Hmotnostní analyzátory II Typy analyzátorů Iontová cyklotronová rezonance Orbitrap Analyzátory iontové pohyblivosti Hybridní hmotnostní spektrometry Hmotnostní analyzátor Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) Iontová cyklotronová rezonance ICR cela je umístěna uprostřed velmi silného magnetického pole. Ionty jsou zachyceny v pasti kombinací magnetického pole a elektrického potenciálu vkládaného na záchytné desky. V magnetickém poli se ion začne pohybovat po kruhové trajektorii. Frekvence rotace jsou úměrné m/z a pomocí Fourierovy transformace jsou převedeny na hmotnostní spektrum.
Iontová cyklotronová rezonance Nabitá částice o rychlosti v se v magnetickém poli začne pohybovat vlivem Lorentzovy síly po kruhové dráze: poloměr dráhy r: r m miv ezb F L qvb ezvb v je možno vyjádřit pomocí úhlové frekvence: v r m c zeb m i c 2 f c Cyklotronová úhlová frekvence c je nezávislá na počáteční rychlosti iontu. Je funkcí intenzity magnetického pole a m/z. Funkce ICR cely Při excitaci jsou ionty akcelerovány (rezonančně urychleny na vyšší orbit) pomocí RF v širokém pásmu frekvencí na vyšší orbit. Po vypnutí RF ionty pokračují na stejných frekvencích na drahách s vyšším poloměrem. Detekce je založena na měření indukovaného proudu v detekčních deskách. Získaný záznam se převede Fourierovou transformací na spektrum.
Zpracování signálu Fourierovou transformací FID free induction decay superpozice frekvencí od všech iontů v ICR cele závislost intenzity na čase. FT převede záznam na závislost intenzity na frekvenci. Frekvence se přepočtou na m/z podle vztahu: eb m z 2 f Hmotnostní spektrum. Iontová cyklotronová rezonance Vysoké rozlišení v ICR: stejná cyklotronová frekvence pro všechny ionty se stejným m/z. Oscilace iontů v ose z (trapping oscilations) způsobené elektrickým polem (nutné k zachycení iontů v cele) ovlivňují cyklotronovou frekvenci a snižují rozlišení. Odstranění vlivu oscilací v ose z novým způsobem distribuce elektrického potenciálu v cele podstatné zvýšení rozlišení. ParaCell, ESI-Qh-FTICR 7 T magnet Nikolaev et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1125-1133
Iontová cyklotronová rezonance Obecně: ICR FTMS je vyjímečná technika (rozlišení, přesnost určení hmotnosti, nároky na vakuum, cena). Je vhodná k tandemové MS. Typické aplikace spojení s LC, speciální analýzy vyžadující velmi vysoké rozlišení určování struktury, analýza proteinů, ropy, komplexních vzorků Rozlišení: velmi vysoké (> 10 000 000) Přesnost určení hmotnosti: pod 1 ppm Hmotnostní rozsah: > 15 000 u Rychlost skenu: vysoká, milisekundy Orbitrap (elektrostatická orbitální iontová past)
Orbitrap K. H. Kingdon, Phys. Rev. 21, 408, 1923 A. Makarov, Anal. Chem. 72, 1156, 2000 R z φ Orbitrap je iontová past sestávající ze soudkové vnější elektrody a vřetenovité středové elektrody. Kolem a podél středové elektrody oscilují ionty s frekvencí nepřímo úměrnou odmocnině z m/z. Obdobně jako u ICR cely je měřen indukovaný proud. Hmotnostní spektrum se získá po Fourierově transformaci signálu. Orbitrap zavádění iontů Ionty jsou dávkovány pomocí zařízení C-trap, což je zakřivená RF-only iontová past naplněná N 2 (10-3 mbar). Ionty jsou kolizně ochlazeny, stlačeny do úzkého svazku a vypuzeny do orbitrapu (tlak 10-10 mbar).
