému školitelispecialistovi, bez jehož vedení, cenných rad, připomínek a především lidského přístupu by tato práce nikdy nemohla vzniknout. Dále bych chtěl poděkovat svému školiteli Pavlu Hanáčkovi a pracovníkům Laboratoře biochemie a molekulární genetiky v Agritecu Šumperk za vřelé jednání s mojí osobou. V neposlední řadě chci poděkovat svým rodičům za to, že mi umožnili studovat na vysoké škole a paní Božské, že to se mnou (nejen) při psaní diplomky vydržela. Závěr patří mistrům, a proto bych zde rád poděkoval kolektivu studentů oboru rostlinolékařství za pět krásných let strávených toho času na MZLU. Práce vznikla za podpory projektu QI91A229 - Konvenční a molekulárně-genetické přístupy při tvorbě luskovin rezistentních vůči virovým a houbovým chorobám a hmyzím škůdcům. (2009-2013, MZE/QI)
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ATP - adenosintrifosfát BAC - bacterial artificial chromosome BYMV - Bean yellow mosaic virus CI (cylindrical inclusion) - protein kódovaný virem ClYVV - Clover yellow vein virus CP (coat protein) - plášťový protein GTP - guanosintrifosfát GDP - guanosindifosfát GDS (gel documentation system) - gel dokumentační systém DNA (deoxyribonucleic acid) - deoxyribonukleová kyselina cdna (complementary DNA) komplementární DNA dsdna (double-stranded DNA) dvouvláknová DNA ssdna (single-stranded DNA) jednovláknová DNA T-DNA (transferred DNA) prenášená DNA EDTA (ethylenediaminetetraacetate) - ethylendiamintetraoctová kyselina eif - eukaryotní iniciační translační faktor eif4e(iso) - isoforma eukaryotního iniciačního translačního faktoru 4E ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) - metoda detekce imunoenzymatickou reakcí EVIGEZ - evidence genových zdrojů v ČR HC-Pro (helper component protease) - pomocný komponent proteázy JIC - John Innes Centre LB - lysogeny broth (médium) LG (linking group) - vazebná skupina MAS (marker assisted selection) - markery asistovaná selekce NCBI - National center for biotechnology information NIaPro - (nuclear inclusion a proteinase) - virová proteáza NIb (nuclear inclusion b) - virový protein ORF (open read frame) - otevřený čtecí rámec P1-4 - označení patotypů Pea seed-borne mosaic virus, P1 a P3 také proteiny potyvirů
PABP (polya binding protein) - protein vážící se na polya konec PAP (poly-a-polymerase) - polya polymeráza PCR - (polymerase chain reaction) polymerázová řetězová reakce PEMV - Pea enation mosaic virus PSbMV - Pea seed-borne mosaic virus PTGS (post-transcriptional gene silencing) post-transkripční umlčení genu PVIP (potyvirus VPg-interacting protein) - rostlinný protein interagující s proteinem viru PVY - Potato virus Y RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) - PCR metoda amplifikace konců cdna RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) RNA dependentní RNA polymeráza RISC (RNA-induced silencing complex) komplex umlčující geny indukovaný RNA RNA (ribonucleic acid) - ribonukleová kyselina RNAi RNA interference dsrna (double-stranded RNA) dvouvláknová RNA mrna (messenger RNA) mediátorová RNA sirna (small-interfering RNA) malá interferující RNA ssrna (single-stranded RNA) jednovláknová RNA trna (transfer RNA) transferová RNA sbm-1/sbm-2 - označení alel rezistence k Pea seed-borne mosaic virus SOB - super optimal broth (médium) SOC - super optimal broth with catabolite repression (médium) STS (sequence tagged site) - krátká cca 200-500bp dlouhá sekvence unikátní v genomu TAE (Tris-acetate-EDTA) - pufr obsahující TRIS bázi, kyselinu octovou a EDTA TBE (Tris-boratic-EDTA) - pufr obsahující TRIS bázi, kyselinu bóritou a EDTA TEV - Tobacco etch virus TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane) - Tris(hydroxymethyl)aminomethan TMV - Tobacco mosaic virus TSWV - Tomato spotted wilt virus USDA - United States Department of Agriculture UTR (untranslated region) - netranslatovaná oblast VPg (viral protein genome-linked) - protein potyvirů kovaletně vázaný na RNA
ABSTRAKT Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV) patří v současné době mezi nejčastěji se vyskytující virové patogeny, způsobující vážné škody na porostech hrachu setého (Pisum sativum L.). Těmto škodám lze snadno předejít pěstováním rezistentních odrůd. Avšak spolehlivé markery rezistence zatím chybí a tak je šlechtění takových odrůd velmi náročné. Původně popsané lokusy sbm-1 (LG VI) a sbm-2 (LG II), obsahující shluky recesivních genů, zprostředkujících rezistenci k několika virovým patogenům rodu Potyvirus (včetně PSbMV), byly nedjříve v nedávné době zjištěny v těsné blízkosti eif4e resp. eif4e(iso). Později byl lokus sbm-1 identifikován jako eif4e gen a předpokládá se, že sbm-2 odpovídá eif4e(iso) genu. V této práci bylo podrobeno sekvenační analýze eif4e(iso) genu celkem 15 položek vybraných hrachu, které vykazovaly buď sensitivitu (Sbm-2) nebo rezistenci (sbm-2) k patotypu P2 PSbMV. Byl získán celkový genomový fragment eif4e(iso), odvozena proteinová sekvence, avšak nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi alelami rezistentních či sensitivních genotypů. Klíčová slova: hrách, Pea seed-borne mosaiv virus, eif4e(iso), rezistence, sbm-2, virózy ABSTRACT Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV) is currently one of the most frequent viral pathogen occuring and causing losses on pea (Pisum sativum L.). This losses can be easily prevented by growing resistant cultivars. However, reliable resistance markers are still lacking thus the breeding of such cultivars is difficult. Historically reported loci sbm-1 (LG VI) and sbm-2 (LG II), containing clusters of recesive genes that mediate resistance to several viral pathogens from genus Potyviridae including PSbMV, had been found in close linkage to eif4e and eif4e(iso). Later it was shown that locus sbm-1 correspond to eif4e gene and suggested that sbm-2 could be eif4e(iso). In this work, it was analyzed 15 selected pea accessions which exhibit either sensitivity (Sbm-2) or resistance (sbm-2) to P2 pathotype of PSbMV. Full genomic fragments of pea eif4e(iso) were obtained, protein sequences were deduced, however no differences between resistant and sensitive genotypes were observed. Klíčová slova: Pea seed-borne mosaiv virus, eif4e(iso), resistance, sbm-2, pea, viral diseases
1 ÚVOD 12 2 CÍL PRÁCE 13 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 14 3.1 Virové patogeny rostlin (Rostlinné viry) 14 3.1.1 Genetická informace viru 15 3.1.2 Životní cyklus virů 16 3.1.2.1 Množení patogena v rostlinných pletivech 16 3.1.2.2 Přenos virů mezi rostlinami 17 3.1.3 Ochrana plodin před virózami 18 3.2 Molekulární mechanismy rezistence k virovým patogenům 20 3.2.1 Buněčná rezistence 20 3.2.2 Rezistence k šíření viru mezi buňkami 22 3.2.3 Rezistence k šíření viru vaskulárními pletivy 24 3.2.4 Transgenní rezistence k virovým patogenům 25 3.3 Pea seed-borne mosaic virus 26 3.3.1 Obecná charakteristika 26 3.3.2 Genom a replikace PSbMV 26 3.3.3 Šíření v rostlině 28 3.3.4 Přenos PSbMV 29 3.3.5 Hostitelské rostliny 30 3.3.6 Symptomy PSbMV 30 3.4 Rezistence k PSbMV 32 3.4.1 Patotypy PSbMV a geny rezistence 32 3.4.2 Iniciace translace u rostlin 34 3.4.3 Molekulární mechanismus rezistence k PSbMV 36 4 MATERIÁL A METODIKA 38 4.1 Materiál 38 4.1.1 Rostlinný materiál 38
4.1.2 Roztoky a média 39 4.2 Metodika 41 4.2.1 Izolace genomové DNA 41 4.2.2 Agarózová elektroforéza 41 4.2.3 PCR amplifikace fragmentů eif4e(iso) genu 42 4.2.4 Purifikace PCR produktů 44 4.2.5 Klonování PCR produktů 44 4.2.5.1 Ligace 44 4.2.5.2 Transformace elektrokompetentních buněk E. coli 46 4.2.5.3 Výsev E. coli na selekční médium 46 4.2.5.4 Screening kolonií E. coli 46 4.2.6 Izolace plazmidů z rekombinantních E. coli 48 4.2.7 Sekvenování 48 4.2.8 Bioinformatická analýza DNA sekvencí 49 5 VÝSLEDKY 50 5.1 Izolace genomové DNA 50 5.2 PCR Amplifikace fragmentů eif4e(iso) 51 5.3 Purifikace PCR produktů 53 5.4 Klonování PCR produktů 55 5.5 Izolace plazmidů 58 5.6 Sekvenace 58 6 DISKUZE 62 7 ZÁVĚR 66 8 POUŽITÁ LITERATURA 67 SEZNAM OBRÁZKŮ 75 SEZNAM TABULEK 76 PŘÍLOHY 77
1 ÚVOD Nové poznatky z oblasti rostlinné biologie se projevují také ve zpřesnění poznatků o genetice zemědělských plodin. Přesto však i v případě znalosti genů podmiňujících agronomické znaky, je potřeba prostudovat genetickou variabilitu daného genu na širším spektru genotypů. Klasické šlechtění spočívá v křížení vybraných genotypů a následného výběru žádoucích genotypů, tak aby splňovaly požadavky na výnos, kvalitu, odolnost k chorobám a škůdcům. Toto vše vyžaduje rozsáhlé a časově náročné testování množství rostlin. Využití molekulárních markerů v procesu tzv. marker-assisted selection (MAS), by vedlo k výraznému zrychlení a zpřesnění této práce. Virová mozaika hrachu přenosná semenem (Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV) patřící do rodu Potyvirus, čeledi Potyviridae, způsobuje závažné ztráty kvality a výnosu mnoha luskovin, včetně ekonomicky významných jako je bob, čočka, cizrna a hrách. Choroba je přenášena prostřednictvím hmyzích vektorů, mšic a také infikovanými semeny. Nejúčinnějším nástrojem pro omezení výskytu je využití rezistentních genotypů, které již byly v minulosti v genových kolekcích identifikovány a jsou dnes využívány při šlechtění. V případě rezistence k PSbMV viru byly identifikovány 2 clustery recesivních genů, nacházejících se na LG IV a LG II (linkage group-chromosomech). Dále bylo prokázáno, že v případě lokusu sbm-1 se jedná o gen kódující eukaryotní translační iniciační faktor 4E (eif4e), který je zodpovědný za rezistenci k různým potyvirům. Rezistence k virovým patogenům rodu Potyvirus zprostředkovaná tímto genem byla rovněž popsána u celé řady jiných druhů rostlin. Byla také doložena interakce mezi eif4e proteinem hostitele a VPg proteinem viru, respektive eif4e(iso) a proteinem sbm-2 lokusu. Homologní gen eif4e(iso), LGII byl nalezen v těsné vazbě k sbm-2 lokusu. Dosud byly popsány mutantní rezistentní alely a vyvinuty přímé molekulární markery jen pro eif4e (sbm-1). Polymorfismy mezi alelami eif4e(iso) u rezistentních (sbm-2) a sensitivních (Sbm-2) genotypů nebyly zatím identifikovány, ačkoliv právě na základě těchto zjištění by mohly být zdokonaleny techniky markery asistované selekce (MAS). 12
