PO STOPÁCH BAKTERIÍ V/KOLEM NÁS Jana Spáčilová, UK v Praze, PřF, Katedra buněčné biologie Svět bakterií je nesmírně druhově bohatý a máme ho blíž než před očima. Mikroskopickými metodami můžeme obdivovat škálu tvarů bakteriálních buněk. O kráse barvení ani nemluvě. Malou bakteriální přehlídku ovšem můžeme připravit i molekulárněbiologickými metodami, které nám překvapivě jednoduše prozradí, jak asi vypadá náš osobní bakteriální trávník v ústech, záhybech kůže nebo ostatně kdekoli jinde vás napadne. Na úrovni DNA lze snadno podle sekvence ověřit s jakým organismem máme tu čest. K tomu je nutné mít čistou kulturu daného druhu, aby bylo možné vyizolovat čistou DNA. Ale pokud před námi leží ve vzorku pestrá směs bakterií, jedná se o zajímavý detektivní úkol. Při našem pátrání bychom neměli zapomenout na žádný druh. Prokaryotická 16S ribozomální RNA je univerzálním chronometrem napříč evolucí organismů - je univerzálně přítomná a všude plní stejnou funkci (můžeme předpokládat stálou mutační rychlost), je konzervovaná a má ideální délku pro studium (sekvenování). Při studiu složitých mikrobiálních vzorků např. z půd se používají univerzální primery pro zmnožení 16S rdna všech bakterií, které se ve vzorku nacházejí. To nám umožňují konzervované úseky DNA, kam nasedají navržené primery. Následně se pomocí sekvenování zjišťuje diverzita bakterií v místě odběru vzorku, což je možné jen proto, že sekvence DNA, která leží mezi místy nasedání primerů, se u jednotlivých druhů liší. Přesné druhové složení lze zjistit jen sekvenováním. Podíváme se, jak se liší zastoupení bakterií ve vašich ústech oproti mezizubním prostorům nebo na kůži na těle. A jak se zastoupení na těchto místech liší i mezi vámi navzájem. Nezjistíme, jaké je přesné druhové složení bakterií na našem těle. Ale budeme schopni rozlišit, že na různých místech těla je osídlení bakteriemi různé a že se společenstva jednotlivců mohou navzájem mírně nebo i více odlišovat. Toto porovnání nám umožní enzymy, tzv. restrikční endonukleázy, které v sekvenci DNA rozpoznají konkrétní (restrikční) místo, které umějí rozštěpit. Z jedné dlouhé molekuly DNA rázem vzniknou dvě nebo více kratších. Pokud budeme mít ve dvou zkumavkách různé směsi DNA (s různým počtem restrikčních míst), získáme štěpením restrikční endonukleázou dvě různé směsi různě dlouhých molekul DNA. Takové směsi můžeme porovnat vizuálně roztříděním kousků DNA podle velikosti v elektrickém poli. Blok I: Amplifikace bakteriální 16S rdna 1) Příprava PCR mixu pro amplifikaci 16S rdna: Pipetujeme vždy několik reakcí dohromady v daném pořadí a směs rozdělíme do jednotlivých mikrozkumavek (25 µl do každé). PIPETUJTE OPATRNĚ, NENAMÁČEJTE ŠPIČKU Z JEDNOHO ROZTOKU DO DRUHÉHO! Vždy si vezměte novou špičku. Špičku při přidávání roztoku vždy ponořte
pod hladinu ve zkumavce tak, abyste si byli skutečně jisti, že máte vše v reakci, ale zároveň dávejte pozor, abyste namáčeli pouze špičku a ne pipetu. Na jednu reakci je potřeba (vynásobte 2x počtem studentů): PCR pufr 2,5 µl (10x) DMSO 0,5 µl dntp 0,25 µl (2,5mM každý) primer F 0,25 µl (0,1mM) primer R 0,25 µl (0,1mM) PCR voda 21 µl DNA polymeráza 0,15 µl (5 U/µl) 2) Provedeme bukální stěr nebo stěr plochy zubu silně, ale ne do krve stíráme párátkem vnitřní stranu tváře nebo plošku zubu, párátko se zachycenými buňkami opláchneme v PCR reakci v první zkumavce. Do párátka se malý objem reakce vsákne, ale pro další pokusy bude směsi dostatek. Pozn. Bukální stěr obsahuje množství epiteliálních buněk z vnitřní strany tváře. Bakteriální buňky, které máme v ústech, plavou i volně a mohli bychom je zachytit i ze slin. Nejvíce bakterií ale žije uchycených na buňkách sliznic (obr. 1, viz příloha). V našem případě nám kontaminace vlastní eukaryotickou DNA nevadí. 