Národní referenční laboratoř Strana 1 1 Rozsah a účel STANOVENÍ PŘÍTOMNOSTI GMO METODOU PCR Postup slouží k detekci přítomnosti genetických modifikací/geneticky modifikovaných organismů ve vzorcích krmiv, osiv a kompletních krmných směsí molekulárně biologickou metodou PCR (polymerázová řetězová reakce). Smyslem zkoušek je zjistit, zda zkoumaný vzorek obsahuje GMO či genetickou modifikaci, případně o kterou modifikaci či modifikovanou odrůdu se jedná. 2 Princip Základem metody je izolace DNA z homogenizovaného vzorku, amplifikace hledaného úseku DNA (je-li ve vzorku přítomen) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a vyhodnocení případných amplifikovaných fragmentů pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. 3 Chemikálie Používají se chemikálie analytické čistoty nebo označené pro molekulární biologii. Kity pro izolaci DNA 3.1 NucleoSpin Food, výrobce Macherey Nagel, kit pro izolaci genomické DNA z potravin a krmiv 3.1.1 Lysis Buffer CF. 3.1.2 Buffer C2. 3.1.3 Buffer C3. 3.1.4 Wash buffer CQW. 3.1.5 Wash buffer C5 (koncentrát). 3.1.6 Elution buffer CE. 3.1.7 NucleoSpin Food Columns (plus Collection Tubes). 3.1.8 Proteinase K (lyofilizát). 3.1.9 Proteinase buffer PB. 3.1.10 Collection Tubes (2 ml).
Národní referenční laboratoř Strana 2 3.2 GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit, výrobce Sigma Aldrich, kit pro izolaci genomické DNA z rostlinného materiálu 3.2.1 Lysis solution Part A. 3.2.2 Lysis solution Part B. 3.2.3 Precipitacion Solution. 3.2.4 Binding Solution. 3.2.5 Column Preparation Solution. 3.2.6 Wash Solution Concentrate. 3.2.7 Elution Solution. 3.2.8 GenElute Filtration Columns in Tubes. 3.2.9 GenElute Nucleic Acid Binding Columns in Tubes. 3.2.10 Collection Tubes, 2,0 ml. Kity pro amplifikaci DNA 3.3 REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix with MgCl 2, výrobce Sigma Aldrich, univerzální reakční směs pro PCR (dále REDTaq) 3.3.1 REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix with MgCl 2. 3.3.2 PCR voda. 3.4 REDExtract N-Amp Plant PCR Kits, výrobce Sigma Aldrich, univerzální kit pro PCR (dále REDEx) 3.4.1 Extraction solution. 3.4.2 Dilution solution. 3.4.3 REDExtract N Amp PCR Ready Mix. 3.5 Další potřebné chemikálie nedodávané v rámci kitů 3.5.1 Voda vhodná pro PCR. 3.5.2 Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná). 3.5.3 Amplifikační primery.
Národní referenční laboratoř Strana 3 3.5.4 Ribonuklease A 10 mg/ml (DNase and protease free) RNáza A. 3.5.5 Agaróza pro molekulární biologii. 3.5.6 Etanol denaturovaný 70%, pro čištění povrchů. 3.5.7 Etanol (95 100)% pro UV spektroskopii. 3.5.8 3M octan sodný (ph 5,2). 3.5.9 Trihydrát octanu sodného - CH 3 COONa.3H 2 O. 3.5.10 Ledová kyselina octová. 3.5.11 Na 2 EDTA disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové. 3.5.12 Trizma base. 3.5.13 Hydroxid sodný, NaOH, roztok, c(naoh) = 1 mol/l. Příprava: 10 g NaOH se rozpustí ve vodě (3.5.2), po vytemperování se doplní na výsledný objem 250ml v odměrné baňce. 3.5.14 Bromfenolová modř. 3.5.15 Ethidiumbromid zásobní roztok, 1%. 3.5.16 Elektroforetický marker pro amplifikáty (např. EZ LoadTM Molecular Ruler 50 bp PCR Biorad). 3.5.17 Elektroforetický hmotnostní marker pro genomovou DNA (např. EZ LoadTM Molecular Ruler Precision Mass, Biorad). 3.5.18 Dekontaminační roztok (např. Instruzyme, Steridine,ad.). 3.5.19 Chlornan sodný, (0,5 1)% roztok. 4 Přístroje a pomůcky 1 Laboratorní mlýn. 2 Třecí miska s tloučkem. 3 Váhy s přesností 0,01 g. 4 Analytické váhy. 5 Vodní lázeň. 6 Centrifuga. 7 Vortex. 8 Nízkoobjemový spektrofotometr (vlnové délky 230 nm, 260 nm, 280 nm).