Orbitrap pohyb iontů v analyzátoru, detekce Po vstupu jsou ionty zachyceny v analyzátoru elektrické pole je přitahuje ke středové elektrodě a zároveň působí odstředivá síla. Ionty se začnou točit kolem elektrody, vytvářejí se kroužky iontů se stejnou hodnotou m/z. Ionty ( kroužky ) se zároveň pohybují podél středové elektrody tam a zpět. Frekvence tohoto pohybu je závislá pouze na hodnotě m/z. Detekce iontů: měří se proud indukovaný na vnějších elektrodách FT Orbitrap Popis elektrostatického pole orbitrapu (quadro-logaritmické) v souřadnicích r,z:v k U ( r, z) z 2 2 r 2 / 2 R ln( r / 2 m R m k zakřivení pole, R m charakteristický poloměr, ) Frekvence oscilací podél osy z je úměrná poměru m/z: z k m / z Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost je nepřímo úměrné odmocnině z m/z a přímo úměrné době měření. Př. m/z 100: R=120 000 m/z 400: R=60 000 m/z 1600: R=30 000
Orbitrap varianty analyzátoru Rozlišovací schopnost orbitrapu závisí na intenzitě elektrického pole čím větší, tím vyšší počet oscilací za jednotku času a tím i vyšší rozlišení orbitrapy standardní orbitrapy high-field orbitrapy Standardní Orbitrap: středová elektroda 3.5 kv, rozlišení 60 000 (m/z 400, 768 ms) High-field Orbitrap: středová elektroda 5 kv, rozlišení 280 000 (m/z 400, 768 ms) Michalski et al., Mol. Cell Proteomics 2012, 3, SI Orbitrap Alexander Makarov Obecně: Orbitrap (fy Thermo) je analyzátor se zcela novým principem uvedeným na trh v roce 2005. Má dobré rozlišení i přesnost určení hmotnosti, ale nedosahuje stejných parametrů jako ICR cely. Výhodou proti FT-ICR je absence magnetu a tedy výrazně lacinější provoz a snadná údržba. Typické aplikace spojení s LC, analýzy vyžadující vysoké rozlišení, široké možnosti využití, proteomika, malé molekuly. Rozlišení: vysoké (až 450 000) Přesnost určení hmotnosti: pod 2 ppm Hmotnostní rozsah: 4000 u (6000 u) Rychlost skenu: milisekundy
Analyzátory iontové pohyblivosti (iontová mobilita) Analyzátor iontové pohyblivosti Analyzátor iontové pohyblivosti separuje ionty na základě jejich pohyblivosti v prostředí neutrálního plynu (obdoba elektroforézy). Analyzátorem je driftová trubice obsahující plyn o daném tlaku, na kterou je vloženo napětí. Ionty se pohybují ve směru elektrického pole, odpor prostředí (plyn) působí v opačném směru. Ionty se dělí na základě svých kolizních průřezů (tj. tvaru a velikosti), náboje a hmotnosti (u molekul větších než 0,5 kda na hmotnosti nezáleží).