3) Provedeme stěr z podpaží vatovou tyčinku otřeme o kůži v podpaží. Z tyčinky (předem opálenou) pinzetou oddělíme několik povrchových vláken a přeneseme je do druhé zkumavky s PCR reakcí. Vatové tyčinky se ničím jiným nedotýkáme! 4) Zkumavky umístíme do PCR cycleru, kde nastavíme program amplifikace DNA (Tab.1): Tabulka č.1: PCR program pro amplifikaci 16S rdna primery 27F a 1492R teplota( C) čas (min) 35x 94 5:00 94 1:00 58 0:30 68 2:00 68 7:00 15 5) Celková doba programu je 2 hodiny. Blok II. Restrikční analýza připravených fragmentů 1) Pro každý ze vzorků připravíme tři mikrozkumavky 1,5ml a 2x 0,5ml (budeme tedy mít 3 x 2 zkumavky), protože naše vzorky budeme štěpit dvěma různými restrikčními endonukleázami. Z připravených PCR reakcí připravíme nové mixy: PŘI PIPETOVÁNÍ JE NAPROSTO NEZBYTNÉ, ABY CELÁ SMĚS SKONČILA V JEDNÉ KAPIČCE (IDEÁLNĚ NA DNĚ ZKUMAVKY)! Můžeme ji stáhnout špičkou nebo sklepnout v zavřené zkumavce.
Směs s RsaI pipetujeme do 1,5ml mikrozkumavky, pro TaqI a směs RsaI+TaqI do 0,2ml mikrozkumavky. PCR reakce 6,5 µl TANGO pufr 1 µl PCR voda 2 µl RsaI (TaqI) 0,3 µl (5 U/µl) Tabulka č. 2: Vzorky a restriktázy pro restrikční analýzu 1. bukál (RsaI) 2. kůže (RsaI) 3. bukál (TaqI) 4. kůže (TaqI) Pozn.: Můžeme štěpit i dvěma restriktázami, v tomto případě do 0,2ml mikrozkumavky napipetujeme reakci s RsaI a po 30 minutách inkubace přidáme 0,3 µl TaqI. 2) Mikrozkumavky s RsaI (1,5ml) umístíme do bločku nastaveného na 37 C. Mikrozkumavky s TaqI a směsí RsaI+TaqI (0,2ml) do cycleru, kde inkubujeme při 65 C po dobu 1 hodiny. Směs RsaI+TaqI inkubujeme v cycleru v 37 C a po 30 minutách přidáme TaqI a teplotu zvýšíme na 65 C a inkubujeme dalších 30 minut. 3) Během restrikce si připravíme 1,5% (hmotnost/objem) agarózový gel. Připravíme si komůrku na nalévání gelu (kraje utěsníme gumou nebo izolepou). Na 50 ml 1,5% agarózového gelu budeme potřebovat 0,75 g agarózy, 10 ml zásobního pufru (5x TBE) a 40 ml vody. Připravíme nejprve 1x TBE pufr, rozvaříme v něm agarózu. Necháme povařit v mikrovlnné troubě tak dlouho (případně opakujeme přivedení do varu a krátký var), aby v gelu neplavaly průhledné vločky agarózy. Mírně zchladíme pod tekoucí vodou. Připipetujeme 5µl roztoku GelRed (nebo 50 µl ethidium bromidu o koncentraci 2 µg/ml). 4) Gel nalejeme do utěsněné komůrky a ihned vložíme hřebínek. Špičkou se pokusíme rozbít bublinky, které se nám vytvořily. KOLEM HŘEBENE NESMÍ BÝT ŽÁDNÉ BUBLINKY. Jamky by protékaly. Pracujeme rychle, než gel začne tuhnout. Tuhnutí trvá cca 15 minut. 5) Z komůrky sejmeme izolepu. Komůrku vložíme do elektroforetické vany, zalijeme 1x TBE pufrem a opatrně (kolmo vzhůru) vyjmeme hřeben. 6) Do jamek opatrně pipetujeme vzorky. Začínáme 4 µl markeru a pokračujeme vzorky, které jsme předem přenesli do loadovacího pufru (pipetu máme nastavenou na 15 µl, do špičky natáhneme odhadem 3 µl loadovacího pufru a zbylý objem natáhneme přímo z reakce). Je dobré si zapsat pořadí vzorků na gelu. 7) Aparaturu zapojíme do zdroje na 100 120V. Po zapojení kontrolujeme, jestli elektroforéza běží (z elektrod stoupají bublinky, viz otázka 7) a jestli běží správným směrem. Kontrolujeme postup vzorků gelem. Dělení fragmentů potrvá zhruba 60 minut. 8) Vypneme zdroj, vyjmeme komůrku s gelem, necháme okapat a přeneseme na zobrazovací UV desku. Při excitaci UV světlem gel vyfotíme. Pokud nemáme fotoaparát, schematicky zakreslíme polohy proužků. Použitý pufr slejeme do lahve, je možné ho recyklovat. Elektroforetickou nádobu a vaničku opláchneme vodou a destilovanou vodou.