Národní referenční laboratoř Strana 4 9 Laminární box. 10 Minishaker. 11 Termální cykler. 12 ph metr. 13 Elektromagnetické míchadlo s ohřevem. 14 Elektroforetická vana, zdroj napětí, elektroforetické hřebínky. 15 Fotodokumentační zařízení se softwarem. 16 Transiluminátor. 17 Přenosná UV lampa. 18 Automatické pipety s nastavitelnými objemy (0,1 1000) µl a špičky s filtrem i bez filtru. 19 Plastové zkumavky o objemu 0,20 ml, 2 ml, 50 ml. 20 Horkovzdušná sušárna. 21 Vysavač. 22 Výrobník ledu. 23 Lednice 24 Mrazicí box 20 C, 80 C pro dlouhodobé skladování. 25 Latexové rukavice bezpudrové, laboratorní sklo, obalový materiál, svářečka fólií, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby, parafilm, nádoba na uchování ledu. Poznámky 1 Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně (v sušárně 1 h při (115 120) C) nebo chemicky (např. 70% etanolem, (0,5 1)% chlornanem sodným apod.). 5 Pracovní postup 5.1 Příprava amplifikačních primerů Primery se rozpustí, ředí a rozdělí do potřebných množství následujícím způsobem. 1 Zásobní roztok o koncentraci 100 µm Do zkumavky s primerem v podobě prášku na dně, který nemusí být viditelný, se přidá voda (3.5.1) v množství, které uvádí výrobce. Jemným pipetováním se promíchá. Tím se získá
Národní referenční laboratoř Strana 5 zásobní roztok, který se rozpipetuje po 50 µl do zkumavek o objemu (0,5 0,6) ml. Pokud se rozdělí zásobní roztok v jiných množstvích, uvede se objem na zkumavku. Zkumavky s primery se zamrazí a uchovávají při teplotě 20 C. 2 Pracovní roztok o koncentraci 20 µm Do jedné zkumavky zásobního roztoku se přidá čtyřnásobný objem vody (3.5.1). Tím se získá pracovní roztok. Rozdělí se po 15 µl a zamrazí se na 20 C. Do reakční směsi PCR se přidávají pracovní roztoky primerů. 5.2 Příprava 3M octanu sodného Naváží se 40,81 g trihydrátu octanu sodného (3.5.9) na 100 ml vody (3.5.2). Navážka se vmíchá do 80 ml vody (3.5.2). Ledovou kyselinou octovou (3.5.10) se upraví ph na 5,2. Potom se doplní vodou (3.5.2) do 100 ml. Sterilizuje se 15 min při 121 C. 5.3 Příprava zásobního roztoku 50 TAE Příprava 0,5 M zásobního roztoku EDTA Naváží se 186,1 g Na 2 EDTA (3.5.11) na 1000 ml vody (3.5.2). Navážka se vmíchá do (750 800) ml vody (3.5.2). ph se upraví na 8,5 přidáním NaOH. Potom se doplní vodou (3.5.2) do objemu 1000 ml. Přefiltruje se přes filtrační papír vysoké hustoty. Roztok se skladuje do spotřebování při laboratorní teplotě. Příprava 2M Tris Naváží se 242 g Trizma base (3.5.12) a rozpustí v 650 ml vody (3.5.2). Přidá se 57,1 ml ledové kyseliny octové (3.5.10) a 100 ml předem připraveného 0,5M zásobního roztoku EDTA (viz výše). Doplní se vodou (3.5.2) do celkového objemu 1000 ml. Neautoklávuje se. Uchovává se v těsně uzavřené láhvi při laboratorní teplotě do spotřebování. Příprava pracovního roztoku 1 TAE pro elektroforézu Odměří se 20 ml zásobního roztoku 50 TAE (viz. výše), nalije do odměrného válce o objemu 1000 ml a doplní vodou (3.5.2) do objemu 1000 ml. 5.4 Příprava pracovního roztoku ethidiumbromidu Zásobní roztok ethidiumbromidu (3.5.15) se dodává komerčně. Pracovní roztok se získá zředěním zásobního roztoku 10 vodou (3.5.2). Uchovává se v chladničce.