2 CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo s pomocí molekulárně biologických metod stanovit celkovou genomovou sekvenci genu eif4e(iso) u 15 vybraných položek hrachu (Pisum sativum L.), dříve popsaných jako rezistentní či sensitivní k patotypu P2 Pea seed-borne mosaic virus (Virová mozaika přenosná semenem). Výsledky porovnat s dosud publikovanými sekvencemi cdna tohoto genu, vymezit hranice exon/intron, provést predikci primární struktury proteinů a v případě zjištění polymorfismů vázaných na rezistentní genotypy navrhnout jednoduchý markerovací systém pro detekci těchto alel, jež by mohl být využitelný při markery asistované selekci. 13
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Virové patogeny rostlin (Rostlinné viry) Slovo virus pochází z latiny, kde původně znamená jed nebo zápach. Tento název poprvé použil v roce 1898 nizozemský botanik a mikrobiolog Martinus Wilhelm Beijerinck (1851-1931) a pojem virus jako taxonomické označení je používán dodnes. Za zakladatele rostlinné virologie je však považován ruský vědec Dmitrij Josifovič Ivanovskij (1864-1920), který prokázal, že původce mozaiky tabáku (Tobacco mosaic virus TMV) je schopen projít skrze bakteriální filtry a poté opětovně infikovat rostliny tabáku. V současné době se počet druhů virových patogenů rostlin odhaduje na přibližně 1000. Rostlinné viry jsou nebuněčné submikroskopické organismy způsobující choroby rostlin nazývané virózy. K translaci, transkripci nebo replikaci využívají zásadně aparát hostitelské buňky. Rostlinné viry nevytvářejí ani neakumulují volnou energii a nejsou ani funkčně aktivní mimo buňky hostitele, jde tedy o obligátní nitrobuněčné parazity. Nejmenší virová částice schopná infekce hostitelské rostliny je virion. Velikost virionu se pohybuje mezi 10-800 nm, tvar je povětšinou kulovitý, tyčinkovitý, vláknitý či baciliformní, některé viriony mají však charakter zdvojených částic (Geminiviridae), jiné mají svůj genom rozdělený do několika částic buď stejné (Cucumoviridae) nebo ruzné (Furoviridae, Hordeiviridae) velikosti. Pro vznik infekce musejí být v inokulu částice se všemi úseky nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) (Kazda et al., 2003). Stavba virionu bývá u různých druhů virů odlišná, avšak obvykle sestává z nukleové kyseliny a bílkovinného obalu, též nazývaného kapsida, složeného z jednotek plášťového proteinu - kapsomer. Plášťový protein je obvykle kódován nukleovou kyselinou viru, zvláštní skupinu v tomto ohledu tvoří viroidy, malé cyklické molekuly RNA, které nekódují žádné proteiny a nemají tedy ani bílkovinný obal. Jinou speciální skupinu virů tvoří satelitní viry a satelitní RNA. Jednotky satelitních virů nejsou schopny samostatné infekce hostitelského organismu a pro svou replikaci potřebují produkty pomocného virového patogena (tzv. helper virus) (Malyshenko et al., 1989). Přítomnost satelitního viru často znamená pro pomocný virus sníženou schopnost virulence či množení, jde tedy o jistou formu parazitismu na pomocném viru. Satelitní 14
RNA jsou krátké, lineární či kruhové molekuly RNA přítomné ve virionech některých multikomponentních virů. Tyto RNA nejsou vázány, a pokud ano tak jen částečně na RNA viru a mohou zvyšovat nebo snižovat závažnost virové infekce (Agrios, 2005). 3.1.1 Genetická informace viru Nukleová kyselina viru je nositelkou genetické informace kódující obvykle jen několik proteinů, které jsou potřebné pro životní cyklus patogena. Ačkoliv je složení nukleových kyselin virových patogenů stejné jako u ostatních organismů a liší se pouze délkou a sekvencí nukleotidů, nevytvářejí viry chromozomy ani plazmidy. Jejich nukleová kyselina může být jednovláknová či dvouvláknová, lineární nebo kružnicová. Převážná většina rostlinných virů jsou jednořetězcovou ssrna viry, méně jich patří do skupiny ssdna a jen velmi málo virových patogenů je tvořeno dvouřetězcovou RNA či DNA (Agrios, 2005). Mezi nejčastější proteiny kódované nukleovou kyselinou virů patří plášťový protein, jež tvoří kapsidu; např. kapsida Tobacco mosaic virus je tvořena 2130 jednotkami plášťového proteinu (Klug, 1999). Plášťový protein je potřebný nejen kvůli ochraně virionu, ale jeho strukturou bývá také zprostředkován specifický vztah virus-vektor nebo šíření virové infekce v rostlině (Andrejeva et al., 1999). Dalším důležitým peptidem kódovaným nukleovou kyselinou viru bývají polymerázy, enzymy katalyzující přepis nukleových kyselin. V závislosti na druhu virového patogena to mohou být DNAdependentní DNA polymerázy či DNA-dependentní RNA polymerázy (transkriptázy) vyskytující se u DNA virů, RNA-dependentní RNA polymerázy u RNA virů nebo RNAdependentní DNA polymerázy (reverzní transkriptázy) u retrovirů. Nukleové kyseliny některých virů nesou informaci pro tvorbu proteáz, které specificky štěpí prekurzory proteinů virového patogena, což vlastně umožňuje vznik funkčních proteinů. Jinými proteiny, jež jsou kódovány virovou nukleovou kyselinou, mohou být tzv. movement protein, který rozšiřuje plasmodesmata a umožňuje tak průchod virionů do sousedních buněk (Boevink and Oparka, 2005), či nestrukturální proteiny podílející se na tvorbě inkluzí nebo mohou být důležité pro přenos hmyzími vektory (Sako and Ogata, 1981). 15
3.1.2 Životní cyklus virů Životní cyklus virů jakožto obligátních parazitů vázaných na hostitele je totožný s infekčním cyklem, kdy na rozdíl od fakultativních parazitů chybí fáze přežívaní. Životní cyklus rostlinných tedy představují jen dvě fáze: množení (a šíření) patogena v rostlinných pletivech a přenos virů mezi rostlinami. 3.1.2.1 Množení patogena v rostlinných pletivech Po vstupu do rostlinné buňky začínají viriony aktivovat své rozmnožovací funkce. Dochází k uvolnění nukleové kyseliny z bílkovinného obalu. U +ssrna virů (např. Potyviridae) dochází nejprve k translaci a poté k vytvoření negativního vlákna RNA pomocí virové RdRp. Negativní vlákno pak slouží jako templát pro tvorbu pozitivních vláken. Naopak u -ssrna (např. Rhabdoviridae) virů musí být RNA nejdříve přepsána polymerázu, která je nesena každým jednotlivým virionem (Banerjee, 1987). dsdna viry (např. Caulimoviridae) vytvářejí v jádře rostlinné buňky spiralizované minichromozomy, ze kterých jsou transkribovány polycistronické RNA. Tyto RNA jsou transportovány z jádra do cytosolu, kde jsou translatovány a nebo přepsány reverzní transkriptázou do dsdna. Vzniklá dsdna může znovu přecházet do jádra nebo být enkapsidována jednotkami plášťového proteinu (Stavolone et al., 2003). U ssdna virů (např. Geminiviridae) je nejprve navedena do jádra hostitelské buňky, kde je dosyntetizováno druhé vlákno a vytvořen tzv. minichromozom. Minichromozom je replikován a exprimuje plášťový protein, který obaluje vzniklou ssdna, čímž vznikají viriony, které se mohou šířit do okolních buněk (Monsalve-Fonnegra et al., 2002). Šíření virové infekce v rostlinách probíhá na dvou hlavních úrovních - šíření infekce mezi buňkami (tzv. šíření na krátké vzdálenosti) a šíření infekce mezi rostlinnými orgány (tzv. šíření na dlouhé vzdálenosti). Na krátké vzdálenosti se viriony šíří v rostlině plasmodesmaty. Protože není velikost plasmodesmat pro transport makromolekul dostatečná, vyvinuly viry pro tento účel různé strategie např. vytvoření proteinového kanálku (Kasteel et al., 1997), rozšíření průchodu plasmodesmat movement proteinem (Howard et al., 2004) nebo vytvoření komplexu s movement proteinem o menším průměru než je virová partikule (Beachy and Heinlein, 2000). 16
Na dlouhé vzdálenosti se viry mohou šířit po vstupu do floému. Virová infekce se poté rozšíří po celé rostlině, mnohdy do částí vzdálených od místa primární infekce a takovouto infekci označujeme jako systémovou. Systémová infekce je charakteristická rovnoměrným rozmnožováním virů po celé rostlině, avšak některé části rostliny zůstávají zpravidla nenapadené. Mezi tyto patří zejména apikální meristémy, které bývají napadeny buď sporadicky, nebo vůbec. Tento jev je pravděpodobně zapříčiněn rychlostí dělení buněk meristému a nepřítomností vodivých svazků v této části rostliny. 3.1.2.2 Přenos virů mezi rostlinami Viriony se do rostlinné buňky dostávají pasivně a to v zásadě třemi možnými cestami: mechanickým přenosem šťávy, vegetativním či generativním množením nebo za pomocí vektorů. Mechanický přenos se v přírodě příliš nevyskytuje, byl popsán např. při otěru listů brambor u Potato virus X, nebo při sečení u White clover mosaic virus. Virózy jsou také přenášeny vegetativním množením napadeného rostlinného materiálu, což představuje obrovský problém zejména u porostů plodin typu klonů, tedy vegetativně množených (např. brambory, chmel, ovocné stromy). S přenosem semenem, tedy při generativním množení se lze setkat cca u 20% rostlinných virů např. u Pea seedborne mosaic virus. Na přenosu virové infekce se mohou podílet také rozličné organismy nazývané vektory (přenašeči). Například půdní protista Polymyxa beatae přenáší Beet necrotic yellow vein virus původce rhizománie, obávané virózy cukrové řepy či ascomycota Spongospora subterranea může přenášet Mop-top virus bramboru. Na přenosu virů se mohou podílet také hlístice (Nepoviry jsou přenášeny rody Xiphinema, Longidorusa a Trichodorus), roztoči (Abacarus hystrix přenáší Ryegrass mosaic virus), hmyz (brouci, třásněnky, polokřídlí) nebo parazitické rostliny jako např. kokotice (Birschwilks et al., 2006). Spektrum vektorů tedy zahrnuje široké spektrum organismů od hub přes hlístice až po parazitické rostliny. Nejpočetnější skupinou přenašečů je však savý hmyz, zejména mšice, které přenášejí 90% veškerých fytopatogenních virů. Podle specifického vztahu virus-vektor a podle způsobu přenosu můžeme rozdělit viry na dvě skupiny(musil et al., 1981): 17
Perzistentní viry (cirkulační viry) může hmyz přenést až po několika hodinách akvizičního sání. Poté nastává latentní perioda kdy virus přechází trávícím traktem hmyzu a dostává se do míst odkud muže být dopraven do rostliny. Jakmile virus přejde do těla hmyzu, je tento vektor schopen přenášet infekci po celou dobu svého života a je přenosný na jeho potomstvo. Existují druhy, u nichž je dokonce virus schopen rozmnožování v těle vektoru. Neperzistentní viry (necirkulační viry) je vektor schopen přenášet již za několik minut po započetí akvizičního sání, avšak schopnost přenosu vektor ztrácí po svlékání (Musil et al., 1981). Semiperzistentní viry u nichž efektivita přenosu roste s časem akvizičního sání a s dobou inokulace, přičemž vektor je schopen přenášet infekci několik hodin až dnů. Přenos virů, vykazující jak rysy semiperzistentní tak neperzistentní je nazýván bimodální (Moya, 2002). 3.1.3 Ochrana plodin před virózami Neexistuje spolehlivý způsob potlačení virového patogena v již napadené rostlině, aniž by došlo k jejímu nevratnému poškození. Možným způsobem ozdravení je kultivace meristému in vitro případně v kombinaci s termoterapií. Tento způsob se využívá při šlechtění a uchovávání genetických zdrojů, avšak pro běžnou zemědělskou praxi je nepoužitelný. Proto se jako nejperspektivnější v ochraně rostlin proti virovým onemocněním jeví pěstování rezistentních rostlin. Pěstování rezistentních rostlin je základem integrované ochrany rostlin a zároveň představuje jedinou přímou ochranu proti virovým patogenům. Často však v sortimentu hospodářských plodin rezistentní odrůdy chybí a pěstitelé jsou nuceni při řízení ochrany použít jiná opatření. Jedním z efektivních ochranných zásahů může být chemická či biologická regulace vektorů virových patogenů. Ochranu proti vektorům (zejména mšicím) je třeba provádět včas a opakovaně, sledovat jejich výskyt a početnost náletů, především u množitelských porostů. Použít lze nejen chemické postřiky ale v některých případech také granulované insekticidy či moření sadby. 18