Analyzátor iontové pohyblivosti Datový záznam mobilogram. (na ose x je čas ( drift time )). Tofwerk AG Analyzátor iontové pohyblivosti Ionty se v analyzátoru (driftové trubici) působením elektrického polem pohybují rychlostí v. Konstantou úměry je mobilita iontu. d v KE K t E K mobilita iontu v rychlost pohybu E intenzita elektrického pole d d délka driftové trubice t d čas, za který iont překoná délku driftové trubice Parametry, mající vliv na mobilitu: 1 2 3 q 2 K 16N kt pozn.: platí jen pro nízké E/N 1 D q náboj iontu N hustota plynu v driftové trubici - redukovaná hmotnost iontu k Boltzmanova konstanta T teplota D kolizní průřez iontu
Analyzátor iontové pohyblivosti Ionty se v analyzátoru (driftové trobici) působením elektrického polem pohybují rychlostí v. Konstantou úměry je mobilita iontu. v KE K mobilita iontu v rychlost pohybu E intenzita elektrického pole K d t E d d délka driftové trubice t d čas, za který iont překoná délku driftové trubice Parametry, mající vliv na mobilitu: 1 2 3 q 2 K 16N kt pozn.: platí jen pro nízké E/N 1 D q náboj iontu N hustota plynu v driftové trubici - redukovaná hmotnost iontu k Boltzmanova konstanta T teplota D kolizní průřez iontu Analyzátor iontové pohyblivosti Využití bez MS: rychlé detektory výbušnin, drog, chemických zbraní (armáda, letištní kontroly) Dva způsoby využití iontové mobility v MS: 1/ mobilitní separace iontů přímo za zdrojem (FAIMS, DMS) 2/ mobilitní separace iontů v hybridních přístrojích, nejčastěji s TOF analyzátorem Agilent, Waters
Analyzátor iontové pohyblivosti Separace podle tvaru a velikosti iontů: izobarické trisacharidy Agilent Analyzátor iontové pohyblivosti Separace podle nábojového stavu iontů: vícenásobně nabité ionty proteinů Agilent
Analyzátor iontové pohyblivosti - FAIMS FAIMS (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry), někdy též DMS (Differential Mobility Spectrometry) - technika separace iontů v plynné fázi, která využívá rozdílných mobilit iontů v elektrickém poli o vysoké a nízké intenzitě. Ionty jsou střídavě vystaveny poli o nízké a vysoké intenzitě ve směru kolmém na proudění plynu. Separace je výsledkem rozdílu v iontových mobilitách při vysokém a nízkém napětí (zařízením projde jen určitý ion, obdoba kvadrupólu). Využití: - filtrace iontů před MS pro potlačení chemického šumu a výběru iontu pro kvantifikace zvýšení selektivity, zlepšení detekčního limitu - alternativa k LC/MS, separace izomerních látek Guevremont, J. Chromatogr. A 2004, 1058, 3 19 Analyzátor iontové pohyblivosti - FAIMS Válcovité koaxiální elektrody Planární elektrody (vyšší rozlišovací schopnost, ale nižší transmise). Zlepšení poměru S/N i detekčního limitu 10x Thermo Scientific, AB Sciex
Analyzátor iontové pohyblivosti - Travelling wave T-wave cela - soustava prstencových elektrod, na které se vkládá střídavé napětí (opačné fáze na sousedních elektrodách) a stejnosměrné napětí; ionty se pohybují podél osy cely. T-wave IMS: napěťové pulzy posunují ionty podél osy cely v prostředí neutrálního plynu. Interakce/kolize s plynem pohyb iontů zpomalují. Rychlost pohybu iontů závisí na jejich velikosti, tvaru, hmotnosti a náboji. Waters Analyzátor iontové pohyblivosti - Travelling wave Triwave soustava tří cel T-wave, která umožňuje manipulace s ionty (zachycení, akumulaci, vypouštění, separaci a fragmentaci) T-wave IMS cela s lepší transmisí a minimalizovanou fragmentací iontů Waters
Analyzátor iontové pohyblivosti - Travelling wave Využití IM: podstatné zvýšeni počtu detekovaných a identifikovaných složek komplexních směsí analýza izobarických látek měření kolizních průřezů iontů Waters Hybridní hmotnostní spektrometry Hybridní hmotnostní spektrometr je spektrometr, který obsahuje alespoň dva různé typy analyzátorů. Q-TOF (kvadrupól + průletový analyzátor) hybridní spektrometry QQQ-IT (trojitý kvadrupól + iontová past) IT-orbi (iontová past + orbitrap) IT-ICR (iontová past + iontová cyklotronová resonance) IT-TOF (iontová past + průletový analyzátor) IM-TOF (ion mobility + průletový analyzátor) Hybridní přístroje kombinují výhody jednotlivých analyzátorů, první analyzátor většinou slouží k výběru prekurzorů pro další analýzu, případně fragmentaci a následnou analýzu produktových iontů.