Národní referenční laboratoř Strana 6 5.5 Příprava agarózového gelu Používá se 0,8% gel pro stanovení kvality vyizolované DNA (0,64 g agarózy a 80 ml 1 TAE pufru) a 2% gel pro hodnocení amplifikačních fragmentů (1,6 g agarózy a 80 ml 1 TAE pufru). Do Erlenmayerovy baňky se naváží dané množství práškové agarózy s přesností na 0,1 g a přidá 80 ml pracovního 1 TAE pufru (viz 5.3). Vaří se při (150 200) C na elektromagnetickém míchadle asi (15 20) min, až se roztok úplně vyčeří a vzduchové bubliny vymizí i po krouživém zamíchání. Zatím se připraví nalévací vana a vhodný hřebínek. Po mírném zchladnutí se přidá 10 µl pracovního roztoku ethidiumbromidu (viz 5.4) (interkalační barvivo sloužící ke zviditelnění DNA v gelu) a míchá se 1 min. Poté se vyjme míchadélko a agaróza se nalije do vany s hřebínkem. Nechá se přibližně 15 min zchladnout při laboratorní teplotě. Pro dokonalé ztuhnutí se poté gel umístí na 30 min do lednice. Asi po (20 30) min, v závislosti na teplotě prostředí, lze opatrně vyjmout hřebínek a přenést gel z nalévací vany do elektroforetické vany s pracovním roztokem TAE pufru. Je možné do nalévací vany vložit 2 hřebínky tak, aby se po rozkrojení získaly dva menší gely. 5.6 Úprava a homogenizace vzorku Veškeré úkony se vzorkem i při přípravě chemikálií se vykonávají v bezpudrových latexových rukavicích. Dbá se na průběžnou dekontaminaci pracovních ploch a prostorů UV zářením a dekontaminačním roztokem, 70% etanolem nebo (0,5 1)% roztokem chlornanu sodného. Homogenizace vzorku V případě zelených rostlin se rostlinný materiál po dodání do laboratoře zmrazí na 80 C. Poté se roztírá tloučkem v třecí misce za přítomnosti tekutého dusíku do podoby jemného prášku. Pokud se vzorek okamžitě nezpracovává, zamrazí se na 80 C. Vzorek mořeného osiva nebo sadby se před mletím promyje vlažnou vodou s přídavkem detergentu a nechá se uschnout na vzduchu nebo v sušárně při asi 40 C. Odstraní se příměsi cizích semen. Vzorek krmiva se mele, pokud není krmivo ve formě šrotu. Celý vzorek krmiva nebo osiva se mele ve vhodném typu mlýnku. Doba mletí a rychlost rotace se uzpůsobí množství a povaze vzorku. Je nutné dbát na to, aby se vzorek při mletí nezahřál nad 40 C, aby nedošlo ke znehodnocení DNA. Po ukončení mletí se nádoby a nože omyjí vodou a na 15 min ponoří do dekontaminačního roztoku. Potom se opláchnou pitnou vodou a vysuší 20 min v horkovzdušné sušárně při 100 C. Jestliže množství vzorku mnohonásobně překračuje kapacitu sběrné misky mlýnku, vzorek se v plastové misce důkladně promíchá, nakvartuje se a k mletí se odebere hmotnost nejméně 1000 semen. Před mletím prvního vzorku se omyjí dekontaminačním roztokem a 70% etanolem plochy stýkající se se vzorkem. Dále se po domletí každého vzorku všechny části mlýnku a povrchy
Národní referenční laboratoř Strana 7 dotýkající se vzorku opláchnou teplou vodou, roztokem chlornanu sodného a znovu pitnou vodou, případně ještě 70% etanolem a osuší čistým savým materiálem. 5.7 Navážení vzorku Zkušební vzorky se navažují s přesností na 0,01 g. Standardy a kontroly obsahující směs GM-negativního a GM-pozitivního materiálu se navažují na analytických vahách s přesností na 0,001 g. Navažuje se do předem označených zkumavek vhodných pro izolaci DNA, které byly vysterilizovány 1 h při (115 120) C. Během vážení se dodržují zásady bezkontaminační manipulace. 