OTÁZKY A ÚKOLY: Jak to všechno proběhlo? Podíváme se na naše počínání podrobněji na vzorovém příkladu dvou sekvencí DNA (A - první řádek, B - druhý řádek). Ve směru 5`-3`. Tečkou jsou označeny rozdílné nukleotidy. A1 B1 - CTGCAGCCGT ACTTGCGCCT CATGCGGTTG GACAAGCCCA TTGGTGAGTG CGGGCGGGCG - CTGCAGCCGT ACTTGCGCCT CATGCGGTTG GACAAGCCCA TTGGTGAGTG CGGGCGGGCG A61 - GGCAGCCCGG GAATTGGCCA GTAGCAGCCT CCGAGTCGGC TCCGCGGAGC TGTCCGCGGC.. B61 - GGCAGCCCGG GAATTAGCCA GTAGCAGCCT CCGAGTCGGC TCAGCGGAGC TGTCCGCGGC A121 - GGCCGGCACG GGCGTGATGG AAATGAGAAC CTGAAAGCTT GGGCTTGGCT GCCGGGTGCC B121 - GGCCGGCAGG GGCGTGATGG AAATGAGAAC CTGAAAGCTT GGGCTTGGCT GCCGGGTGCC 1. Pokuste se navrhnout pár primerů o délce 15 bp pro analýzu těchto sekvencí. Označte je v sekvenci a zapište jejich sekvence ve směru 5`-3`. Navrhujte tak, aby mezi oběma primery ležela obě místa, kterými se sekvence liší, a co největší počet míst, které rozeznává restrikční enzym, který máte k dispozici (HaeIII GG/CC, tupé konce). Forward primer (z angl. před ) je komplementární k 5`-konci amplifikovaného fragmentu, nasedá na nekódující vlákno (to, které se nezapisuje). Forward primer má stejnou sekvenci jako kódující vlákno. Reverse primer (z angl. opačný ) je komplementární k 3`-konci amplifikovaného fragmentu, nasedá na kódující vlákno (zapsaná sekvence). 2. Jak dlouhý bude váš PCR produkt? Jak dlouhé budou fragmenty po restrikci pomocí HaeIII v případě: - restrikce sekvence A - restrikce sekvence B - restrikce směsi sekvencí - délka PCR produktu
3. Jak budou vzniklé fragmenty vypadat na gelu poté, co byly elektroforeticky rozděleny? Kde ležela katoda, kde anoda? Zaznačte do obrázku. 300 bp 200 bp 100 bp 80 bp 60 bp Marker PCR prod. restrikce restrikce restrikce... směsi sekvence A sekvence B 4. Víte, proč je dobré přidat ke vzorku ještě loadovací pufr? 5. Proč nám v připravené PCR reakci nevadila kontaminace naší vlastní eukaryotickou DNA? 6. Kolik gramů agarózy, kolik mililitrů TBE pufru (o ředění 5x) a vody budeme potřebovat na přípravu 90 ml 2% agarózového gelu? Kolik µl roztoku GelRed nebo ethidium bromidu (2 µg/ml) budete pro obarvení potřebovat? Ředění GelRed: 10 000x; ethidium bromid: 1 000x.
7. Po zapojení elekroforetické aparatury z obou elektrod začaly stoupat bublinky. O jaké plyny se jednalo? Vznikaly stejné objemy plynů? Jednalo se o stejné plyny? Vysvětlete.
PŘÍLOHA: Obrázek 1. Dlaždicovitá epiteliální buňka bukální sliznice s uchycenými adherentními bakteriálními buňkami typu diplococcus (foto: Jeff Plochocki and John Lennox, Penn State Altoona; Zeiss Axiostar Plus, Carl Zeiss, Germany 2, http://biofilmbook.hypertextbookshop.com/public_version/contents/ appendices/appendix002/pages/page018.html)