Detektory iontů Dynoda a konverzní dynoda Faradayův detektor Elektronový násobič Channeltron Mikrokanálová deska Fotonásobič Detektor iontů Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
Detekce iontů Detektor je zařízení, které převádí proud nabitých částic (iontů) na měřitelnou veličinu (el. proud). jednoduché elektrody - kolektory detektory elektronové násobiče fotonásobiče FT-MS přístroje (ICR, orbitra) neobsahují samostatný detektor signálem je proud indukovaný na stěnách analyzátoru. Dynoda, konverzní dynoda Dynoda je elektroda z materiálu, který je schopen sekundární emise (elektrony, kladně nabité ionty neutrální částice), např. CsSb, GaP or BeO, kovy. Konverzní dynoda dynoda, která je používána před násobičem ke zvýšení sekundární emise (signálu) těžších iontů. Zakřivený povrch konverzní dynody fokusuje emitované částice do elektronového násobiče, gradient napětí je navíc urychlí. + ionty (na konverzní dynodě negativní napětí) -> emise elektronů a negativně nabitých iontů. - ionty (na konverzní dynodě pozitivní napětí) -> emise pozitivně nabitých částic z materiálu elektrody a adsorbovaných plynů. Ke konverzi sekundární emise na elektrony dojde na první dynodě násobiče.
Faradayův detektor (pohár) Faradayův detektor je válcovitá elektroda (dynoda). Ionty narážejí na povrch dynody, dochází k sekundární emisi. Vzniklý signál (proud) je zesílen a zaznamenán. Faradayův detektor je relativně málo citlivý, ale velmi robustní. Je vhodný pro přesnou analýzu poměrů izotopů (isotope ratio MS). Elektronový násobič Typický násobič má 12-24 dynod, zesílení signálu 10 4 10 8 je dosahováno při ~1400 V. Elektronový násobič je detektor iontů obsahující sérii dynod se vzrůstajícím potenciálem. Ionty narážejí na povrch dynody, dojde k sekundární emisi. Emitované částice jsou přitahovány další dynodou, na které dojde k vícenásobné emisi částic. Kaskádovitým efektem tak vznikne velké množství elektronů, které jsou detekovány.
Elektronový násobič - channeltron Channeltron je elektronový násobič s tzv. kontinuální dynodou. Princip je obdobný jako u násobiče s diskrétními dynodami. Využívá se u kvadrupólů a iontových pastí. Mikrokanálová deska -MCP Mikrokanálová deska je pole elektronových násobičů s kontinuální dynodou. Je tvořena mikrokanálky, obě strany desky jsou pokoveny. Tím je docíleno paralelního elektrického spojení násobičů. Na MCP se vkládá napětí 800-1500 V. MCP se využívají u analyzátorů doby letu (TOF).