5.8 Izolace DNA Obecné zásady pro izolaci DNA Během celého postupu je naprosto nezbytné pečlivé zacházení se vzorky, aby se zamezilo kontaminaci jednoho vzorku stopami druhého, např. mikrokapénkami DNA, které se mohou uvolnit při pipetování a otvírání zkumavek, dotekem víček zkumavek jedné po druhé apod. Proto je třeba přizpůsobit veškeré operace prevenci kontaminace. - Vyhnout se nevhodným pohybům a dotekům, všechny operace vykonávat v rukavicích a rukavice po každém kroku nebo kdykoli je třeba i uvnitř kroků vyměnit, nebo alespoň dekontaminovat opláchnutím v dekontaminačním roztoku (70% etanol nebo roztok chlornanu sodného) a vodou (3.5.2). - Používat sterilní materiál je samozřejmé. - Dojde-li k ukápnutí tekutiny, která obsahuje nebo by mohla obsahovat DNA, je nutno ji okamžitě vysát vatou a potřísněný povrch otřít vatou s dekontaminačním roztokem 70% etanolem nebo roztokem chlornanu sodného. Vata se vhodí do sáčku s DNA odpadem. - Izolace DNA se provádí ve dvou paralelních stanoveních jednoho vzorku. - Do každého běhu izolace DNA, a to vzorků i standardů, je nutno zařadit tzv. blank, kontrola izolace, tj. slepý vzorek bez rostlinného materiálu, který dále postoupí PCRdetekci příslušného vnitřního genu pro ověření čistoty reagencií a faktu, že během izolace nedošlo ke kontaminaci vzorků. 5.8.1 NucleoSpin Food, výrobce Macherey Nagel Před začátkem vlastní izolace DNA je nutno připravit tyto roztoky: Pufr C4 Do tuby s obsahem pufru C3 (3.1.3) se kvantitativně převede celý obsah tuby obsahující pufr C2 (3.1.2) a dobře promíchá. Výsledný pufr C4 je stabilní po dobu 1 roku uskladněný při laboratorní teplotě. Pro dokonalejší rozpuštění obou komponent se doporučuje 5min inkubace při 45 C. Pokud se kit používá pouze příležitostně, je možné smíchat malé množství pufru C3 a C2 v poměru (1 : 4).
Národní referenční laboratoř Strana 8 Pufr C5 Ke koncentrátu pufru C5 (3.1.5) se přidá etanol (3.5.7) v množství uvedeném na lahvičce pufru. Po zředění se označí přidání etanolu. Takto upravený pufr lze uchovávat při laboratorní teplotě 1 rok. Proteináza K K lyofilizované proteináze K (3.1.8) se přidá množství proteinázového pufru (3.1.9) uvedené na jejím obalu. Roztok proteinázy K je stabilní 6 měsíců při 20 C. Izolace DNA Pracovní nástroje, pomůcky i prostor se dekontaminují od jakýchkoli molekul DNA otřením povrchů dekontaminačním roztokem, 70% etanolem a UV zářením po dobu 30 min. Vodní lázeň se předehřeje na teplotu 65 C. Lyzační pufr CF (3.1.1) se předehřeje na 65 C a do dvou 2ml zkumavek se naváží 200 mg zhomogenizovaného vzorku. Buněčná lyze Ke vzorku se přidá 550 µl lyzačního pufru CF (3.1.1), dobře se promíchá na vortexu (15 s), přidá 10 µl proteinázy K a 10 µl RNázy A (3.5.4) a opět se promíchá na vortexu (2 3) s. Inkubuje se 30 min při 65 C. Poté se směs centrifuguje po dobu 10 min (> 10000 g), až se buněčné zbytky usadí. Příprava podmínek vázání DNA Převede se 300 µl čistého supernatantu z kroku Buněčná lyze do nové 2ml zkumavky. Přidá se 300 µl pufru C4 a 200 µl etanolu (3.5.7) a vortexuje se 30 s. Vázání DNA na silikagel Tuba NucleoSpin se umístí do nové 2ml centrifugační zkumavky a přidá se 750 µl směsi z předchozího kroku. Centrifuguje se 1 min při 11000 g. Proteklá tekutina se vylije. Promývání a sušení První promytí: Pipetuje se 400 µl pufru CQW (3.1.4) do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 1 min při 11000 g. Proteklá tekutina se vylije. Druhé promytí: Pipetuje se 700 µl pufru C5 do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 1 min při 11000 g. Proteklá tekutina se vylije. Třetí promytí: Pipetuje se dalších 200 µl pufru C5 do NucleoSpin tuby. Centrifuguje se 2 min při 11000 g, aby se úplně odstranil pufr C5.