Dodržováním izolační vzdálenosti mezi kulturami botanicky příbuzných plodin lze také minimalizovat napadení rostlinnými viry. Stejně tak je vhodné dodržovat izolační vzdálenost produkčních ploch od vesnických či rekreačních zahrádek, neboť tyto bývají často silným a stálým zdrojem virových infekcí. Základem ochrany rostlin je samozřejmě také dobrá agrotechnika. Důsledná likvidace plevelů, které mohou být hostiteli viróz; dezinfekce nářadí, eliminace poškození rostlin při kultivaci, vyrovnaná výživa či vhodně sestavený osevní postup přispívají rovněž ke snížení výskytu viróz. Další vhodné opatření je používání viruprostého (virus-free) certifikovaného osiva resp. sadby. Toto opatření je zvláště důležité u semeny přenosných viróz a vegetativně množené sadby. Sadba vegetativně množených druhů může být pěstována pouze v sadbových oblastech a je nutno provádět negativní výběry tzn. odstraňovat napadené rostliny. U některých plodin lze použít tzv. cross protection tedy křížovou ochranu. Křížová ochrana spočívá v umělé mechanické inokulaci mladých rostlin mírně patogenním kmenem virového patogena, což zajistí ochranu před napadením vysoce patogenními kmeny viru. Ačkoliv se křížová ochrana jeví jako ideální způsob ochrany při absenci rezistentních odrůd, není v praxi příliš rozšířená, protože metodiky pro křížovou ochranu jsou vypracovány pro omezený počet plodin a samotný proces inokulace je příliš pracný. 19
3.2 Molekulární mechanismy rezistence k virovým patogenům Obecně lze rezistenci k virovým patogenůn rozdělit podle způsobu dědičnosti (dominantní, recesivní) či podle počtu genů, kterými je kódována (monogenní, polygenní, popř. oligogenní) (Chloupek, 2008). Na molekulární úrovni bylo však popsáno větší množství mechanismů, které přispívají k virové rezistenci u rostlin. Tyto mechanismy vyplývají z bionomie virového patogena a rezistence je tedy umožněna inhibicí některé z úrovní infekčního cyklu viru. Těmito úrovněmi jsou zejména: replikace virových částic, šíření virionů uvnitř buňky, mezi buňkami a šíření virové infekce vaskulárními pletivy (Kang et al., 2005b). 3.2.1 Buněčná rezistence Buněčná rezistence je charakterizována jako stav, kdy v inokulovaných rostlinných buňkách nedochází k replikaci viru, nebo je replikace viru velmi nízká. V poslední době je jedním z nejvíce diskutovaných a velice dobře popsaných mechanismů podílejících se na virové rezistenci RNAi (RNA interference) neboli tzv. post-transkripční genový silencing (PTGS), tedy proces potlačující expresi genů na úrovni jejich transkriptů (Fire et al., 1998). Ústřední roli zde hraje dvouvláknová RNA, která vzniká během životního cyklu mnoha druhů virů a chová se jako spouštěč i cíl tohoto mechanismu. Virová dsrna je v iniciačním kroku procesu RNAi rozpoznána enzymem Dicer (RNáza III) a štěpena na segmenty o velikosti 21-23 nukleotidů s převisy dvou nepárujících nukleotidů na 3 koncích (Ketting et al., 2001). Takto vzniklé segmenty jsou označovány jako sirna (short interfering RNA) a představují přechod k efektorovému kroku RNA interference. V tomto kroku dochází k rozpletení duplexu sirna a inkorporaci jednoho z jejích vláken do RISC (RNA-induced silencing complex) - proteinového komplexu, jehož hlavní složku tvoří protein z rodiny Argonaute (Hock and Meister, 2008). Takto vytvořený ribonukleoproteinový komplex sekvenčně specificky vyhledává a váže se za pomocí krátkého RNA vlákna, na jemu komplementární fragmenty virové RNA. Součástí RISCu je také nukleáza Slicer, která katalyzuje štěpení cílové RNA na krátké fragmenty, které jsou poté buněčnými procesy degradovány (Brodersen and Voinnet, 2006). Zesílení signálu 20
RNAi je umožněno funkcí RNA-dependentní RNA polymerázy, která amplifikuje vlákna sirna a je rovněž součástí RISC (Vaistij et al., 2002). Další výhodou tohoto mechanismu je možnost šířit interferenční signál v podobě dsrna či sirna v rostlině na krátké vzdálenosti pomocí plasmodesmat a na delší pak vaskulárními pletivy (Voinnet et al, 1998). Bylo také prokázáno, že v souvislosti s RNAi potlačují genovou expresi také další jevy, indukující metylace DNA sekvenčně homologních fragmentů jako je spouštějící sekvence RNAi (Matzke et al., 2007). Ačkoliv se RNAi jeví jako ideální mechanismus pro zprostředkování rezistence k virům, některé viry jsou schopny vytvářet proteiny inhibující některé fáze interference (Voinnet, 2001). Fenomén RNAi je evolučně velmi konzervovaný napříč širokým spektrem eukaryotních organismů a představuje nejen účinný obranný mechanismus proti virovým infekcím, ale je také organismy využíván pro regulaci vlastní genové exprese a ochranu před vlastními transponovatelnými elementy (Hannon, 2002). Dalším typem rezistence na úrovni buňky je přímé potlačení translace virové RNA. Od endogenní rostlinné mrna se virová RNA odlišuje zejména strukturami na 5 a 3 konci, tedy absencí nebo přítomností jiné struktury než tzv. 5 čepičky (tj. obrácený 7-methyl-guanosin) a 3 poly-a konce (Dreher and Miller, 2006). U virů čeledi Potyiridae je na 5 konci RNA vlákna místo čepičky připojen protein VPg (viral protein genomelinked) (Reichmann et al., 1989), který je obvykle rozpoznán jako čepička a virová RNA je translatována v protein. Důležitou roli zde hrají rostlinné proteiny eif - eukaryotní translační faktory (zejména eif4e), jež vazbu na VPg zprostředkovávají (Beauchemin et al, 2007). Mutace genů kódujících eif4e způsobují jejich neschopnost vázat VPg a tím přispívat k rezistenci k potyvirům (viz kapitola 3.4). Tento typ rezistence se dědí recesivně a byl popsán u mnoha zemědělsky významných plodin jako je např. paprika (Kang et al., 2005a; Ruffel et al., 2002), salát (Niciase et al., 2003), ječmen (Stein et al., 2005), hrách (Rasmussen et al., 2007), rajče (Parrela et al., 2002) aj., včteně modelové rostliny huseníčku (A. thaliana) (Lellis et al., 2002). Jiný typ recesivní buněčné rezistence byl popsán při interakci Arabidopsis thaliana a Tobacco mosasic virus (TMV). Tom1 a Tom2A jsou geny A. thaliana kódující transmembránové proteiny lokalizované v tonoplastu, které spolu navzájem interagují (Tsujimoto et al., 2003) a tvoří důležité komponenty pro sestavení replikačního komplexu 21
TMV (Hagiwara et al., 2003). Mutace těchto genů negativně ovlivňuje akumulaci virové RNA v buňce, což je v tomto případě podstatou rezistence (Ohshima et al, 1998). Odlišné mechanismy buněčné rezistence spočívají v potlačení exprese rostlinných enzymů provádějících modifikace na virových proteinech, což zabraňuje replikaci viru (Castillo et al., 2004). Buněčná rezistence může být také kontrolována dominantně monogenně. Bylo zjištěno, že odolnost bramboru k Potato virus Y (kódována dominantní alelou Ry), je vyvolána proteolytickou aktivitou virového enzymu NIaPro (nuclear inclusion a proteinase). NIaPro štěpí zatím neznámý elicitor (možná Ry), který je buď negativním regulátorem této rezistence k PVY nebo právě po jeho rozštěpení vzniká aktivní forma elicitoru způsobující smrt napadené buňky a tím rezistenci (Mestre et al. 2000, Mestre et al. 2003). 3.2.2 Rezistence k šíření viru mezi buňkami Po úspěšném zvládnutí replikace musí viriony přecházet z primárně napadených buněk do buněk sousedních, což zpravidla vyústí v systémovou infekci celé rostliny. Zde lze pozorovat hostitelskou odpověď rostliny, kdy ačkoliv virus infikuje jednu či více buněk jejích buněk, není schopen pohybu mimo toto ohnisko infekce. Taková rezistence je způsobena buďto selháním v interakci rostlinných a virových faktorů důležitých pro pohyb z buňky do buňky nebo aktivní hostitelskou odpovědí, která rapidně omezuje rozšíření viru (Kang et al., 2005b). Dominantní rezistence je často provázena tzv. hypersensitivní reakcí, což je většinou aktivní odpověď rostliny, kdy napadená buňka a často i buňky okolní odumírají, čímž patogenu znemožňují další šíření. Po rozpoznání virové infekce indukuje hostitelská rostlina kaskádu obranných odpovědí zahrnujících především: tvorbu aktivních forem kyslíku, zvýšenou tvorbu a aktivitu hydroláz a patogen-related proteinů, biosyntézu kalózy a ligninu. Konečným vyústěním těchto buněčných pochodů je pak nekróza a smrt rostlinných buněk. Takový typ rezistence najdeme např. u rajčete, kde je kódována genem Sw-5, jehož produkt je klíčovým faktorem v odolnosti k Tomato spotted wilt virus (TSWV). Rezistentní 22
genotypy nesoucí dominantní alelu tohoto genu vytvářejí po inokulaci lokální nekrotická léze a šíření patogena je zastaveno. Zajímavá je vysoká sekvenční shoda proteinů kódovaných genem Sw-5 a Mi, jež navozuje rezistenci k háďátkům (Brommonschenkel et al., 2000). Je tedy možné, že rezistence k virům a háďátkům je zprostředkována stejnou či podobnou signální dráhou. Jiným příkladem dominantní rezistence je dobře popsaná interakce mezi tabákem a Tobacco mosaic virus (TMV). Rostliny tabáku nesoucí dominantní alelu N vytvářejí 48 hodin po inokulaci TMV nekrotické léze, pouze v případě, že teplota nestoupne nad 28 C. Při vyšších teplotách se tato léze nevytvářejí a TMV se systemicky šíří v rostlině. Pokud došlo k systemické infekci (při teplotě vyšší než 28 C) a poté ke snížení teploty byla pozorována letální systemická nekróza (Dijkstra et al., 1977). Tento fakt zůstává dosud neobjasněn, avšak některé mechanismy a proteiny podílející se na signální dráze této rezistence jsou již identifikovány. Transkripce alely N je pozitivně regulována po infekci TMV, důsledkem je vznik dvou různých mrna mechanismem alternativního sestřihu, přičemž přítomnost obou těchto transkriptů je nutná pro dosažení rezistence (Dinesh- Kumar and Baker, 1999). Dalšími důležitými geny pro přenos signálu jsou SGT1, Rar1 a EDS1 (Liu et al., 2002a). Proteiny SGT1 a Rar1 se váží na Hsp90 a tím je umožněno správné složení či prostorovou konformaci N proteinu (Liu et al., 2004). Multiproteinový komplex COP9 (jež je mimo jiné součástí signální dráhy pro odpověď na světlo) interagující s SGT1, obsahuje proteinkinázy (MAPK, WIPK, SIPK) a je aktivován NtMEK2 kinázou (Liu et al., 2002b). Mutace některého z výše uvedených elementů zeslabuje rezistenci založenou na dominantní alele N (Jin et al., 2002). Úlohu při zprostředkování rezistence k šíření viru mezi buňkami mají také translační faktory eif4e a eif4g. V buňkách rostlin nesoucích mutované alely těchto genů dochází k normálnímu množení potyvirů, avšak šíření do okolních buněk je potlačeno. Tento jev byl pozorován např. u hrachu a Pea seed borne mosaic virus (Gao et al., 2004b); papriky a Tobacco etch virus (Kang et al., 2005a) či huseníčku a Cucumber mosaic virus (Yoshii et al., 2004). 23