Fotonásobič Fotonásobič je citlivý detektor elektromagnetického záření v UV, VIS a IR oblasti. Ionty se detekují tak, že se se před fotonásobič umístí fosforová destička. Na ní dopadají částice z konverzní dynody a dochází k emisi fotonů. Ty dopadají na fotokatodu, kde fotoelektrickým jevem dojde k emisi elektronů. Ty jsou dále zmnoženy stejně jako v elektronovém násobiči. Fotonásobiče jsou uzavřené, nedochází k jejich kontaminaci, čímž se dosahuje dlouhé životnosti. Vakuová technika Vakuum, tlak a jeho jednotky Vakuové vývěvy Rotační olejová vývěva Spirálová vývěva Turbomolekulární vývěva Difúzní vývěva Měření vakua
Čerpání plynné fáze příprava vakua Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Vakuum Vakuum - stav plynné fáze s tlakem nižším než je tlak atmosférický hrubé vakuum nízké vakuum jemné vakuum vysoké vakuum ultravakuum 10 5-100 Pa 100-0,1 Pa 0,1-10 -6 Pa < 10-6 Pa l < d l = d l > d l >> d l = střední volná dráha (střední hodnota dráhy, kterou molekula urazí mezi srážkami) d = rozměr vakuové komory 1Pa 10-2 Torr 10-5 bar (atm)
Příprava vakua vakuová čerpadla jemné vakuum (předvakuum): -rotační olejová pumpa - spirálová pumpa vysoké vakuum / ultravakuum: - difúzní pumpa - turbopumpa Rotační olejová vývěva rychlost čerpání: 2-200 m 3 /hod mezní tlak: 0,1-0,01 Pa Rotační olejová vývěva čerpadlo s rotujícími lamelami - má rotor excentricky umístěný ve válcovitém statoru, lamely jsou v těsném kontaktu se statorem. Plyn je postupně stlačován a odchází pružinovým ventilem. Olej slouží k utěsnění a k odvodu tepla Nejčastěji používaný typ čerpadla pro výrobu předvákua ( backing/roughing pump )
Spirálová vývěva Spirálová vývěva je čerpadlo pro přípravu čistého předvakua s jednoduchou údržbou a bez vibrací -dvě spirály, jedna je nepohyblivá, druhá ji obíhá - mezi spirály se kontinuálně uzavírají kapsy plynu - kapsy se směrem ke středu postupně stlačují - plyn odchází střední částí rychlost čerpání: 5-30 m 3 /hod mezní tlak: 1-5 Pa Turbomolekulární vývěva rychlost čerpání: 20-3000 l/s mezní tlak: 10-8 Pa Turbomolekulární vývěva je čerpadlo pro přípravu vysokého a čistého vakua. Stator i rotor jsou tvořeny lopatkami, vysoká rychlost otáčení (60 000 rpm), molekuly plynu jsou postupně strhávány do dalších pater čerpadla. Pumpa má rychlý start, ale omezenou životnost.
Difúzní vývěva O O O O olej: polyfenylether Santovac tepelná odolnost, velmi nízká tenze rychlost čerpání: 20-3000 l/s mezní tlak: 10-6 Pa Difúzní vývěva je čerpadlo pro přípravu vysokého vakua. Olej je odpařován, páry proudí zpět velkou rychlostí. Molekuly plynu jsou strhávány proudem par směrem k odpadu. Olej kondenzuje na stěnách (chlazení) a vrací se zpět. Pumpa je téměř nezničitelná (neobsahuje pohyblivé součásti), má pomalý start, je chlazena vodou. Riziko kontaminace MS systému olejem z pumpu. Měření vakua - vakuometry Neexistuje univerzální vakuometr pro celé tlakové rozmezí (10 5 Pa 10-12 Pa) Odporový vakuometr (Pirani) je založen na tepelné vodivosti plynů. Dvě cely měřící a referenční jsou zapojeny do Wheatstnova můstku. Vlákna (Pt, W, Mo) uvnitř cel jsou žhavena na konstantní teplotu. Molekuly plynu po nárazu na vlákno odvádí část tepla. Měří se proud který je třeba k obnovení teploty na vlákně. V referenční cele je konstantní tlak plynu. Měřící rozsah: 10 4 10-2 Pa
Měření vakua - vakuometry Ionizační vakuometr (Bayard-Alpert) je založen na ionizaci zbytkového plynu. Žhavené vlákno (W, Ir/ThO 2 ) emituje elektrony, které ionizují molekuly plynů. Vzniklé ionty jsou detekovány na kolektoru. Měří se proud, který je úměrný hustotě plynu (tlaku). Měřící rozsah: 10-2 10-9 Pa Výbojový vakuometr (Penning) je založen na výboji a ionizaci zbytkového plynu. Na elektrody je vloženo vysoké napětí, dochází mezi nimi k výboji ( studený výboj, elektrody nejsou žhaveny). Magnetické pole prodlužuje dráhu elektronů (pohyb po spirále). Plyn je ionizován, tvoří se ionty. Měří se proud, který je úměrný hustotě plynu (tlaku). Měřící rozsah: 1 10-10 Pa