Národní referenční laboratoř Strana 9 Vymytí DNA eluce Předehřeje se eluční pufr CE (3.1.6) na 70 C. Tuba NucleoSpin se umístí do nové centrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml. Na membránu v NucleoSpin tubě se pipetuje 100 µl předehřátého elučního pufru CE. Inkubuje se 5 min při pokojové teplotě, a poté se centrifuguje 1 min při 11000 g, aby se uvolnila DNA. Eluát obsahuje čistou genomovou DNA. Pro krátkodobé skladování se uchovává při teplotě (2 8) C, pro dlouhodobé při 20 C. 5.8.2 GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit, výrobce Sigma Aldrich Ověří se, zda v chemikáliích není sraženina. Pokud se sraženina objeví u kterékoli reagencie, zahřeje se na (55 65) C, dokud se nerozpustí. Před použitím se nechá zchladnout na laboratorní teplotu. Wash Solution: Wash Solution Concentrate (3.2.6) se zředí etanolem (3.5.7) v množství uvedeném v kitu. Po zředění se vyznačí přidání etanolu. Izolace DNA Připraví se pracovní plocha, pracovní nástroje, pomůcky i prostor se dekontaminují od molekul DNA otřením povrchů dekontaminačním roztokem, 70% etanolem a UV zářením po dobu 30 min. Vodní lázeň se předehřeje na teplotu 65 C. Naváží se 2 60 mg homogenizovaného vzorku, a to každá dávka do označené 2ml zkumavky. Lýze buněk Do zkumavky se přidá 350 µl Lysis Solution (Part A)(3.2.1) a 50 µl Lysis Solution (Part B) (3.2.2). Po přidání Part B se vytvoří bílá sraženina. Suspenze se pečlivě promíchá na vortexu asi 15 s. Štěpení RNAázou: K lyzační směsi se těsně před inkubací přidá 10 µl RNAázy (3.5.4) a vortexuje (2 3) s. Směs se inkubuje 10 min při 65 C s občasným převrácením zkumavek, aby se rozpustila sraženina. Vysrážení zbytků Ke směsi se přidá 130 µl Precipitation Solution (3.2.3), směs se dobře zamíchá převracením a vloží se na 5 min na led. Potom se směs centrifuguje 5 min při (12000 16000) g. Buněčné zbytky, bílkoviny a polysacharidy zůstanou v peletu. Filtrace zbytků Vzniklý supernatant se pečlivě odpipetuje do filtrační kolony GenElute (modrá s 2ml sběrnou zkumavkou). Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti (14000 ot.). Tím se odstraní
Národní referenční laboratoř Strana 10 buněčné zbytky, které zůstaly po vysrážení zbytků. Potom se odstraní filtrační kolona (modrá část) a sběrná zkumavka se uchová. Příprava pro navázání K proteklé tekutině z předchozího kroku se přidá 700 µl Binding Solution (3.2.4). Uzavře se a pečlivě promíchá převracením. Příprava vázací kolony Kolona GenElute Miniprep Binding Column (s červeným kroužkem) se vloží do připravené nové mikrocentrifugační zkumavky, pokud tam již není vložena. Do každé kolony se přidá 500 µl Column Preparation Solution (3.2.5) a centrifuguje se (30 60) s při 12000 g. Proteklá tekutina se vylije. Přidání lyzátu Opatrně se pipetuje 700 µl směsi z kroku Příprava pro navázání do kolony připravené v předchozím kroku. Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Proteklá tekutina se vylije a zachová se sběrná zkumavka. Kolona se vrátí do sběrné zkumavky. Do kolony se pipetuje zbylý lyzát z kroku Příprava pro navázání a opakuje se centrifugace. Proteklá tekutina se odstraní se sběrnou zkumavkou. Kolona se vloží do nové sběrné zkumavky. Promývání První promytí kolony: Do vázací kolony v nové 2ml zkumavce se přidá 500 µl zředěného Wash Solution. Centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Vylije se prošlá tekutina a uchová se sběrná zkumavka. Druhé promytí kolony: Do kolony se nepipetuje dalších 500 µl zředěného Wash Solution a centrifuguje se při maximální rychlosti 3 min, aby se kolona vysušila. Nedovolíme, aby se prošlá tekutina dotkla kolony. Eluce DNA Vázací kolona se přenese do nové 2ml sběrné zkumavky. Na membránu se pipetuje 100 µl na 65 C předehřátého Elution Solution (3.2.7) a centrifuguje se 1 min při maximální rychlosti. Eluát se sebere do sběrné zkumavky. Eluát obsahuje čistou genomovou DNA. Pro krátkodobé skladování se uchovává při teplotě (2 8) C, pro dlouhodobé při 20 C. Precipitace DNA Pokud je vyizolovaná DNA znečištěna, provádí se ze získaného eluátu etanolová precipitace DNA.