3.2.3 Rezistence k šíření viru vaskulárními pletivy Šíření virů v rostlině mezi vzdálenými orgány (tzv. šíření na dlouhé vzdálenosti) je počátkem systémové infekce a je uskutečňováno vaskulárními pletivy. Většina rostlinných virů se šíří na dlouhé vzdálenosti floémem, pouze několik málo virů, např. Cucumber green mottle mosaic virus (Moreno et al., 2004) či Soil-borne wheat mosaic virus (Verchot et al., 2001), využívá k šíření xylém. Virová infekce přechází do floému přes lýkový sklerenchym a parenchym do průvodních buněk a článků sítkovic. Důležitými momenty šíření jsou vstup a výstup z průvodních buněk, přičemž v každém směru probíhá přechod odlišně a jsou vyžadovány jiné faktory hostitele (Chen and Citovsky, 2003). Protože je však studium šíření virové infekce na dlouhé vzdálenosti mnohem složitější ve srovnání s šířením infekce mezi buňkami, bylo zatím identifikováno velmi málo rostlinných genů rezistence působících na této úrovni. Recesivní alela ra u bramboru spouští mechanismy rezistence k šíření vaskulárními pletivy u Potato virus A, avšak multiplikace a šíření viru mezi buňkami probíhá jako u náchylných rostlin (Hamalainen et al., 2000). Fenomén recesivní alely zprostředkující zabránění šíření viru floémem byl popsán také u sóji a Cowpea chlorotic mottle virus (Goodrick et al., 1991). Po infekci bramboru Potato leaf roll virus (virus svinutky bramboru) se infekce u náchylných odrůd objevuje jak v článcích sítkovic, tak v průvodních buňkách, zatímco u rezistentních klonů je přítomnost infekce v průvodních buňkách velmi omezena. Tento fakt naznačuje, že zvýšená odolnost těchto klonů je spočívá v omezeném výstupu virového patogena z floému (Derrick and Baker, 1997). Tři dominantní alely - RTM1, RTM2 a RTM3 (restricted TEV movement) - jsou potřebné pro omezení šíření Tobacco etch virus na dlouhé vzdálenosti v Arabidopsis thaliana. RTM1 je homologem JACALINU, který patří do rodiny proteinů účastnících se obrany před houbovými patogeny a hmyzem. Protein RTM2 obsahuje domény podobné rostlinným heat shock proteinům. Ačkoli je známo, že RTM1 i RTM2 jsou exprimovány v článcích sítkovic podrobný mechanismus jejich působení zatím není znám (Chisholm et al., 2001). 24
3.2.4 Transgenní rezistence k virovým patogenům Pomocí metod genetického inženýrství a transgenoze lze cíleně vnášet cizorodou nukleovou kyselinu do genomu rostlin. Mezi nejpoužívanější techniky transgenoze rostlin patří transformace rostlin za pomocí bakteriálního patogenu Agrobacterium tumefaciens, který inkorporuje část Ti-plazmidu (tumour inducing) tzv. T-DNA do jaderné DNA rostliny a poté využívá metabolity vzniklé katalytickým působením vložených enzymů. Druhou možností transformace rostlin je metoda biolistická (tzv. particle bombardment), kdy jsou drobné kovové částice (nejčastěji zlaté či wolframové) s navázanou DNA vstřelovány do rostlinných pletiv. Tato metoda je často využívaná u jednoděložných rostlin, protože tyto nejsou hostitelé bakterií rodu Agrobacterium. Jako velmi perspektivní se jeví využití rekombinantních proteinů obsahujících motivy zinkových prstů v kombinaci s endonukleázou (zinc-finger nuclease), což umožňuje vnesení genu do předem určeného místa v genomu. Tato metoda je založena na mechanismu homologní rekombinace a byla již úspěšně vyzkoušena na kukuřici (Shukla et al., 2009) a tabáku (Townsend et al., 2009). Pathogen derived resistance je strategie založená na vnášení fragmentů kódujících geny virového patogena do genomu rostlin a jejich expresi. Pro navození pathogen derived resistance bývá nejčastěji vnášen plášťový protein, ale s úspěchem byl použit také movement protein či replikáza (Wilson, 1993). Jiným způsobem indukce rezistence k rostlinným virům je vnášení jejich antisense konstruktů, které po přepisu vážou RNA viru (Baulcombe, 1996), čímž jí znemožňují účastnit se translace a také mohou být vytvořením této dsrna spuštěny procesy RNAi (viz výše). Pro vylepšení rezistence bývá efektivita RNAi posílena vnesením sense i antisense fragmentu viru, který po přepisu vytvoří vlásenkovou strukturu a tedy dvouvláknovou RNA (Varsha Wesley et al., 2003). Obecně platí, že transgenní rezistence založená na interakci RNA je účinnější avšak velmi specifická - lze ji uplatnit pouze proti virovému patogenu, z něhož byl fragment izolován; naproti tomu rezistence navozená expresí virového proteinu v rostlině často pouze zpomaluje rozšiřování či množení viru avšak je využitelná proti širšímu spektru virových patogenů (Prins, 2003) 25
3.3 Pea seed-borne mosaic virus 3.3.1 Obecná charakteristika Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV - Virus mozaiky hrachu přenosný semenem) byl poprvé popsán v Československu v roce 1966 (Musil, 1966) jako "Virus des Blattrollens der Erbse" (Pea leaf rolling virus). Paralelně v letech 1967 až 1970 byl tento virový patogen pod různými názvy popisován např. v Japonsku (Inouye, 1967), Německu (Thottappilly and Schmutter, 1968), USA (Hampton, 1969) a v Nizozemí (Bos, 1970). Hlavním společným rysem těchto prací byla skutečnost, že virus je přenášen semenem a proto byl v roce 1974 navržen jednotný název Pea seed-borne mosaic virus, který je používán dodnes a nejlépe charakterizuje infekční cyklus tohoto viru (Mink et al., 1974). PSbMV patří mezi +ssrna viry, bez DNA stádia, do čeledi Potyviridae, rodu Potyvirus. Velikost jednoho virionu je 770 x 12 nm a jeho bílkovinný obal složený z cca 2000 jednotek plášťového proteinu tvoří více než 94% hmotnosti partikule a viriony PSbMV mají vláknitý tvar. Spolu s Pea enation mosaic virus (PEMV - Virus enační mozaiky hrachu) a Bean yellow mosaic virus (BYMV - Virus žluté mozaiky fazolu) tvoří trojici hlavních virových patogenů, způsobujících hospodářsky významné škody na porostech hrachu (Pisum sativum L.) a některých dalších zástupců luskovin. Jeho celosvětový výskyt je dáván do souvislosti s faktem, že semena kultivarů hrachu jsou často mezinárodně směňována (Hampton and Mink, 1975). 3.3.2 Genom a replikace PSbMV Genom PSbMV je tvořen pozitivní jednovláknovou RNA o délce 9924 nukleotidů se zastoupením jednotlivých bazí: 33% A, 18%C, 24%G a 26% T. ORF kódující 3206 aminokyselinový polyprotein je zakončen na 5 -konci 143 nukleotidovou netranslatovanou sekvencí (UTR - untranslated region) a 163 nt dlouhou UTR na 3 -konci (Johansen et al., 1991). Na 5 -konec virové RNA je kovalentně vázán VPg protein (virus protein genomelinked) na 3 -UTR navazuje polya sekvence (Murphy et al., 1990). Při replikaci PSbMV je nejdříve nukleová kyselina viru zbavena bílkovinného obalu. RNA viru s připojeným VPg proteinem je rostlinnou buňkou rozpoznána 26
a translatována jako jeden velký polyprotein. Jak polyprotein vzniká je autoproteolyticky štěpen a vznikají jednotlivé funkční proteiny. RNA-dependentní-RNA-polymeráza využívá VPg jako primer a vytváří negativní vlákno RNA (Kao et al., 2001), které pak slouží jako templát pro syntézu pozitivních vláken (opět katalyzováno RdRp), které jsou posléze translatovány v polyprotein. Polyproteinový prekurzor PSbMV o velikosti cca 350 kda je při translaci štěpen třemi virovými proteázami na 10 menších proteinů. P1 proteáza a HC-Pro (helper component protease) katalyzují štěpení ve dvou místech poblíž N-terminálního konce polyproteinu (Carrington et al., 1989), zatímco zbylá štěpení jsou katalyzována NIa-Pro (nuclear inclusion a protease) (viz. Obr. 1). P1 protein, HC-Pro a NIa jsou tedy nutné pro uskutečnění autoproteolytického štěpení polyproteinu (Adams et al., 2005). Dalšími kódovanými proteiny jsou VPg (viral protein genome linked), vázaný na 5 -konec RNA, jež interaguje s rostlinnými translačními faktory a je tedy důležitý při translaci virové RNA (viz kapitola 3.4), CI (cylindrical inclusion) - RNA helikáza s ATPázovou aktivitou účastnící se transkripce, NIb (nuclear inclusion b) - RNA-dependentní-RNA-polymeráza, CP (coat protein) - podjednotka bílovinného obalu. U proteinu P3 není funkce zcela objasněná, ačkoliv jeho sekvence je konzervovaná mezi kmeny téhož viru, což poukazuje na důležitost P3 proteinu. Na základě výsledků experimentů se předpokládá, že se P3 účastní virové replikace (Langenberg and Zhang, 1997), či je zapojený do mechanismu štěpení polyproteinu (Reichmann et al., 1992). Důležitá je však skutečnost, že P3 protein představuje avirulentní faktor při rezistenci kódované lokusem sbm-2 (Johansen et al., 2001). Krátké virové proteiny 6k1 a 6k2 jsou nepostradatelné při virové replikaci ani zde však není mechanismus jejich působnosti úplně objasněn (Merits et al., 2002). 27
Obr. 1 Grafické znázornění genomu PSbMV a oblastí kódujících jednotlivé proteiny. Zelené šipky označují místa, kde štěpí P1 a Hc-Pro, červené kosočtverce označují kde štěpí NIa-Pro. (převzato z http://www.jic.ac.uk/staff/andy-maule/potyviruses.htm) 3.3.3 Šíření v rostlině Pojem šíření viru zahrnuje obecné mechanismy zmnožování a translokace virového patogena uvnitř rostliny. Po úspěšné počáteční infekci prvních buněk je dalším krokem rozšíření infekce do okolních buněk a kolonizace vaskulárních pletiv a ostatních orgánů rostliny. Předpokládá se, že PSbMV jako zástupce +RNA virů se šíří na krátké vzdálenosti mezi buňkami plasmodesmaty (Lucas and Gilbertson, 1994) a na dlouhé vaskulárními pletivy (Hull, 1991). Oba typy šíření viru v rostlině vyžadují hostitelské faktory, které jsou však odlišné (Schaad and Carrington, 1996) v obou typech šíření však hrají důležitou roli produkty kódované virovou RNA. Pravděpodobně nejdůležitější determinantou PSbMV při šíření v rostlině vzdálenosti je protein VPg, reagující s eukaryotními translačními faktory 4E a 4G, které jsou důležité nejen pro replikaci ale také pro usměrnění šíření viru do plasmodesmat resp. okolních buněk (Gao et al., 2004b). Jako další důležitý rostlinný faktor v patogenezi PSbMV se jeví tzv. PVIP (potyvirus VPg-interacting protein) jehož N- terminální doména interaguje s VPg. Bez této interakce je šíření na krátké i dlouhé vzdálenosti sníženo (Dunoyer et al., 2004). Při šíření na dlouhé vzdálenosti vstupují virové partikule do floémového toku, přes lýkový parenchym, průvodní buňky až do článků sítkovic (Rajamaki and Valkonen, 2001). Tento typ šíření není konkrétně u PSbMV příliš popsán ale z hlediska obecnějších mechanismů šíření virové infekce na dlouhé vzdálenosti u potyvirů se předpokládá důležitost plášťového proteinu, Hc-Pro proteinu a taky VPg (Carrington et al., 1996). 28
3.3.4 Přenos PSbMV Přenos PSbMV je možný třemi základními způsoby - semenem, mechanicky a hmyzími vektory (mšicemi). Přenos semenem není mezi rostlinnými viry příliš rozšířený; pouze okolo 20% virových patogenů se šíří touto cestou (Mink, 1993). Tento způsob přenosu bývá také označován jako vertikální (z rodiče na potomka). Zajímavý je také fakt, že virový patogen není přenášen v gametách, protože není přítomen ani v zárodečném vaku ani v pylových zrnech (Wang and Maule, 1992), ale napadá embryo až v pozdějším stádiu, a to přes suspenzor. Avšak ani některé náchylné odrůdy nevykazují po inokulaci PSbMV přenos viru na potomstvo. Tato částečná rezistence je způsobena účinkem maternálních minorgenů - dědí se tedy jako kvantitativní znak, přičemž o možnosti přenosu infekce do embrya vždy rozhoduje na genotyp mateřské rostliny (Wang and Maule, 1994). Přenos viru z mateřské rostliny do embrya je možný pouze v určité fázi embryonálního vývoje a její frekvence je ovlivněna také fyzikálními faktory vnějšího prostředí, zejména teplotou a intenzitou osvětlení (Mink et al., 1969). Lokálně je virus nejčastěji přenášen mšicemi, které jej nesou ve styletech (Lim et al., 1977) a o tomto způsobu přenosu lze také hovořit jako o horizontálním (mezi rostlinami stejné generace). Celkem bylo identifikováno 21 druhů mšic jako vektorů schopných přenášet PSbMV (Khetarpal et al., 1987) a to neperzistentně s dobou akvizičního sání v závislosti na druhu mšice od 1-2 minut, bez latentní fáze, přičemž nejefektivnější doba akvizičního sání pro přenos viru je 10 minut až 3 hodiny (Chiko and Zimmer, 1978). V našich podmínkách bylo přenos PSbMV pozorován u těchto 6 druhů mšic: mšice broskvoňová (Myzus persicae Sulz.), mšice maková (Aphis fabae Scop.), mšice vojtěšková (Aphis craccivora Koch.), mšice rybízová (Cryptomyzus ribis L.), kyjatka růžová (Macrosiphum rosae L.) a kyjatka hrachová (Acyrtosiphum pisi L.) (Musil, 1970), u které byla popsána i její schopnost přenosu PSbMV na čočku (Hampton, 1982). Posledním možným způsobem přenosu PSbMV je přenos mechanický (horizontální), tento způsob přenosu je hospodářsky nejméně významný a v praxi k němu příliš často nedochází. 29
3.3.5 Hostitelské rostliny Hostitelské spektrum PSbMV zahrnuje cca 51 dvouděložných rostlin, z nichž většina spadá do čeledi Fabaceae (Bobovité) (Aapola et al., 1974). Rostliny patřící do jiných čeledí nevykazují po infekci PSbMV žádné pozorovatelné symptomy. Mezi hospodářsky významné hostitelské druhy patří: hrách setý (Pisum sativum L.), čočka kuchyňská (Lens culinaris Medik.), cizrna beraní (Cicer arietinum L.), bob obecný (Vicia faba L.), vikev setá (Vicia sativa L.) a fazol obecný (Phaseolus vulgaris L.) (Alconero et al., 1986); z plevelných druhů jsou to především vikve (Vicia hirsuta L., V. villosa Roth, V. angustifolia L. aj.) nebo merlíky (Chenopodium album L.). Mezi další významné plodiny, které mohou být infikovány PSbMV avšak nevytvářejí symptomy a jsou tedy potenciálními přenašeči patří: tykev obrovská (Cucurbita maxima Duchesne), brukev pekingská (Brassica pekinensis Lour.), tolice dětelová (Medicago lupulina L.), tolice vojtěška (Medicago sativa L.) a chmel otáčivý (Humulus lupulus L.). Pro diagnostické účely jsou jako referenční hostitelské rostliny používány Chenopodium quinoa Willd. (lokální chlorotické léze), Chenopodium amaranticolor Coste & A.Reyn. (lokální nekrotické léze), Pisum sativum L. (kultivary Perfection - zakrslost, žloutnutí žilnatiny a svinování listů) a Vicia faba L. (systémová chloróza žilnatiny) (Brunt et al., 1996). 3.3.6 Symptomy PSbMV Symptomy napadení PSbMV jsou velmi variabilní a značně závisejí na vnějších podmínkách, kmenu viru a genotypovém založení hostitele, tedy na druhu, či dokonce odrůdě napadené rostliny. K hlavním symptomům napadení PSbMV patří lehké chlorózy, zkrácení a srolování listů, žloutnutí a bobtnání žilek, kroucení a deformace úponků, často nepříliš zřetelné mozaiky, různé stupně zakrslosti, zkroucené květy, ze kterých vznikají zkroucené lusky se semeny s rozpraskanými obaly či nekrotickými skvrnami (vývoj semena je nevyrovnaný nebo nedokončený), některé odrůdy po infekci lusky vůbec nenasazují (Khetarpal et al., 1987). Bylo také zjištěno, že rychlost šíření symptomů závisí přímo úměrně na teplotě okolí (Stevenson and Rand, 1970). 30
Některé ze symptomů napadení PSbMV a viróz obecně bývají nespecifické a jsou často zaměňovány s deficiencemi, abionózami či symptomy napadení jinými patogeny. Často také dochází v polních podmínkách ke směsné infekci několika virových patogenů (u hrachu nejčastěji kombinace PSbMV, PEMV a BYMV) (Smýkal, osobní sdělení). Symptomy viróz, zejména v polních podmínkách, proto nelze použít pro jednoznačnou diagnostiku virových patogenů a pro jejich detekci je tedy nutno využít serologické (ELISA) či molekulárně-biologické metody (techniky založené na PCR) (Kohnen et al., 1992). A B C Obr. 2 Symptomy napadení PSbMV: A - deformovaná semena B- rolování listů C- žloutnutí žilek a mozaika. (foto R. Dostálová a D. Šafářová). 31
3.4 Rezistence k PSbMV Šlechtění na rezistenci a pěstování odrůd rezistentních k rostlinným patogenům patří k nejjednodušším a nejúčinnějším způsobům řízení ochrany rostlinné produkce. Co se týče virových chorob, rezistence k nim bývá často kódována monogenně, což ulehčuje proces šlechtění. Mimo to jiný způsob přímé ochrany proti virovým chorobám, nežli pěstování rezistentních odrůd, neexistuje. Je tedy nasnadě, že poznání mechanismů, genetického pozadí a design praktických markerovacích systémů rostlinné rezistence k virům, patří mezi hlavní cíle moderních šlechtitelských programů na celém světě. 3.4.1 Patotypy PSbMV a geny rezistence Podle výsledků infekčních testů na diferenciačních liniích hrachu byly identifikované izoláty PSbMV postupně seřazeny do čtyř skupin patotypů označovaných jako P-1 (nejběžnější patotyp), P-2, P-3 a P-4 (Alconero et al., 1986; Provvidenti and Alconero 1988 a b c; Hjulsager et al., 2002). Dále byly u hrachu popsány lokusy rezistence k některým virovým patogenům z rodu Potyvirus. Tyto rezistence jsou děděny recesivně a tvoří dva shluky nacházející se ve dvou odlišných vazebných skupinách. Vazebná skupina VI obsahuje shluk recesivních genů sbm-1, sbm-3, sbm-4, cyv-2 a wlv, které zodpovídají za rezistenci k PSbMV P1, P3, P4; Clover yellow vein virus (ClYVV) a Bean yellow mosaic virus kmen white lupin (BYMV-W). Další shluk je umístěn na vazebné skupině II a zahrnuje bcm, cyv-1, mo, pmv a sbm-2 zprostředkující rezistence k Bean common mosaic virus, Clover yellow vein virus (ClYVV), Bean yellow mosaic virus, Pea mosaic virus a PSbMV P2 (Provvidenti and Muehlbauer, 1990; Provvidenti and Hampton, 1991). Bylo zjištěno, že lokus sbm-1 do jisté míry kosegreguje (je ve vazbě) s morfologickým markerem Pl (černý pupek) a isoenzymovým markerem Prx-3 (Weeden et al., 1991). Na tyto markery však nelze při šlechtění spoléhat, neboť vzhledem ke vzdálenosti může docházet k rekombinaci mezi lokusy a tedy ke ztrátě znaku u potomstva. Proto bylo při šlechtění i nadále nutno testovat na rezistenci k PSbMV rostliny hrachu virovou infekcí, což je časově nákladné a pracné. S rozvojem metod molekulární biologie byl nejdříve identifikován RFLP marker ve vzdálenosti cca 8 cm od sbm-1 (Timmerman et 32
al., 1993) a o necelých deset let později těsněji vázaný (4 cm) STS marker (Frew et al., 2002). Avšak vzhledem k velikosti genomu hrachu představují tyto vzdálenosti stále možnost ztráty znaku v důsledku rekombinace. Na počátku 21. století se objevily informace o nové úloze eukaryotního translačního faktoru 4E (eif4e), která spočívá ve zprostředkování rezistence k virovým patogenům rodu Potyvirus u papriky (Ruffel et al., 2002), salátu (Niciase et al., 2003), ječmene (Stein et al., 2005) a rajčete (Parrela et al., 2002) aj. Metodou kandidátních genů s použitím známých sekvencí z Medicago truncatula, modelové rostliny čeledi Fabaceae, byl klonován fragment eif4e z hrachu a navržen jednoduchý PCR kodominantní marker pro detekci rezistence sbm-1, založený na délkovém polymorfismu intronu sensitivní/rezistentní alely (Gao et al., 2004a). Později bylo prokázáno, že alela eif4e kódující rezistenci k PSbMV P1 je zodpovědná také za rezistenci k BYMV-W (wlv) (Rasmussen et al., 2007) a ClYVV (cyv-2) (Andrade et al., 2009). V roce 2010 byly publikovány úplné genomické sekvence eif4e u hrachu, včetně přímých markerů pro MAS, které jsou založeny na nukleotidových mutacích vedoucích k záměně aminokyselin v primárním řetězci polypeptidu a tím k rezistenci k P1 patotypu PSbMV (Smýkal et al., 2010) (Obr. 3). A B S R S R 1 MVVEETPKSIITDDQITTNPNRVIEDDNNLEEGEILDEDDSSATSKPVVHQPHLLENSWT 1 MVVEETPKSIITDDQITTNPNRVIEDDNNLEEGEILDEDDSSATSKPVVHQPHLLENSWT 61 FWFDTPAAKSKQAAWGSSMRPIYTFSTVEEFWSIYNNIHHPGKLAVGADFYCFKHKIEPK 61 FLFDTPAAKSKQDDWGSSMRPIYTFSTVEEFWSIYNNIHHPGKLAVRADFYCFKHKIEPK S 121 WEDPICANGGKWTANYPKGKSDTSWLYTLLAMIGEQFDHGDEICGAVVNVRGRAEKISIW R 121 WEDPICANGGKWTANYPKGKSDTSWLYTLLAMIGEQFDHGDEICGAVVKVRGRAEKISIW S 181 TKNASNEAAQVSIGKQWKEFLDYNETMGFIFHDDARKLDRNAKNKYVV 228 R 181 TKNASNEAAQVSIGKQWKEFLDYNETMGFIFHDDARKLDRNAKNKYVV 228 Obr. 3 A - Schéma genomové sekvence eif4e hrachu setého. Modré obdélníky znázorňují exony a spojující lomené linky jsou introny. Uvedená čísla znamenají délku jednotlivých fragmentů v párech bazí. Červené trojúhelníky označují místa nukleotidových záměn, vedoucích k nahrazení aminokyselinových residuí, které souvisí s rezistencí: W62L (tryptofan v pozici 62 je nahrazen leucinem), AA73-74DD (alaniny v pozici 73 a 74 -> kys. asparagová), G107R (glycin v pozici 107 -> arginin), N169K (asparagin v pozici 169 -> lyzin). B - Alignment proteinových sekvencí sensitivní (S) a rezistentní (R) alely s vyznačenými záměnami aminokyselin. (Smýkal et al., 2010). 33
Prvními pokusy o nalezení genetického markeru poblíž lokusu sbm-2 byly identifikovány morfologický marker k (winged keel - okřídlený člunek) a izoenzymový marker fosfoglukomutáza (Pgm-p) (Provvidenti and Hampton, 1991). Podobně však jako u lokusu sbm-1 nebyly ani tyto markery dostačující pro šlechtění, bez finančně a časově náročného testování virovou infekcí. Odrazem této skutečnosti je fakt, že převážná většina nynějších odrůd nenese sbm rezistentní alelu. Lokus sbm-2 byl identifikován jako isoforma genu eif4e (eif4eiso), avšak rozdíly mezi recesivní a sensitivní alelou nejsou zatím známy (Gao et al., 2004b). 3.4.2 Iniciace translace u rostlin Rezistence k PSbMV založená na mutantních alelách eif4e (sbm-1) a eif4eiso (sbm-2) souvisí s potlačením virové RNA na úrovni iniciace translace. V této fázi dochází ke kritickým interakcím mezi proteiny virového patogenu a hostitelské rostliny. Pro pochopení mechanismu rezistence je tedy důležité velmi dobře poznat procesy podílející se na iniciaci translace u rostlin. U rostlin (a všeobecně eukaryot) je mrna syntetizována v jádře a po úpravách prochází jadernými póry do cytoplazmy. Obvykle rostlinná mrna kóduje jeden peptid (tzv. monocistronická mrna), po jehož translaci se ribozomy odpojí. Kvůli ochraně před exonukleázami je mrna modifikována na koncích - na 5 -konci je navázaná tzv. čepička (cap), což je obrácený 7-methylguanosin a na 3 -konci je mrna chráněna polya úsekem dlouhým cca 100-200 bp, který není kódován ale syntetizován polya polymerázou (PAP). Zásadní roli při iniciaci translace hrají eukaryotní translační faktory (eif), proteiny specificky umožňující vazbu podjednotek ribozomů na mrna. Prvním krokem iniciace je navázání faktorů eif1a a eif3 na malou podjednotku ribosomu (40S), což vede k vytvoření tzv. komplexu 43S, zatímco na velkou podjednotku (60S) se váže faktor eif3a - tato navázání translačních faktorů brání ribozomálním podjednotkám ve spojení navzájem. Faktor eif2 váže trna-met a přenáší jej na komplex 43S ale až po navázání GTP přímo na faktor (Pestova et al., 1998). V oblasti čepičky se při iniciaci transkripce váží proteiny eif4 (tzv. cap binding proteins). Obrácený 7-methylguanosin je rozpoznán a vázán faktorem eif4e na něj je 34
vázán eif4g tvořící tzv. lešení (scaffold) mezi eif4e a dalšími proteiny. Pro iniciaci translace je také vyžadována vazba eif4g na PABP (polya binding protein), který je vázán na polya úsek. Nepřímou interakcí mezi eif4e a PABP přes eif4g je docíleno translace jen mrna s připojenou čepičkou a polya úsekem, tedy jen těch, které mají úplnou délku. Faktory eif4a a eif4b rozplétají za hydrolýzy ATP případné sekundární struktury na začátku mrna (Kozak, 1999). Díky afinitě eif3 k eif4g je komplex 43S s eif2 trna-met připojena na začátek mrna. Takto vytvořená struktura se nazývá preiniciační komplex (Obr. 4). Malá podjednotka ribozomu pak skenuje prostřednictvím neseného antikodonu trna zaváděcí sekvenci mrna (tzv. leader) a hledá startovací kodon AUG. Jakmile je vhodné AUG nalezeno, připojuje se faktor eif5, který zprostředkuje hydrolýzu GTP na eif2 a následně dochází k uvolnění všech eukaryotických translačních faktorů a připojení 60S podjednotky na 40S a vytvoření iniciačního komplexu, což je funkční 80S ribozom. Translace přechází do fáze elongace nasednutím další komplementární trna a vytvořením peptidové vazby mezi methioninem a jí nesenou aminokyselinou. Protein eif2b nazývaný také faktor vyměňující guanin zprostředkovává výměnu GDP za GTP na faktoru eif2, který po této výměně opět váže trna-met, přenáší jej na další komplex 43S a celý proces iniciace translace se opakuje. Obr. 4 Schéma struktury preiniciačního komplexu (převzato z Robaglia and Caranta, 2006). Po nalezení kodonu AUG, dochází k vytvoření 80S ribozomu a následně k prodlužování peptidu. 35
3.4.3 Molekulární mechanismus rezistence k PSbMV Rostlinné viry vyžadují pro plný průběh svého infekčního cyklu spolupráci buněčných komponent hostitelské rostliny. Úspěšné zvládnutí translace polyproteinu PSbMV je založeno na neschopnosti rostliny rozeznat virovou RNA od své vlastní mrna a zamezit tak syntéze bílkovin virového patogena. Recesivní rezistence k potyvirům, tak jak je známa u např. hrachu a PSbMV (sbm-1, sbm-2), vychází z mutací způsobujících chybějící interakci mezi rostlinou a virem (Diaz-Pendon et al., 2004). Na 5 -konci PSbMV RNA je napojen (35 kda) VPg protein, který plní mimo jiné funkci čepičky při translaci virového polyproteinu. Tento protein byl také označen za determinantu virulence u PSbMV patotypů P1, P3 a P4 (Johansen et al., 2001). Při iniciaci translace je VPg rozeznán rostlinným eif4e jako čepička a dochází k translaci virové RNA. Pokud je alela eif4e mutovaná (sbm-1) v tzv. "oblasti vázající čepičku" (cap binding pocket), nedochází k jejímu navázání na VPg a polypeptid nemůže být vytvořen, protože nedojde k úspěšnému složení ribozomu (Obr. 5). Zároveň s tímto zjištěním byly identifikovány mutace vedoucí ke změnám v terciární struktuře eif4e a jeho nová funkce v šíření viru mezi buňkami. Tato nová funkce není zatím detailně popsána, pravděpodobně je však virová RNA pomocí faktorů eif4e a eif4g naváděna např. za pomocí mikrotubulů (Bokros et al., 1995) k plasmodesmatům, kterými může procházet do sousedních buněk (Gao et al., 2004b). Obr. 5 3D model eif4e hrachu podle Guo et al., 2004b. Barva proteinu postupně přechází od bledě modré (N-terminální doména) až k sytě červené (C-terminální doména). Mezi W75 a W121se nachází oblast vázající čepičku, pozice asociované s rezistencí jsou zvýrazněny žlutě(62, 74, 107 a 169), resp. fialově(73). 36
U rezistence zprostředkované lokusem sbm-2, je determinantou virulence protein P3 (Johansen et al., 2001; Hjulsager et al., 2006), konkrétně jeho N-terminální část. Blízkost lokusu sbm-2 a eif4eiso naznačuje, že P3 a eif4eiso spolu interagují podobně jako VPg a eif4e, přestože zatím nebyly popsány rozdíly mezi rezistentní a sensitivní alelou pro eif4eiso. 37
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 4.1.1 Rostlinný materiál Semena a listy hrachu byla získána z genofondových kolekcí United States Department of Agriculture, USA (USDA - Germplasm resource identification network, http://ww.grin.org), John Innes Centre UK (JIC, http://www.jic.ac.uk) a Agritec Šumperk (EVIGEZ systém - http://genbank.vurv.cz/genetic/resources/). Seznam analyzovaných položek doplněný o základní informace je uveden v tabulce č.1. Tab. 1 Seznam položek Označení Název/druh Původ Charakteristika Popsaná rezistence PI 618629 VR 74-410-2 New Season x P.I. 193835 kultivar sbm-1,2 W6 17516 Dark Skin Perfection výběr z NO 5147 DSP kultivar SBM-1/sbm-2 PI 471187 Bonneville Indie kultivar SBM-1/sbm-2 PI 269818 Aa 134 Velká Británie kultivar sbm-1,(2),3 PI 269774 Sankia Velká Británie kultivar SBM-1/sbm-2 W6 15165 Marx 088 USA kultivar sbm-1 PI 193586 No 8720 Etiopie krajová odrůda sbm-1 PI 347494 PLP 93 Indie krajová odrůda sbm-1 PI 347484 T. 19 Indie krajová odrůda sbm-1, sbm-2 ATFC-6927-2 Wan Dou Čína krajová odrůda - ATFC-6927-1 Wan Dou Čína krajová odrůda - ATFC-7173-4 Huang Wan Dou Čína krajová odrůda - ATFC-7173-1 Huang Wan Dou Čína krajová odrůda - JI 1974 P. abyssinicum Etiopie planý/polokulturní - JI 1006 P. fulvum Izrael planý druh - 38
4.1.2 Roztoky a média 1) LB médium (na 1 l) - 10 g trypton - 5 g kvasničný extrakt - 5 g NaCl - 1 ml 1 N NaOH - sterilizace 30 minut při 120 ºC. - pro tuhé médium bylo přidáno před sterilizací 15 g agaru - po ochlazení na 60 C přidat na 1ml LB 1µl zás. roztoku ampicilinu 2) SOB (na 1 l) - 20 g trypton - 5 g kvasničný extrakt - 0,5 g NaCl - 0,186 g KCl - sterilizace 30 minut při 120 ºC 3) SOC (na 1 l) - K SOB médiu přidáno: - 5 ml 2M MgCl 2-20 ml 1M glukózy 4) Zásobní roztok ampicilinu - 100 mg/ml ampicilinu ve vodě - skladováno při 20 ºC 39
5) 50 x TAE (1 litr) - 242 g TRIS báze - 57,1 ml ledové kyseliny octové - 100 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) - 1x TAE pufr byl získán padesátinásobným zředěním 50 x TAE 6) 10 x TBE (1 litr) - 108 g TRIS báze - 55 g kys. borité - 40ml 0,5 M EDTA (ph 8.0) - 1 x TBE pufr byl získán desetinásobným zředěním 10 x TBE 7) Nanášecí pufr - 20% FICOL - 0,05% bromfenolová modř 8) Zásobní roztok ethidium bromidu - vodný roztok 10 mg/ml 40
4.2 Metodika 4.2.1 Izolace genomové DNA Genomová DNA byla izolována z jednotlivých suchých semen nebo mladých listů rostlin hrachu pomocí komerčního kitu Invisorb Spin Plant Mini Kit (Invitek, Německo) a bylo postupováno podle přiloženého protokolu. K izolaci bylo podle dostupnosti dané položky použito buďto 50 mg suchého drceného semene nebo cca 100 mg čerstvých listů. Homogenizace rostlinného materiálu byla provedena špachtličkou buď po zmrazení v tekutém dusíku, nebo za pokojové teploty s pomocí křemičitého písku. Izolace DNA touto metodou je soubor centrifugačních kroků zahrnujících lyzi buněk, navázání DNA na křemíkovou membránu v kolonce, promývání kolonky a eluci, přičemž pro každý krok je dodáván zvláštní pufr. Eluce byla provedena dodaným elučním pufrem (10mM Tris-HCl, ph 8.5) v objemu 200-300 µl a takto získaná DNA byla uchovávána při -18/ -20 C. 4.2.2 Agarózová elektroforéza Koncentrace DNA byla stanovována horizontální gelovou elektroforézou (Omni- Bio, CZ). K přípravě 1,5 % gelu bylo použito agarózy (Bioline, Velká Británie) a 1 x TAE (popř. TBE) pufru. Pro rozpuštění agarózy byla směs byla přivedena k varu, po zchladnutí směsi na cca 60 C byl přidán zásobní roztok ethidium bromidu tak, aby výsledná koncentrace EtBr byla 0,00002 %. Separace probíhala 30-45 minut při 75-120 V, poté byl gel nasnímám pomocí GDS s UV transluminátorem (Vilber Lourmat, Francie). Velikost a koncentrace separované DNA byly stanovovány dle porovnání s molekulárním markerem Quick-load 100bp DNA Ladder (New England Biolabs, Velká Británie) a 1kb DNA Ladder (Invitrogen, Německo) (Obr. 6). 41
A B Obr. 6 Použité velikostní markery. A - Quick load 100bp DNA ladder(new England Biolabs) -velikostní a hmotnostní marker B - 1kb DNA ladder - pouze velikostní marker 4.2.3 PCR amplifikace fragmentů eif4e(iso) genu Na základě cdna sekvencí eif4eiso uložených v NCBI databázi (DQ778078.1, DQ778077.1, DQ778076.1) bylo podobně jako v předchozím případě eif4e genu (Smýkal et al., 2010) navrženy primerové kombinace. Pro jednodušší manipulaci byly úseky genomové sekvence eif4e(iso) amplifikovány odděleně dvěmi páry primerů. První pár oligonukleotidů eif4eiso-f (5 -ATATGGCAACAACAGAACCACTCG-3 ) a eif4eiso- MR (5 -CACTGGCGTACACTCGCAACTACAC-3 ) byl navržen k amplifikaci fragmentu od iniciačního tripletu ATG (vyznačeno tučně) až po 457. nukleotid část označená jako 1/2. Druhý pár primerů eif4eiso-mf (5 -GTGTAGTTGCGAGTGTAC- GCCAGTG-3 ) a eif4eiso-r (5 -TTACACAGTGTATCGAGCCTTTGC-3 ) byl navržen pro amplifikaci zbývající části genu od 433. nukleotidu po terminační triplet TAA část 2/2. Primery eif4eiso-mr a eif4eiso-mf jsou komplementární a nasedají na stejné místo, bylo tedy nutno ověřit zda tato oblast neobsahuje polymorfní sekvence. Pro tento účel byl navrhnut třetí pár primerů - eif4eiso_2f nasedající na 322.-349. nukleotid (5 - GAGGAAAGTGGACTCTCACCAGCAAAGG-3 ) a eif4eiso_3r nasedající na 487.- 42
511. nukleotid (5 -ATCTGAACAGACTCATTTGCTGC-AG-3 ). Těmito dvěmi primery byl amplifikován fragment označený C (center). Amplifikacemi je tedy zajištěno pokrytí celého genu(viz Obr.7 a tab. 2). Primery byly navrženy pomocí programu FastPCR (Kalendar et al., 2009) a syntetizovány firmou Generi Biotech (CZ). 5 -ATATGGCAACAACAGAACCACTCG-3 GAAATATGGCAACAACAGAACCACTCGTCGAAGGCTCCACGGCAGAGGAAGTGGCGGCGGTGCCAGTTCCG GCACCGGAGGTAGGGTTAAAGCACAAACTAGAAAGAAGATGGACTTTCTGGTTCGATAACCAATCCAAACC TAAACAAGGCGCTGCCTGGGGAACCACTCTTCGCAAAGTTTACAGCTTCGACACCGTCGAAGAGTTCTGGT GTTTGCATGATCAGATATTCAAGCCCAGCAAGTTGCCTGGCAATGCTGATTTTCACTTGTTCAAGGATGGG 5 -GAGGAAAGTGGACTCTCACCAGCAAAGG-3 GTTGAACCGAAGTGGGAAGATCCGTTGTGTGCCAGTGGAGGAAAGTGGACTCTCACCAGCAAAGGGAAGGG CAATCTTGATACCATGTGGCTTGAAACTTTGATGGCTTTAATTGGGGAGCAATTTGGAGATTCCGAGGATA 5 -GTGTAGTTGCGAGTGTACGCCAGTG-3 TTTGTGGTGTAGTTGCGAGTGTACGCCAGTGGCAGGATAAACTTTCGCTGTGGACTAAAACTGCAGCAAAT 3 -CACATCAACGCTCACATGCGGTCAC-5 3 -GACGTCGTTTA GAGTCTGTTCAGATGAGCATCGGAAGGAAGTGGAAGGAAATCATTGATGTTAGCGACAAGATGACATATAA CTCAGACAAGTCTA-5 CTTTCATGAAGATGCTAAAACTCGAGGTGCAAAGGCTCGATACACTGTGTAA 3 -CGTTTCCGAGCTATGTGACACATT-5 Obr. 7 Oranžově je zobrazena cdna sekvence eif4eiso Pisum sativum L., kultivary Brutus, Dark Skinned Perfection a Bonneville (sekvence je 100% identická u všech tří položek), zveřejněná v GenBank NCBI, pod identifikačními kódy položek DQ778076-8.1. Modře je v této sekvenci zvýrazněn iniciační triplet ATG, červeně terminační triplet TAA. Sekvence oligonukleotidů jsou přiřazeny k této sekvenci v místě nasedání, a obarveny: eif4eiso-f (fialová), eif4eiso-mr (modrá), eif4eiso-mf (zelená), eif4eiso-r (hnědá), eif4eiso_2f (růžová) a eif4eiso_2r.(černá). Tab. 2 Seznam primerů Primer Sekvence Pozice Tm( C) nt eif4eiso-f 5 -ATATGGCAACAACAGAACCACTCG-3 4->27 50,6 24 eif4eiso-r 5 -TTACACAGTGTATCGAGCCTTTGC-3 595<-620 50,6 24 eif4eiso-mr 5 -CACTGGCGTACACTCGCAACTACAC-3 433<-457 55,9 25 eif4eiso-mf 5 -GTGTAGTTGCGAGTGTACGCCAGTG-3 433->457 55,9 25 eif4eiso-2f 5 -GAGGAAAGTGGACTCTCACCAGCAAAGG-3 322->349 62,6 28 eif4eiso-3r 5 -ATCTGAACAGACTCATTTGCTGCAG-3 487<-511 57,4 25 PCR byla provedena na thermocyklerech Quanta Biotech (Velká Británie) a Eppendorf (Německo), teplotní profil a složení reakční směsi je uvedeno v tabulce 3 a 4. 43
Tab. 3 Teplotní profil PCR reakce. Krok Teplota Čas Počet cyklů Počáteční denaturace 95 C 5 min 1 Denaturace 94 C 30 s Nasedání primerů 55 C 30s 32 Elongace 72 C 1 min 20s Finální Elongace 72 C 10 minut 1 Tab. 4 Složení reakční směsi. Reagencie Množství na reakci (µl) Ultračistá voda 18,1 5X Green GoTaq Reaction Buffer (Promega, USA) 5 dntps (10mM) 0,2 Forward primer (10 mm) 0,5 Reverse primer (10 mm) 0,5 GoTaq DNA Polymeráza 5U/µl (Promega) 0,2 Templátová genomová DNA 0,5 Celkem 25 4.2.4 Purifikace PCR produktů Amplifikované fragmenty byly po separaci elekroforézou na agarózovém gelu vyřezány sterilním skalpelem. K purifikaci PCR produktů byl použit Invisorb Spin DNA Extraction kit (Invitek) a postupováno bylo podle návodu s výjimkou eluce, kdy byla namísto dodaného elučního pufru použita deionizovaná voda, nahřátá na 65 C v objemu 20-30 µl. 4.2.5 Klonování PCR produktů 4.2.5.1 Ligace Purifikované PCR produkty 1/2 a 2/2 byly klonovány do vektorových plazmidů pgem -T Easy (Promega pgem -T Easy Vector System) a pjet 1.2 (Fermentas CloneJet TM ). Mapy obou plazmidů jsou znázorněny na obrázku č. 8. Před ligací do pjet 44
1.2 bylo ještě nutno enzymaticky odstranit adeninové přesahy na 3 -koncích PCR produktu přidané Taq polymerázou, neboť u tohoto vektoru dochází k ligaci tupých konců. Tato reakce probíhala 5 minut při 70 C, až poté byl přidán linearizovaný vektor pjet 1.2 a T4 DNA ligáza. U pgem -T Easy se tento krok neprovádí, protože tento vektor obsahuje na 5 -koncích přesahující nukleotidy thyminu a dochází tak k ligaci na tzv. lepivé konce. Samotná ligační reakce obsahovala chemikálie uvedené v tabulce 5 a probíhala 24 hodin při 4 C. Po dokončení byl reakční mix opět přečištěn (ligační pufr obsahuje soli, které brání elektroporaci) pomocí Invisorb Fragment CleanUp (Invitek). Polovina získané DNA byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli TOP 10 (Sambrook et al., 1989) a zbytek byl za účelem kontroly efektivnosti ligace rozdělen elektroforézou. Obr. 8 Mapy vektorů pgem -T Easy (vlevo) a pjet 1.2 (vpravo). Oba vektory obsahují gen (Amp r, resp bla Ap R ) kódující enzym β-laktamázu zodpovědnou za rezistenci k antibiotiku ampicilinu, pro jednoduchou selekci, dále počátek replikace (ori, resp. rep pmb1), a klonovací místo (polylinker) umístěné u pgem -T Easy v genu lacz (enzym β-galaktosidáza katalyzující odštěpení galaktosidu z X-gal, zbytek se oxiduje a vzniká modré zbarvení), u pjet 1.2 v genu eco471r (restrikční endonukleáza štěpící DNA). Pokud je insert ligován ve vektoru jsou tyto geny insertem přerušeny a tedy nefunkční (u pgem -T Easy vznikají bílé kolonie namísto modře zabarvených kolonií s vektorem bez insertu, přerušením eco471r u pjet jsou buňky s tímto plazmidem schopny přežít, u buněk bez insertu vzniká funkční protein eco471r, dochází k restrikčnímu štěpení DNA a usmrcení bakterie. Pro kontrolu správné délky inzertu obsahují oba plazmidy specifická místa pro nasedání primerů (T7, SP6 pgem, pjet1.2 forward a reverse primer pjet1.2) 45
Tab. 5 Složení ligační reakce. Reagencie Množství (µl) Reagencie Množství (µl) Ultračistá voda 2 Ultračistá voda 1,5 2X Rapid Ligation Buffer 5 DNA blunting enzyme 0,5 pgem -T Easy Vector, 50ng/µl 0,5 2X Reaction Buffer 5 T4 DNA Ligáza 0,5 Vektor pjet 2.1, 50ng/µl 0,5 PCR produkt 2 T4 DNA Ligáza 0,5 Celkem 10 PCR produkt 2 Celkem 10 4.2.5.2 Transformace elektrokompetentních buněk E. coli K transformaci byla použita polovina (5 µl) purifikovaného ligačního mixu, která byla přidána k 80 µl elektrokompetentních buněk E. coli kmene TOP 10 uchovávaných v hlubokomrazícím boxu při -70 C. Takto připravená směs byla důkladně promíchána a přenesena do elektroporační kyvety a elektroporována při 12,5 Kv/cm, 25 µf a 400 Ω. (elektroporátor EquiBio) Poté byl přidán 1 ml SOC médium a směs byla přenesena do větší 15 ml plastové zkumavky, ve které byla kultivována na orbitální třepačce 30 minut při 37 C a 60 rpm (Ekom). 4.2.5.3 Výsev E. coli na selekční médium LB médium s agarem bylo po sterilizaci ochlazeno na teplotu cca 60 C, byl do něj sterilně přidán ampicilin (100µg/ml). 10-20 ml tohoto selekčního média bylo nalito do petriho misek o průměru 9 cm. Po ztuhnutí média bylo na misky vyseto vždy 150 µl bakteriální suspenze (SOC) a rozetřeno sterilní skleněnou tyčinkou. Pro každou analyzovanou položku byla takto vyseta jedna petriho miska. Kultivace na miskách se selekčním médiem probíhala přes noc dnem vzhůru při 37 C v inkubačním boxu (). 4.2.5.4 Screening kolonií E. coli Přes noc narostlé kolonie E. coli bylo nutno otestovat na přítomnost inzertu o správné velikosti. Byla proto provedena PCR amplifikace přímo z narostlých kolonií s primery T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') a SP6 (5'-ATTTAGGTGACACT- 46
ATAGAA-3') v případě použití vektoru pgem -T Easy. Pro plazmid pjet1.2 byly použity oligonukleotidy pjet1.2 forward sequencing primer (5 -CGACTCACTA- TAGGGAGAGCGGC-3 ) a pjet1.2 reverse sequencing primer (5 -AAGAACATCGA- TTTTCCATGGCAG-3 ). Na každé misce bylo označeno 5 kolonií a tyto byly sterilním bambusovým párátkem přeneseny nejprve na nové tuhé médium s ampicilinem v petriho misce a poté bylo párátko namočeno do označené PCR zkumavky s master mixem (Sambrook et al., 1989). Zkumavky byly po odstranění párátek uzavřeny, vloženy do termocykleru a zde proběhla PCR amplifikace. Teplotní průběh PCR a složení master mixu jsou uvedeny v tabulkách 6 resp. 7. Tab. 6 Teplotní profil PCR reakce. Krok Teplota Čas Počet cyklů Počáteční denaturace 95 C 3 min 1 Denaturace 94 C 15 s Nasedání primerů 60 C 30s 30 Elongace 72 C 1 min 30s Finální Elongace 72 C 10 minut 1 Tab. 7 Složení master mixu. Reagencie Množství na reakci (µl) Ultračistá voda 18,1 5X Green GoTaq Reaction Buffer (Promega) 5 dntps (10mM) 0,2 Forward primer (10 mm) 0,5 Reverse primer (10 mm) 0,5 GoTaq DNA Polymeráza 5U/µl (Promega) 0,2 Templátová DNA buňky E.coli - Celkem 24,5 Po proběhnutí PCR bylo 4,5 µl reakce rozděleno elektroforézou na 1 % agarózovém gelu pro určení správné délky inzertu. U fragmentů označovaných 2/2 (druhá část genu bližší k 3 -konci) bylo zbylých 20 µl purifikováno kitem Invisorb Fragment CleanUp (Invitek) a provedeno štěpení restrikční endonukleázou Alu I (TAKARA, Japonsko) pro 47
ověření sekvence (složení reakce tabulka 8). Restrikční štěpení probíhalo 2 hodiny při 37 C, poté byly vzniklé fragmenty ověřeny 1,5 % agarózovou elektroforézou. Tento postup byl proveden a opakován dokud nebylo dosaženo alespoň jedné pozitivně testované kolonie pro každou položku. Tab. 8 Složení štěpící reakce Reagencie Množství v reakci (µl) Purifikovaný PCR produkt 31 10x L Buffer (TAKARA) 3,5 Alu I, 3U/µl (TAKARA) 0,5 Celkem 35 4.2.6 Izolace plazmidů z rekombinantních E. coli Pozitivně otestované kolonie na přítomnost fragmentů genu eif4eiso, byly sterilní špičkou či bambusovým párátkem inokulovány do 3 ml tekutého LB média s ampicilinem (100µg/ml) v 15 ml plastové zkumavce a kultivovány přes noc na orbitální třepačce při 37 C a 60 rpm (Ausubel et. al., 1992). Bakteriální pelety jednotlivých kultur byly získány centrifugací 5 minut při 6000 g a dále byl pro izolaci plazmidů použit kit GeneJet TM (Fermentas, Kanada). Izolace plazmidů pomocí tohoto kitu je založeno na metodě alkalické denaturace (Birnboim and Dolly, 1979). Po resuspendování peletu v pufru s RNázou, byl přidán postupně lyzační a neutralizační pufr. Poté byl takto vzniklý buněčný extrakt centrifugován a supernatant použit pro další centrifugační krok sloužící k navázání DNA na křemičitou membránu v kolonce. Kolonka byla poté promývána dodaným promývacím pufrem a v posledním kroku byla plazmidová DNA eluována 50µl elučního pufru (10mM Tris-HCl, ph 8.5). Kontrola izolovaných plazmidů byla provedena na 1,5 % agarózové elektroforéze, a vzorky byly před sekvenací uchovávány při -18/-20 C. 4.2.7 Sekvenování Sekvenování plazmidů probíhalo komerčně Sangerovou dideoxynukleotidovou metodou (asymetrická PCR se značenými terminátory) s využitím produktu BigDye 48
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) a ABI Prism sekvenátorů (Applied biosystems, USA) v Laboratoři sekvenace DNA, PřF UK Praha, a u firmy Macrogen (Korea) pomocí primerů T7 a SP6 (pgem-t) nebo pjet1.2 forward/reverse sequencing primer (pjet1.2), tedy z obou směrů. Po vyzkoušení byly některé fragmenty eif4eiso 1/2 (po ověření dobré koncentrace) a fragmenty C sekvenovány přímo jako PCR produkty, tedy bez předchozího klonování ve vektoru a to primery eif4eisof, eif4eisomr (1/2) a eif4eiso_2r (C). U fragmentů eif4eiso 2/2 se nedalo k tomuto urychlení přistoupit, neboť získané sekvence byly u většiny položek nejednoznačné. 4.2.8 Bioinformatická analýza DNA sekvencí Kontrola jednoznačnosti a editace sekvencí ve formátu.ab1 byla provedena v programu Sequence scanner 1.0 (Applied biosystems, USA). Sekvence antisense vláken byly převedeny do sense orientace pomocí volně dostupné aplikace FastPCR (Kalendar et al., 2009). Dále byly sekvence ručně převedeny do FASTA formátu v programu MS Word. Pro vytvoření mnohonásobného přiřazení DNA sekvencí (tzv. multiple alignment) - důležitého zejména pro zjištění hranic exon/intron, bylo použito softwaru ClustalX (Larkin et al., 2007) nebo online programu MAFFT (Katoh et al., 2005). Pro převod DNA sekvencí do primární sekvence polypeptidu byla použita aplikace Translate umístěná na ExPASy proteomics server (Gasteiger et al., 2003). 49
5 VÝSLEDKY 5.1 Izolace genomové DNA Na agarózový gel bylo naneseno 5 µl izolované DNA. Koncentrace DNA byla stanovena odhadem podle velikostního markeru Quick-load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs) a to v rozmezí 20-40 ng/µl podle síly signálů jednotlivých položek. Na obr. 9 je 1,5 % agarózová elektroforéza po barvení ethidium bromidem a rozdělení genomové DNA izolované ze suchých semen hrachu. Na tomto obrázku lze kromě nejsilnějšího pruhu označujícího celkovou DNA pozorovat také kratší úseky DNA tento jev se nazývá apoptotický žebřík a krátké pruhy zobrazené na gelu vznikají degradací genomové DNA v důsledku programované buněčné smrti apoptózy. Může se také jednat o zbytky RNA nebo směs obou RNA a DNA štěpené při apoptóze. U vzorků izolovaných z čerstvých listů nebyl tento jev pozorován. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 9 Izolace genomové DNA ze suchých semen hrachu. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum) 50
5.2 PCR Amplifikace fragmentů eif4e(iso) Na gel bylo naneseno 25 µl PCR reakce. Amplifikací části eif4e(iso) 1/2 byl získán fragment o délce cca 800bp. Podle intenzity pruhu o této délce lze odhadnout koncentraci nanesené DNA na cca 500 ng (Obr. 10). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 10 PCR amplifikace fragmentů eif4e(iso) 1/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum), 10 negativní kontrola (voda). Při amplifikaci fragmentu eif4e(iso) 2/2, bylo dosaženo ještě robustnějšího výsledku než při množení části 1/2. Byl amplifikován fragment dlouhý cca 1400bp (u položek P.fulvum je kratší - viz jamka č. 8, obrázek 11) o celkovém množství cca 1 µg. Na obr. 11 lze pozorovat i kratší fragmenty o slabší intenzitě. Toto nespecifické nasedání oligonukleotidů může být vysvětleno např. nízkou zvolenou teplotou pro nasedání primerů, vysokým obsahem Mg 2+ iontů v reakčním pufru, vysokou koncentrací templátové DNA či polymerázy v reakci. 51
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 11 PCR amplifikace fragmentů eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum), 10 negativní kontrola (NK). Amplifikací fragmentu eif4e(iso) C byl získán produkt o délce cca 300bp, v koncentraci přibližně stejné jako eif4e(iso) 1/2, tedy 500 ng (Obr. 12). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 12 PCR amplifikace fragmentů eif4e(iso) C. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum), 10 negativní kontrola (NK). 52
5.3 Purifikace PCR produktů Na gel bylo naneseno 5 µl, z celkových eluovaných 40 µl purifikovaného PCR produktu vyřezaného z gelu. U fragmentu eif4e(iso) 1/2 byla tedy koncentrace přečištěného produktu odhadnuta na 10-15 ng/µl, účinnost purifikace byla v tomto případě 80% (Obr.13). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 13 Purifikace fragmentů eif4e(iso) 1/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum). Fragmenty eif4e(iso) 2/2 měly po purifikaci výslednou koncentraci 20-25 ng/µl, efektivita purifikace se tedy pohybovala okolo 90% (Obr. 14). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 14 Purifikace fragmentů eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum). 53
Purifikované fragmenty eif4e(iso) C podrobené agarózové elektroforéze jsou zdokumentovány na Obr. 15. Koncentrace purifkované DNA byla cca 15 ng/µl, což odpovídá efektivitě purifikace okolo 90%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 15 Purifikace fragmentů eif4e(iso) C. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum). 54
5.4 Klonování PCR produktů Měření účinnosti ligace pomocí separace ligační reakce na agarózovém gelu není příliš přesné, protože je složité rozlišit délkové rozdíly mezi prázdným vektorem a vektorem s inzertem. Proto elektroforéza posloužila pouze pro základní orientaci. Ačkoliv se obr. 16 může jevit jako nepřehledný kvůli vysokému počtu fragmentů, je z něj patrné, že ligace proběhla, neboť při nefunkčnosti by měly být na gelu patrné pouze fragmenty dva (vektor a PCR produkt). Nejdelší fragment na gelu je s největší pravděpodobností vektor s inzertem (označeno šipkou). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 16 Ligace eif4e(iso) 2/2 do vektoru pjet1.2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S), 3 - ATFC 7173-4(S), 4 - ATFC 6927-1(R), 5 - ATFC 7173-1(R), 6 - PI 347494, 7 - PI 347484, 8 - JI 1006 (P. fulvum), 9 - JI 1974 (P. abyssinicum). Po transformaci elektrokompetentních buněk E. coli, vysetí na selekční médium a kultivaci přes noc kdy na každé misce narostlo přes noc 50-100 kolonií, následně probíhaly PCR na vybraných koloniích. U plazmidu pjet1.2 byla testována přítomnost inzertu eif4e(iso) 2/2 přibližně jedna kolonie z desíti, u pgem-t byla situace nepatrně lepší (30% úšpěšnost). Ostatní kolonie obsahovaly kratší inzerty nebo byly prázdné (Obr. 17). Nízká efektivita zisku pozitivních transformantů může být vysvětlena nízkou koncentrací PCR produktu v ligační reakci, nebo tvorbou sekundární struktury inzertu. 55
Krátké klonované inzerty mohly vniknout nalámáním DNA při manipulaci v UV transiluminátoru. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Obr. 17 PCR screening kolonií (s vektorem pjet) na inzert eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1 a 32-1kb DNA Ladder(Invitrogen), 2-6 Kolonie ATFC 6927-2(S), 7-11 ATFC 7173-4(S), 12-16 ATFC 6927-1(R), 17-21 ATFC 7173-1(R), 22-26 PI 347494, 27-31 PI 347484, 32 negativní kontrola. Z obrázku je patrné, že pozitivní kolonie byly získány pouze u ATFC 6927-2(S) (jamka 4) a PI 347494 (jamky 24 a 26); krátké klonované úseky např. jamka 8, 12, 21 nebyly sekvenovány. Nakonec však byla získána od každé položky alespoň jedna pozitivně testovaná kolonie s inzertem odpovídající délky (Obr. 18). Při klonování eif4e(iso) 1/2 byla frekvence pozitivních rekombinantů větší, cca 80%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 18 PCR screening kolonií na inzert eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S)-pJet, 3 - ATFC 7173-4(S)-pGEM-T, 4 - ATFC 6927-1(R) -pgem-t, 5 - ATFC 7173-1 (R) -pgem-t, 6 - PI 347494-pJet, 7 - PI 347484-pGEM-T, 8 - JI 1006-pJet, 9 - JI 1974-pGEM-T, 10 NK 56
Ověření správnosti inzertu u části eif4e(iso) 2/2 bylo provedeno pro kontrolu štěpením Alu I endonukleázou. Podle webové aplikace REBsites (s využitím známé sekvence) má restrikční endonukleáza Alu I štěpit PCR produkt na 10 menších fragmentů (o délkách: pgem-t: 459, 261, 226 199, 183, 91, 84, 28, 27, 23, 10; pjet: 444, 247, 226, 199, 183, 91, 84, 27 24, 10), což v podstatě odpovídá obr. 19, až na malé rozdíly, které lze vysvětlit vznikem či zánikem restrikčních míst u některých položek nebo indely (inzercedelece) mezi nimi. Ověření klonovaných fragmentů tedy proběhlo úspěšně a mohlo být přistoupeno k izolaci plazmidů z pozitivně otestovaných kolonií a následnému sekvenování. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 19 Štěpení PCR produktu eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1 - Quick-load 100 bp DNA Ladder (NEB), 2 - ATFC 6927-2(S)-pJet, 3 - ATFC 6927-1(R) -pgem-t, 4 - ATFC 7173-1(R) -pgem-t, 5 - PI 347494-pJet, 6 - PI 347484-pGEM-T, 7 - JI 1006-pJet, 8 - JI 1974-pGEM-T, 9 -PCR fragment eif4e(iso) 2/2 -pjet, 10 - PCR fragment eif4e(iso) 2/2 -pgem. 57
5.5 Izolace plazmidů Po ověření pravosti inzertu byly po kultivaci přes noc v tekutém selekčním médiu s ampicilinem izolovány plazmidy pro sekvenaci. Na 1,5% gel bylo naneseno 5 z celkových 40µl (Obr.20), koncentrace však nemohla být změřena protože velikostní marker neobsahuje údaje o hmotnosti jednotlivých fragmentů. Nicméně podle síly signálu byla koncentrace DNA považována za dostatečnou pro sekvenaci z obou stran, což se později potvrdilo. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Obr. 20 Izolované plazmidy s inzerty eif4e(iso) 2/2. Jamky: 1-1kb DNA Ladder(Invitrogen), 2 - ATFC 6927-2(S)-pJet, 3 - ATFC 7173-4(S)-pGEM-T, 4 - ATFC 6927-1(R) -pgem-t, 5 - ATFC 7173-1(R) -pgem, 6 - PI 347494-pJet, 7 - PI 347484-pGEM-T, 8 - JI 1006-pJet, 9 - JI 1974-pGEM-T 5.6 Sekvenace Po sekvenaci byly všechny získané antisense sekvence obráceny do sense orientace a na základě překryvů byly z jednotlivých částí (1/2, 2/2 a C) sestaveny genomové fragmenty eif4e(iso). Sekvenací byly získány celkové genomové sekvence eif4eiso patnácti položek. Srovnáním s cdna sekvencemi z databáze NCBI (DQ778078.1, DQ778077.1, DQ778076.1) byly zjištěny exonové a intronové části genu (viz příloha 1) a in silico translací exonových částí predikovány sekvence proteinů (viz. příloha 2). Obrázek 21 názorně ukazuje variabilitu délek exonových a intronových částí eif4e(iso) a rozdíly v primárních strukturách proteinů u hrachu a modelových rostlin z čeledi Fabaceae - Lotus 58