Národní referenční laboratoř Strana 11 Do roztoku DNA se přidá 1/10 objemu octanu sodného (3.5.8). Poklepáním na zkumavku se promísí. Etanol (3.5.7) se dá vychladit do mrazicího boxu. Do DNA s octanem sodným se přidá trojnásobné množství vychlazeného etanolu. Zkumavka se nechá v mrazicím boxu při 20 C přes noc, nebo 30 min při 80 C. Centrifuguje se 20 min při 12000 ot/min. Obsah zkumavky se vylije. K peletu se přidá 500 µl etanolu (3.5.6) na promytí, kývavým pohybem se pelet odlepí a rozpustí. Poté se centrifuguje 10 min při 12000 ot/min. Zkumavka se vylije a nechá otevřená, aby etanol vyprchal. Nesmí se přesušit. Pelet DNA, který zůstane na spodu zkumavky, se rozpustí (vortexuje se při nízkých otáčkách nebo se ručně poklepe) v 50 µl vody (3.5.1), nebo TE pufru (viz. 5.3). Měření koncentrace a kvality vyizolované DNA Důležitým krokem po vyizolování DNA je orientační spektrofotometrické stanovení její koncentrace, případně dalších příměsí a zjištění její kvality celistvosti pomocí gelové elektroforézy na 0,8% agarózovém gelu. Spektrofotometrické měření koncentrace a poměry čistoty vyextrahovaného vzorku Měření při vlnových délkách 230 nm, 260 nm a 280 nm umožní stanovení koncentrace získané DNA i hodnocení čistoty vzorku. Koncentrace nukleových kyselin se počítá na základě absorbance vzorku při 260 nm. Předpokladem pro její správné určení je čistota vzorku. Stupeň čistoty nukleových kyselin se stanovuje z poměru absorbancí naměřených při 260 nm a 280 nm a 260 nm a 230 nm. Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm, zatímco proteiny v oblasti okolo 280 nm. 260/280 Při poměru hodnot A260/280 ~ 1,8 se považuje vzorek vyextrahované DNA za čistý. Hodnoty poměru absorbancí 260/280 se nejčastěji pohybují v rozmezí (1,7 2,0). Nízké hodnoty tohoto poměru většinou indikují, že je vzorek kontaminovaný proteiny nebo reagenciemi, jako je např. fenol, nebo že vzorek obsahuje nízkou koncentraci DNA (< 10 ng/µl). Vysoké hodnoty problém neindikují, protože vyextrahovaná DNA může krom dvouvláknové DNA obsahovat DNA jednovláknovou, volné nukleotidy a RNA. Jedná se o látky, které absorbují při 260 nm. 260/230 Hodnoty 260/230 pro čisté nukleové kyseliny bývají většinou vyšší než hodnoty 280/260, a to v rozmezí (2,0-2,2). Hodnoty odlišující se od tohoto rozmezí indikují buď problém se vzorkem, nebo s extrakčním postupem, proto je důležité brát v úvahu jak hodnoty nižší než 2,0, tak i hodnoty nad 2,2. Nízké hodnoty uvedeného poměru mohou být způsobeny přítomností sacharidů, zbytkového fenolu z izolace DNA a zbytků guadininu, který je součástí izolačních kolonek. Vysoké hodnoty tohoto poměru mohou být způsobeny špatným postupem měření koncentrace a kvality.
Národní referenční laboratoř Strana 12 Vlastní měření Koncentrace DNA se měří proti slepému vzorku, kterým je roztok, v němž je DNA rozpuštěná. Ve většině případů se tedy jedná o eluční pufr použitého izolačního kitu. Použijí se 2 µl vzorku. Každý vzorek se měří dvakrát. Z naměřených hodnot se vypočítá průměr. Pro následnou PCR zpravidla vyhovuje koncentrace (5 10) ng/µl templátové DNA. Pokud je její koncentrace vyšší, je třeba ji na tuto hodnotu naředit vodou vhodnou pro PCR podle níže uvedeného vztahu. Snížením koncentrace DNA se sníží i koncentrace případných inhibitorů reakce, které mohou být ve vzorku přítomny. d = (x y) / z v = x d x y z d v požadované množství naředěné DNA (µl), požadovaná koncentrace DNA (ng), změřená koncentrace DNA (ng/ µl), množství vyextrahovaného vzorku potřebného pro přípravu x µl roztoku o koncentraci DNA z (µl), množství PCR vody potřebné pro ředění vyextrahované DNA na požadovanou koncentraci. Polymerázová řetězová reakce Připraví se laminární box: Dekontaminují se předměty i prostory od jakýchkoli molekul DNA vše se otře dekontaminačním roztokem 70% etanolem a použije se UV záření po dobu (20 30) min. Připraví se pipety, sterilní špičky a zkumavky, odpadní nádoba s vloženým sáčkem na použitý materiál, stojánky apod. Stanoví se počet reakcí (počet vzorků; kontroly: GM-pozitvní a beztemplátová, kontrola izolace; jedna reakce navíc (rezerva pro pipetovací chybu); případně další kontrolní a srovnávací vzorky). Dle tabulek reakčních směsí (tabulka 1, tabulka 2, tabulka 3) se vypočítají celkové objemy všech součástí reakce. PCR směs se připravuje na ledu. Celková reakční směs se sterilně smíchá podle pořadí, v jakém jsou její složky uvedeny v tabulce příslušné k danému amplifikačnímu kitu. Zamíchá se jemným vortexováním a rozdělí se po daném počtu µl do označených zkumavek. Je-li koncentrace vyizolované DNA vyšší než 10 ng/µl, provede se její ředění. Poté se do každé zkumavky přidá daný počet µl temlátové DNA. Pipetuje se v tomto pořadí: beztemplátová kontrola (místo templátové DNA se použije voda vhodná pro PCR), vzorky a pozitivní kontrola. Zkumavky s templátovou DNA se otvírají a s templátovou DNA se manipuluje až poté, kdy jsou všechny zkumavky s reagenciemi pro PCR uzavřeny a reakční směs je rozpipetována do PCR zkumavek. Zkumavky s templáty se otvírají pokud možno v tomto pořadí: vzorky pozitivní kontrola.
Národní referenční laboratoř Strana 13 Zkumavky se pečlivě zavíčkují, aby se zabránilo vypařování směsi během PCR. Zkumavky se vloží do termálního cykleru, zvolí se vhodný amplifikační program a přístroj se spustí dle návodu. Po skončení práce se opět dekontaminují laminární box i pracovní pomůcky. Amplifikační kit REDTaq (3.3) se používá pro jednoduchou PCR reakci (v případě potřeby, může být PCR reakce provedena i kitem REDEx). Pro duplexní (případně multiplexní) PCR reakci se používá amplifikační kit REDEx (3.4). REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma Aldrich) Izoláty DNA získané pomocí výše uvedených kitů se použijí pro amplifikaci tímto kitem přímo bez úprav, pouze se ředí na výše uvedenou koncentraci vodou vhodnou pro PCR. Tabulka 1. Příprava PCR pomocí kitu REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (jednoduchá PCR). Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 5,5 6,5 REDTaq 12,5 Primer F 0,5 1,0 Primer R 0,5 1,0 Bez templátu 20 Templát 5,0 Včetně templátu 25 Objem amplifikačního kitu REDTaq je neměnný. Objemy templátu, primerů a vody vhodné pro PCR se mohou měnit za účelem dosažení optimálního průběhu PCR reakce, přičemž voda pouze doplňuje reakci na požadovaný objem 20 µl. REDExtract-N-Amp Plant PCR Kits (Sigma Aldrich) Izoláty DNA získané pomocí výše uvedených izolačních kitů a naředěné na požadovanou koncentraci se musí pro amplifikaci tímto kitem upravit tak, že se smíchají v poměru 1 : 1 se směsí Extraction Buffer (3.4.1) : Dilution Buffer (3.4.2)(1:1). Požadovaný objem 4 µl roztoku templátu vkládaný do 1 PCR reakce tedy tvoří 2 µl izolátu DNA a 2 µl této směsi pufrů na 20 µl celkové reakční směsi v 1 PCR.
Národní referenční laboratoř Strana 14 Tabulka 2. Příprava PCR pomocí kitu REDExtract - N - Amp Plant PCR Kit jednoduchá PCR. Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 5,2 REDEx 10 Primer F 0,4 Primer R 0,4 Bez templátu 16 Templát 4 Včetně templátu 20 Tabulka 3. Příprava PCR pomocí kitu REDExtract-N-Amp Plant PCR Kits duplexní PCR (množství vody je sníženo o součet objemů druhého páru primerů). Složka 1 reakce (µl) Voda vhodná pro PCR (3.5.1) 4,4 REDEx 10 1. pár primerů, primer F 0,4 1. pár primerů, primer R 0,4 2. pár primerů, primer F 0,4 2. pár primerů, primer F 0,4 Bez templátu 16 Templát 4 Včetně templátu 20
Národní referenční laboratoř Strana 15 Elektroforéza v agarózovém gelu Nanášení vzorků na gel 2% gel se vloží do elektroforetické vany a převrství pracovním TAE pufrem (viz 5.3) (1 2) mm nad jeho povrch. Vzorky se nanesou do jamek gelu v tomto pořadí: beztemplátová kontrola, elektroforetický marker, vzorky, marker a pozitivní kontrola. Nejdříve se nanesou vzorky a potom vhodné markery. Objem vzorku nanášeného do jedné jamky závisí na typu hřebínku a potřebném množství. Amplifikáty získané pomocí kitů REDTaq a REDEx se nanášejí přímo z PCR zkumavek, neboť již obsahují nanášecí barvivo pro elektroforézu. Pokud amplifikáty nanášecí barvivo neobsahují, musejí se s barvivem smíchat (např. bromfenolová modř). Po nanesení vzorků a markerů (3.5.16 nebo 3.5.17) do jamek v gelu se spustí elektroforéza. Spuštění a běh elektroforézy Doporučené nastavení zdroje (90 140) V, maximum ma, (60 90) min chodu. Tyto hodnoty lze měnit dle potřeby a pokynů v návodu pro použití elektroforetického zdroje. Přesná doba chodu sleduje potřebu rozdělení fragmentů v gelu. Postup čela elektroforézy se může orientačně sledovat dle nanášecího barviva. Rozdělení a uspořádání pruhů se sleduje při prosvícení na transiluminátoru, vyfotografováním a přenesením do počítače. Hodnocení testu Pozitivní kontrola PCR: Vykazuje jasně rozeznatelný pruh v gelu v místě, kde se má hledaný pruh v porovnání s markerem vyskytovat. Beztemplátová kontrola PCR: Nedává žádný pruh kromě pruhu či skvrny odpovídající svou polohou primerům, primer dimerům a pod. v oblasti (20 100) bp. V případě nejasného výsledku výše uvedených kontrol nebo výsledku, který se dokonce jeví jako chybný, je nutné daný běh amplifikace opakovat. V případě správných výsledků kontrol je možné konstatovat, že: Vzorky negativní pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách se nevyskytují pruhy v místech, kde ve srovnání s markerem a pozitivní kontrolou má ležet hledaný pruh. Vzorky pozitivní pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách se vyskytují pruhy v místech, kde ve srovnání s markerem a pozitivní kontrolou má ležet hledaný pruh. Vzorky nejasného výsledku pro daný amplikon jsou vzorky, v jejichž stopách v příslušném místě v porovnání s markerem a pozitivní kontrolou nelze jednoznačně určit přítomnost pruhu. V takovém případě je hodnocení vzorků ovlivněho zkušeností pracovníka a provádí se vždy v porovnání s pozitivní kontrolou, která obsahuje 0,1 % materiálu s danou genetickou modifikací. V případě nejednoznačnosti výsledku je třeba zkoušku opakovat.
Národní referenční laboratoř Strana 16 6 Literatura 1 Suchomelová M.: Stanovení přítomnosti GMO v rostlinném materiálu metodou PCR, JPP ÚKZÚZ, Brno, 2007. 2 Manuál kitu Genomic DNA from Food, firmy Machery - Nagel, 2008 / Rev.07. 3 Manuál kitu GenEluteTM Plant Genomic DNA Miniprep Kit firmy Sigma-Aldrich pro izolaci DNA z rostlinného materiálu. 4 Manuál kitu REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kits firmy Sigma-Aldrich, univerzální kit pro PCR. 5 Manuál kitu REDTaq Ready Mix PCR Reaction Mix with MgCl 2, Sigma- Aldrich, univerzální kit pro PCR. 6 Uživatelský manuál k přístroji NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer.