V. mezinárodní konference

V. mezinárodní konference 11. 12. dubna 2013, Brno, hotel Holiday Inn PROGRAM KONFERENCE /

KONFERENCE/KONGRESY/SYMPOZIA VÁŠ OSVĚDČENÝ PARTNER PŘI REALIZACI KONGRESŮ KONFERENCÍ SYMPOZIÍ FIREMNÍCH PREZENTACÍ SPOLEČENSKÝCH AKCÍ DOPROVODNÝCH PROGRAMŮ VZDĚLÁVACÍCH KURZŮ PR SLUŽEB WWW.SYMMA.CZ

Národní Tkáňové Centrum a.s. ve spolupráci se Společností pro bioimplantologii ČLS JEP pořádají V. mezinárodní konferenci BIOIMPLANTOLOGIE 2013 11. 12. dubna 2013 Brno, hotel Holiday Inn PROGRAM KONFERENCE Partner konference

Vědecký výbor konference prof. MUDr. Roman Hájek, CSc. Přednosta kliniky hematoonkologie Fakultní nemocnice Ostrava MUDr. Barbara Kubešová Výkonná ředitelka a primářka Národního Tkáňového Centra a.s. MUDr. Petr Vališ Ortopedická klinika LF MU a Fakultní nemocnice Brno Organizační výbor konference MUDr. Barbara Kubešová RNDr. Eva Matějková MUDr. Jaroslav Peprla Hlavní témata konference Kmenové buňky Somatobuněčná terapie Tkáňové inženýrství Buněčné transplantáty Tkáňové transplantáty Validace a jejich úskalí Legislativa a systém kvality Organizační garant konference SYMMA, spol. s r.o. Aleš Martinek Kounicova 13 602 00 Brno E-mail: a.martinek@symma.cz www.symma.cz

Partner a vystavovatel Trigon Plus, spol. s r.o., Říčany u Prahy Vystavovatelé BARIA s.r.o., Psáry DINA HITEX, spol. s r.o., Bučovice Eppendorf Czech & Slovakia s.r.o., Říčany u Prahy I.T.A.-Intertact s.r.o., Praha I.T.A.- Intertact s.r.o. K Horkám 23 Praha 10 102 00 Czech Republic Tel. +420 224 810 196 Fax +420 222 314 055 ita@ita-intertact.com www.ita-intertact.com CHROMSPEC, spol. s r.o., Brno SCINTILA, s.r.o., Jihlava Schoeller Pharma Praha, s.r.o., Praha VIVACOM s.r.o., Praha World Courier Czech Republic, s.r.o., Praha Prezentující se firma AMBULANCE MEDITRANS s.r.o., Praha BioTech a.s., Praha

INFORMACE PRO TKÁŇOVÁ ZAŘÍZENÍ IV/2012 Nestátní zdravotnické zařízení zdravotnická záchranná služba Ambulance Meditrans s. r. o. zabezpečí nepřetržitě Vaše požadavky přeprav lidských tkání a buněk kdykoliv po dobu 24 hodin na území ČR i zahraničí: Lidských tkání a buněk Orgánů k transplantaci dopravu lékaře nebo jiného zdravotnického pracovníka ke specializovanému a nezbytnému výkonu (např. odběru LTB) Ambulance Meditrans s.r.o. je držitelem rozhodnutí o povolení činnosti tkáňového zařízení SÚKL z 13.4.2011 pro: Tkáně a buňky přepravované v rozsahu teplot kapalného dusíku do teploty okolního prostředí v souladu s požadavky tkáňového zařízení Technické zabezpečení: speciální zdravotnická vozidla, se zvláštními výstražnými znameními vybavení standardními uzavíratelnými isotermickými boxy, s validovaným teplotním průběhem SÚKL kompresorové chladící boxy s definovanou teplotou v rozmezí +4 C až -18 C s registrací teplotního průběhu, validované SÚKL o objemu 50 110 l Kryokontejnery CX 500 Organizační zabezpečení: zdravotnické dispečerské pracoviště s 24 hod. provozem elektronická evidence požadavků, záznamové zařízení sledování vozidel GPS přepravu realizují výlučně zdravotničtí pracovníci Vyhrazené telefonní číslo pro požadavky transplantačních přeprav AMBULANCE MEDITRANS 2 4140 5640

ODBORNÝ PROGRAM KONFERENCE 11. dubna 2013 9.00 9.15 hod Zahájení konference 9.00 10.30 hod Přednáškový blok I. Předsednictvo: Vališ P., Kaláb M. 1. Současné možnosti řešení chondrálních defektů nosných kloubů. Srovnání techniky implantace solidního chondrograftu a metody prostých návrtů při řešení defektů chrupavky nosných kloubů Vališ P., Rouchal M., Novák. J.,Otaševič T. Ortopedická klinika LF MU a Fakultní nemocnice Brno 2. Transplantace hepatocytů jako terapie v rámci akutního jaterního selhání u potkana Koblihová E., Lukšan O., Mrázová I., Červenka L., Ryska M. Ústřední vojenská nemocnice - Vojenská fakultní nemocnice Praha 3. Transplantace allogenního kostního štěpu při řešení rozsáhlých poststernotomických defektů hrudní stěny kam jsme pokročili? Kaláb M. 1, Kubešová B. 2, Kamínek M. 3, Lonský V. 1 Kardiochirurgická klinika LF UP a Fakultní nemocnice Olomouc 1 Národní Tkáňové Centrum a.s. 2 Klinika nukleární medicíny LF UP a Fakultní nemocnice Olomouc 3 Diskuze 10.30 11.00 hod Cofeebreak 11.00 12.30 hod Přednáškový blok II. Předsednictvo: Dragúňová J., Bačáková M. 4. Současné možnosti kožních náhrad u popálených pacientů Gregorová N. 1, Lipový B. 1,2, Brychta P. 1,2, Kubešová B. 3 Klinika popálenin a rekonstrukční chirurgie LF MU a Fakultní nemocnice Brno 1 Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity Brno 2 Národní Tkáňové Centrum a.s. 3 5. Polylaktidová nanovlákna v kožním tkáňovém inženýrství Bačáková M. 1, Varga M. 2, Riedel T. 3, Stránská D. 4, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. 1 Fyzikální ústav AV ČR, v.v.i. 2 Ústav makromolekulární chemie AV ČR 3 Elmarco Ltd. 4

ODBORNÝ PROGRAM KONFERENCE 11. dubna 2013 6. Kultivácia chondrocytov pomocou explantátovej kultúry Dragúňová J. 1, Vojtaššák J. 2,3, Daniheľ Ľ. 4, Boháč P 5. Koller J. 1, Varchulová Nováková Z. 3 Centrálna tkanivová banka pri Klinike popálenín Lekárskej fakulty UK, Bratislava, Slovenská republika 1 Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej Univerzity, Trnava, Slovenská republika 2 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky Lekárskej fakulty UK,Bratislava, Slovenská republika 3 Ústav patologickej anatómie Lekárskej fakulty UK, Bratislava, Slovenská republika 4 Ústav histológie a embryológie Lekárskej fakulty UK, Bratislava, Slovenská republika 5 7. Kultivácia buniek na rôznych typoch matríc vhodných pre prípravu trojrozmerných kožných náhrad Vitteková M. 1, Dragúňová J. 2, Csönge L. 3, Koller J. 2, Bakoš D. 1 Slovenská Technická Univerzita v Bratislave, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave, Slovenská republika 1 Klinika popálenín Lekárskej fakulty Univerzity Komenského Bratislava, Slovenská republika 2 West Hungarian Tissue Bank, Györ, Hungary 3 Diskuze 12.30 13.30 hod Oběd 13.30 15.00 hod Přednáškový blok III. Předsednictvo: Kubešová B., Jajtner P. 8. Současné varianty autologní léčby onemocnění pohybového aparátu používané v Nemocnici Znojmo Jajtner P., Komzák M. Nemocnice Znojmo, p.o. 9. Vliv dynamické zátěže na expresi mrnaconnexinu 43 v hladkých svalových buňkách hrudní aorty Musílková J. 1, Riedel T. 2, Brynda E. 2, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. 1 Ústav makromolekulární chemie AV ČR 2 10. Vliv zpracování destičkového lyzátu na hladinu vybraných destičkových faktorů Kubešová B., Karkošková L. Národní Tkáňové Centrum a.s. 11. Validace systému Mirasol PRT pro inaktivaci patogenů v plazmě bohaté na destičky Karkošková L. 1, Kubešová B. 1, Kocmanová I. 2, Vrba M. 2 Národní Tkáňové Centrum a.s. 1 Fakultní nemocnice Brno, OKM 2

ODBORNÝ PROGRAM KONFERENCE 11. dubna 2013 12. Rekonštrukcie alveolárnych výbežkov maxilly autológnymi kmeňovými bunkami, biodegradovateľnou matrix, hydroxiapatitom a trombocytárnym lyzátom Mračna J. 1, Vojtaššák J. 2,3, Stanko P. 1,Danišovič L. 3, Galbavý Š. 4 Klinika stomatológie a maxillofaciálnej chirurgie Lekárskej fakulty UK a OÚSA, Bratislava, Slovenská republika 1 Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej Univerzity, Trnava, Slovenská republika 2 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky Lekárskej fakulty UK, Bratislava, Slovenská republika 3 Ústav súdneho lekárstva Lekárskej fakulty UK, Bratislava, Slovenská republika 4 Diskuze 15.00 15.30 hod Cofeebreak 15.30 17.00 hod Přednáškový blok IV. Předsednictvo: Lysák D., Matějková E. 13. Vliv neurotransplantace na motoriku myší s olivocerebelární degenerací Babuška V., Cendelín J., Houdek Z., Kulda V., Čedíková M., Králíčková M., Vožeh F. Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova v Praze 14. Validace výroby léčivého přípravku z mesenchymálních stromální buněk pro léčbu reakce štěpu proti hostiteli Lysák D., Holubová M., Jindra P. Hematologicko- onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň 15. Jak připravit uvedení nového produktu na trh Studnička T. 16. Úskalí vývoje léčivých přípravků pro moderní terapie Matějková E. Národní Tkáňové Centrum a.s. Diskuze 20.00 24.00 hod Společenský večer ve vinném sklepě v Čejkovicích

ODBORNÝ PROGRAM KONFERENCE 12. dubna 2013 9.00 10.30 hod Přednáškový blok V. Předsednictvo: Filová E., Kuklík M. 17. Engineered trachea. Time to rob the Bank! Vondrys D. Innsbruck Medical University, Rakousko 18. Nanostrukturované biomateriály pro implantologii a tkáňové inženýrství přehled Bačáková L. Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Odd. biomateriálů a tkáňového inženýrství 19. Růst kostních buněk MG 63 in vitro s nanočásticemi apatitu Filová E. 1, N.L.M. der Kinderen J. 1,2, Šupová M. 3, Suchý T. 3, Sucharda Z. 3, Balík K. 3, Simha Martynková G. 4, Machoviča V. 3, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Oddělení biomateriálů a tkáňového inženýrství 1 Fakulta matematiky a přírodních věd, Rijksuniversiteit Groningen, Groningen, Holandsko 2 Ústav struktury a mechaniky hornin, AV ČR, v.v.i., Praha, Oddělení kompozitních a uhlíkových materiálů 3 Centrum nanotechnologií, Vysoká škola baňská, Technická univerzita Ostrava 4 20. Adheze a růst osteoblastů SAOS-2 na površích modifikovaných nanotrubičkami z TiO2 Krýslová M. 1, Filová E. 1, Joska L. 2, Fojt J. 2, Moravec H. 2, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Oddělení biomateriálů a tkáňového inženýrství 1 Ústav kovových materiálů a korozního inženýrství, Fakulta chemické technologie, VŠCHT v Praze 2 21. Kandidátní kostní choroby vhodné pro buněčnou terapii: Mukopolysacharidózy, mukolipidózy, osteopetrózy a osteogenesisimperfecta Kuklík M., Hyánek J., Mařík I. Genetické pracoviště, 1. a 3. LF UK Praha Diskuze 10.30 11.00 hod Cofeebreak 11.00 12.30 hod Přednáškový blok VI. Předsednictvo: Procházka V., Matějková E. 22. Soup to Nuts (Polévka pro Blazny): Harvesting the Therapeutic Potential of Adult Stem Cell-Free Therapy Johnstone B. Center for Vascular Biology and Medicine, Center for Regenerative Medicine, Department of Cardiology, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, USA 10

ODBORNÝ PROGRAM KONFERENCE 12. dubna 2013 23. Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine March K. Indiana University, Indianapolis, USA 24. Úspěchy moderních kultivačních technologií ve vědě i buněčné terapii Držík O. 25. Cytocentric research tools for cell therapy Korbel M. Diskuze 12.30 12.40 hod Závěr konference 12.40 14.00 hod Oběd 15.00 16.30 hod Výroční schůze členů Společnosti pro Bioimplantologii ČLS JEP POSTEROVÁ SEKCE: 1. Příprava 3D rekonstruované epidermis Franková J., Pivodová V., Ulrichová J. Ústav Lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci 2. Analýza CD34+/CD133+ progenitorových buniek v kostnej dreni vhodnej pre aplikáciu pri terapii kritickej kočatinovej ischemii Mlynárová J., Musil P., Klepanec A., Maďarič J., Višňanský M., Kyselovič J. Farmaceutická fakulta UK v Bratislave 3. In Vitro Testing of Modified Collagen/Hyaluronan/ Beta-Glucan Scaffold for Tissue Engineering Application Varchulova Novakova Z., Vojtassak J., Bakos D., Bohac M., Polak S., Danisovic L. Lekárska fakulta UK v Bratislave 4. Kolagenní vlákna obohacená o laktoferin a adsorbovaná na polymerní materiál zlepšují růst a diferenciaci kostních buněk Vandrovcova M. 1, Bacakova L. 1, Heinemann S. 2, Scharnweber D. 2, Dubruel P. 3, Douglas T.E.L. 3 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Oddělení biomateriálů a tkáňového inženýrství, Praha 1 Max Bergmann Center of Biomaterials, Technische Universität Dresden, Německo 2 Polymer Chemistry and Biomaterials (PBM) Group, Ghent University, Belgie 3 11

VŠEOBECNÉ INFORMACE Místo konání Hotel Holiday Inn, Křížkovského 20, 602 00 Brno /naproti areálu BVV/. Registrační poplatky Lékaři do 4. dubna 2013 Kč 1 400,- na místě Kč 1 600,- NLZP do 4. dubna 2013 Kč 900,- na místě Kč 1 100,- V registračním poplatku je zahrnuto vstupné na konferenci, občerstvení v průběhu akce, vstupenka na společenský večer, sborník přednášek, konferenční materiály a DPH. Parkování Možnost parkování v areálu hotelu Holiday Inn, cena Kč 300, / den nebo v okolí areálu BVV bezplatně. Registrace účastníků 11. dubna 2013 08.00 14.00 hod 12. dubna 2013 09.00 10.00 hod Registrující osoby Vám rádi odpoví Vaše event. dotazy. Konferenční materiály Program konference vč.sborníku abstrakt, konferenční set a jmenovka. Oběd Obědy formou menu zajistí zájemcům organizátor akce v hotelové restauraci Brasserie, cena a Kč 230,. Zájemce o bezmasé jídlo žádáme, aby svůj požadavek sdělili registrujícím osobám. Společenský večer Společenský večer se koná dne 11. dubna 2013 ve vinném sklepě U Templářských rytířů v Čejkovicích. Odjezd autobusů v 18.45 hod od hotelu Holiday Inn. Předpokládaný návrat do Brna ve 23.00 hod. Vstupenka na společenský večer je zahrnuta v registračním poplatku. Konferenční technika Dataprojektor PC Bezdrátová myš vč. laserpointu Náhledový monitor Techniku je možné si vyzkoušet před zahájením konference nebo v průběhu přestávek. Prezentace Prezentace, které od Vás převezme technická obsluha v přednáškovém sále, prosíme dodat na CD/DVD nebo USB Flash disku. 12

BIOIMPLANTOLOGIE 2013 11. 12. dubna 2013 Abstrakta neprošla jazykovou úpravou. 13

Obsah: Současné možnosti řešení chondrálních defektů nosných kloubů. Srovnání techniky implantace solidního chondrograftu a metody prostých návrtů při řešení defektů chrupavky nosných kloubů...18 Transplantace hepatocytů v terapii akutního jaterního selhání u potkana...19 Transplantace allogenního kostního štěpu při řešení rozsáhlých post-sternotomických defektů hrudní stěny kam jsme pokročili?...20 Současné možnosti kožních náhrad u popálených pacientů...21 Polylaktidová nanovlákna v kožním tkáňovém inženýrství...22 Kultivácia chondrocytov pomocou explantátovej kultúry...23 Kultivácia buniek na rôznych typoch matríc vhodných pre prípravu trojrozmerných kožných náhrad...24 Současné varianty autologní léčby onemocnění pohybového aparátu používané v Nemocnici Znojmo, p.o...25 Vliv dynamické zátěže na expresi mrna connexinu 43 v hladkých svalových buňkách hrudní aorty...27 Vliv zpracování destičkového lyzátu na hladinu vybraných destičkových faktorů...28 Validace systému MIRASOL PRT pro inaktivaci patogenů v plazmě bohaté na destičky...29 Rekonštrukcie alveolárnych výbežkov maxilly autológnymi kmeňovými bunkami, biodegradovateľnou matrix, hydroxiapatitom a trombocytárnym lyzátom...30 Vliv neurotransplantace na motoriku myší s olivocerebelární degenerací...31 Validace výroby léčivého přípravku z mesenchymálních stromální buněk pro léčbu reakce štěpu proti hostiteli...32 Jak připravit uvedení nového produktu na trh...33 Úskalí vývoje léčivých přípravků pro moderní terapie...34 Engineered trachea. Time to rob the Bank!...35 Nanostrukturované biomateriály pro implantologii a tkáňové inženýrství - přehled...36 Růst kostních buněk MG 63 in vitro s nanočásticemi apatitu...37 Adheze a růst osteoblastů SAOS-2 na površích modifikovaných nanotrubičkami z TiO2...38 Kandidátní kostní choroby vhodné pro buněčnou terapii: Mukopolysacharidózy, mukolipidózy, osteopetrózy a osteogenesis imperfecta...39 Soup to Nuts (Polévka pro Blazny): Harvesting the Therapeutic Potential of Adult Stem Cell-Free Therapy...40 Příprava 3D rekonstruované epidermis...41 14

Analýza CD34+/CD133+ progenitorových buniek v kostnej dreni vhodnej pre aplikáciu pri terapii kritickej kočatinovej ischemii...42 In Vitro Testing of Modified Collagen/Hyaluronan/ Beta-Glucan Scaffold for Tissue Engineering Application...43 Kolagenní vlákna obohacená o laktoferin a adsorbovaná na polymerní materiál zlepšují růst a diferenciaci kostních buněk...44 15

Rejstřík autorů: Babuška Václav, Ing., Ph.D.; vaclav.babuska@lfp.cuni.cz Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova v Praze Bačáková Markéta, Ing.; marketa.bacakova@biomed.cas.cz Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Bačáková Markéta, Ing.; marketa.bacakova@biomed.cas.cz Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Bačáková Lucie, doc., MUDr., CSc.; lucy@biomed.cas.cz Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Dragúňová Jana, Mgr, CSc.; j.dragoon@post.cz Centrálna tkanivová banka pri Klinike popálenín LF UK Bratislava Filová Elena, Mgr., Ph.D.; filova@biomed.cas.cz Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Franková Jana, Mgr., Ph.D.; frankova0@seznam.cz Univerzita Palackého v Olomouci, LF, Ústav lékařské chemie a biochemie Gregorová Nora, MUDr.; nora.g@centrum.cz Fakultní nemocnice Brno Jajtner Pavel, MUDr., MBA; pavel.jajtner@nemzn.cz Nemocnice Znojmo, p.o. Johnstone Brian H., dr. Center for Vascular Biology and Medicine, Center for Regenerative Medicine, Department of Cardiology, Indiana University School of Medicine, Indianapolis Kaláb Martin, MUDr.; martin.kalab@email.cz Kardiochirurgická klinika LF UP a Fakultní nemocnice Olomouc Karkošková Lucie, Bc.; lucie.karkoskova@natic.cz Národní Tkáňové Centrum a.s. Koblihová Eva, MUDr.; eva.koblihova@uvn.cz Ústřední vojenská nemocnice - Vojenská fakultní nemocnice Praha Krýslová Markéta; M.Kryslova@seznam.cz Oddělení biomaterálů a tkáňového inženýrství, Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Kubešová Barbara, MUDr.; barbara.kubesova@natic.cz Národní Tkáňové Centrum a.s. Kuklík Miloslav, MUDr., CSc.; honza.kuklik@volny.cz Genetické pracoviště, 1. a 3. LF UK, Praha Lysák Daniel, MUDr., Ph.D.; lysak@fnplzen.cz Hematologicko- onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň Matějková Eva, RNDr.; eva.matejkova@natic.cz Národní Tkáňové Centrum a.s. 16

Mlynárová Jana; jnmlynarova@gmail.com Farmaceutická fakulta UK v Bratislave Musílková Jana, RNDr., CSc.; jana.mu@gmail.com Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Vališ Petr, MUDr., Ph.D.; pvalis@fnbrno.cz Ortopedická klinika LF MU a Fakultní nemocnice Brno Vandrovcová Marta, Ph.D.; vandrovcova@biomed.cas.cz Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. Varchulová Nováková Zuzana, RNDr.; zuzana.varchulova@fmed.uniba.sk Lekárska fakulta UK v Bratislave Vitteková Miroslava, RNDr.; mirka.basnarova@gmail.com Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave Vojtaššák Ján, prof., RNDr., CSc.; jan.vojtassak@fmed.uniba.sk Lekárska fakulta UK v Bratislave Vondrys David; david.vondrys@uki.at Innsbruck Medical University 17

Současné možnosti řešení chondrálních defektů nosných kloubů. Srovnání techniky implantace solidního chondrograftu a metody prostých návrtů při řešení defektů chrupavky nosných kloubů Vališ P., Rouchal M., Novák. J.,Otaševič T. Ortopedická klinika LF MU a Fakultní nemocnice Brno Úvod: Vzhledem k nárůstu poškození na nosných kloubech je v posledních desetiletích v popředí řešení chondrálních defektů, které jsou nedílnou součástí těchto poškození. V první části poukazujeme na současné možnosti řešení chondrálních defektů. Ve druhé části jsme v našem souboru srovnávali metodu implantace solidního chondrograftu s prostými návrty při řešení chondrálních defektů. Materiál a metodika: Principem naší práce bylo srovnání morfologických, biochemických a klinických výsledků při použití solidního chondrograftu a návrtů spodiny defektů kloubní chrupavky v místě původního defektu. Při kontrolních ASK jsme odebrali z místa původního defektu vzorky, které jsme dále hodnotili. Náš soubor byl 35 pacientů. 4 vzorky byli nehodnotitelé pro malé množství odebraného materiálu. Proto bylo nakonec vyhodnoceno 31 tkáňových vzorků. 24 pacientů bylo po implantaci solidního chondrograftu a 7 byl po ošetření defektů prostými návrty. Uvedené vzorky jsme hodnotili na přítomnost matrixmetalloproteináz (MMP-1, MMP-3 a MMP-13). Závěr: Na podkladě výsledků našeho hodnocení jsme vytvořili doporučení pro praxi při řešení chondrálních defektů nosných kloubů. 18

Transplantace hepatocytů v terapii akutního jaterního selhání u potkana Koblihová E¹, Lukšan O², Mrázová I², Červenka L² a Ryska M¹ Ústřední vojenská nemocnice-vojenská fakultní nemocnice Praha, Chirurgická klinika 2. LFUK a ÚVN, Praha, Česká republika¹ Institut klinické a experimentální medicíny, Pracoviště experimentální medicíny, Praha, Česká republika² Úvod: Transplantace jater představuje jedinou kauzální terapeutickou metodu v léčbě akutního jaterního selhání (AJS). Celosvětovým problémem stále zůstává nedostatek dárců orgánů, což vede k intenzivnímu hledání alternativních způsobů terapie. Jednou z nich je transplantace jaterních buněk. V naší studii jsme se zaměřili na sledování úspěšnosti transplantační terapie na modelu laboratorního potkana po chemicky indukovaném akutním jaterním selhání. Metodika: Soubor 60 potkanů inbredního kmene Lewis jsme rozdělili do tří skupin: 20 zdravých zvířat s transplantovanými hepatocyty, 20 zvířat po AJS léčených transplantací hepatocytů a 20 zvířata po AJS bez léčby. Akutní jaterní selhání jsme vyvolali intraperitoneálním podáním thioacetamidu (TAA). Jaterní buňky určené k transplantaci jsme získali izolací modifikovanou metodou dle Seglena z laboratorního kmene LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk nesoucího gen pro luciferázu s ubikvitní expresí. U všech skupin jsme sledovali přežívání, dále jsme u všech zvířat prováděli vyšetření krve na jaterní testy (bilirubin, ALT, AST, GMT) a vyšetření koncentrace amoniaku a albuminu v krevním séru. Ke sledování distribuce a viability transplantovaných hepatocytů jsme použili in-vivo zobrazení na přístroji IVIS Lumina XR (Perkin Elmer, Waltham, MA). Výsledky: Jako základní srovnávací kriterium úspěšnosti léčby jsme zvolili mortalitu. Zatímco v neléčené skupině selhaných zvířat dosáhla úmrtnost úrovně 70% do 48 hodin po první aplikaci TAA a 100% do 54 hodin, u léčené skupiny to bylo 60%. Vysoké úspěšnosti bylo dosaženo i přes to, že terapie byla v počáteční fázi narušena chováním zvířat při encefalopatii v rámci AJS. U všech přeživších transplantovaných zvířat došlo k normalizaci sledovaných laboratorních hodnot krve. Přítomnost transplantovaných transgenních buněk v játrech příjemce jsme monitorovali invivo po dobu 7 dnů u skupiny zdravých a selhaných potkanů. Úspěšnost transplantace jsme prokázali u všech zvířat detekcí aktivity luciferázy bezprostředně po aplikaci buněk. Zatímco u zdravých příjemců intenzita signálu po dobu sledování kontinuálně klesala a po 7 dnech dosáhla prahu detekce, úroveň signálu u zvířat po AJS setrvávala na stabilních hodnotách. Při dlouhodobém sledování jsme prokázali přítomnost transplantovaných hepatocytů ještě za více než dva měsíce po transplantaci. Závěr: Léčba chemicky vyvolaného AJS u laboratorního potkana pomocí transplantace hepatocytů vedla k významnému snížení mortality a k normalizaci jaterních testů a hladiny amoniaku. Pomocí in-vivo zobrazovacích technik jsme prokázali inkorporaci transplantovaných hepatocytů v játrech příjemce. Přítomnost funkčních transgenních buněk byla detekována v časovém odstupu více než dvou měsíců po transplantaci. 19

Transplantace allogenního kostního štěpu při řešení rozsáhlých post-sternotomických defektů hrudní stěny kam jsme pokročili? Kaláb M. 1, Kubešová B. 2, Kamínek M. 3, Lonský V. 1 Kardiochirurgická klinika LF UP a Fakultní nemocnice Olomouc 1 Národní Tkáňové Centrum a.s. 2 Klinika nukleární medicíny LF UP a Fakultní nemocnice Olomouc 3 Rozsáhlé dehiscence sternotomie, provázené velkou ztrátou kostního materiálu sterna a přilehlých žeber, představují pro kardiochirurgii velký problém a jsou stále zatíženy vysokou pooperační mortalitou. Na základě zkušeností ortopedické chirurgie jsme k výplni těchto defektů hrudního skeletu začali používat allogenní kostní štěp sterna připravený ve spolupráci s Národním tkáňovým centrem v Brně. Vyvinuli jsme zcela novou, a v kardiochirurgické literatuře před námi doposud nepublikovanou, techniku transplantace allogenního kostního štěpu, která umožňuje opětovné dosažení stability hrudní stěny. Stabilita hrudního koše je přitom zásadním předpokladem pro další hojení měkkých tkání. Tento postup používáme již 3 roky a ve sdělení předkládáme přehled výsledků, které jsme touto inovativní metodou dosáhli. 20

Současné možnosti kožních náhrad u popálených pacientů Gregorová N. 1, Lipový B. 1,2, Brychta P. 1,2, Kubešová B. 3 Klinika popálenin a rekonstrukční chirurgie LF MU a Fakultní nemocnice Brno 1 Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity Brno 2 Národní Tkáňové Centrum a.s. 3 Termické trauma je charakterizováno různě rozsáhlou kožní ztrátou. Základním předpokladem úspěšné léčby u těchto pacientů je, v případě hlubokých popálenin, časná nekrektomie s následným uzávěrem vzniklého defektu. Tento proces minimalizuje riziko rozvoje infekce v oblasti popálené plochy. Vhodný wound-management představuje jeden ze základních principů popáleninové péče. Nedílnou součástí péče o ránu jsou kožní náhrady (biologické, syntetické). Přednáška je koncipovaná jako průřez historií a současností používaných dočasných a trvalých krytů v popáleninové medicíně. Klíčové slova: Kožní náhrady, popáleniny 21

Polylaktidová nanovlákna v kožním tkáňovém inženýrství Bačáková M. 1, Varga M. 2, Riedel T. 3, Stránská D. 1, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. 1 Fyzikální ústav AV ČR, v.v.i. 2 Ústav makromolekulární chemie AV ČR 3 Elmarco Ltd. 4 Nanovlákenné materiály mohou být v kožním tkáňovém inženýrství vhodné pro konstrukci kožních náhrad a sloužit tak jako dočasné nosiče kožních buněk fibroblastů a keratinocytů. Svojí strukturou mohou dobře simulovat architekturu přirozené extracelulární matrix. Navíc nanovlákenné membrány mohou být využity pro konstrukci dvojvrstvy fibroblastů a keratinocytů, kde membrána odděluje oba buněčné typy, ale přesto díky svým pórům může zajišťovat jejich humorální a fyziologickou komunikaci, tudíž vrstva fibroblastů může plnit svoji fyziologickou vyživující funkci pro keratinocyty. Vhodným materiálem pro vytvoření nanovlákenné strukturu jsou biodegradabilní polymery (např. polymléčná kyselina, PLA), neboť mohou být z organismu postupně odstraňovány a nahrazovány plnohodnotnou regenerovanou tkání, a tudíž mohou plnit pouze dočasnou funkci nosné struktury. Adhese a růst buněk na materiálu může být dále podpořena vhodnou fyzikální (ozáření plasmou) nebo chemickou modifikací (potažení nanovláken molekulami extracelulární matrix? kolagen, hyaluronan, fibrin). Slibným přístupem v tkáňovém inženýrství kůže se také jeví využití kmenových buněk a jejich diferenciace do buněk kožní tkáně. Práce se zabývá sledováním adhese a růstu lidských keratinocytů linie HaCaT, myších embryonálních fibroblastů linie 3T3 a lidských mesenchymálních kmenových buněk kostní dřeně (MSC) na nanovláknech z PLA modifikovaných v plasmě nebo potažených kolagenem. Nanovlákenné membrány byly modifikovány v kyslíkové plasmě a byl sledován vliv výkonu a doby modifikace na vlastnosti membrán a na chování buněk. Poškození nanovlákenné struktury po modifikaci bylo pozorováno skenovací elektronovou mikroskopií (SEM). Výsledky ukazují, že polylaktidové nanovlákenné membrány podporují adhesi a růst kožních buněk, což bylo dále významně podpořeno plasmovou modifikací. S rostoucím výkonem a zejména dobou plasmování ovšem roste míra poškození (degradace) nanovláken. Potažení vláken kolagenem podporuje růst kožních i MSC buněk. Podporováno Grantovou agenturou České republiky (grant č. P108/10/1106) 22

Kultivácia chondrocytov pomocou explantátovej kultúry Dragúňová J. 1, Vojtaššák J. 2,3, Daniheľ Ľ. 4, Boháč P. 5, Koller J. 1 Centrálna tkanivová banka pri Klinike popálenín Lekárskej fakulty UK, Bratislava 1 Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej Univerzity, Trnava 2 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky Lekárskej fakulty UK, Bratislava 3 Ústav patologickej anatómie Lekárskej fakulty UK, Bratislava 4 Ústav histológie a embryológie Lekárskej fakulty UK, Bratislava 5 Pri liečení defektov chrupavky pomocou chondrocytov je problém izolovať dostatočný počet buniek. Pre získanie väčšieho množstva buniek je potrebná rozsiahla biopsia, alebo je potrebná kultivácia chondrocytov in vitro. Pri kultivácii často strácajú svoj chondrocytárny fenotyp a bunky konvertujú na fibroblasty. V Centrálnej tkanivovej banke sme vyvinuli metódu získavania chondrocytov vo väčších objemoch z explantátovej kultúry. Jej výhodou je, že umožňuje získať chondrocyty aj zo zvyškov po enzymatickej izolácii a umožňuje kultivovať chondrocyty po niekoľko pasáží bez zmeny ich fenotypu. Materiál a Metódy: Biopsia chrupavky po enzymatickej separácii bola umiestnená na dno kultivačnej nádoby (Petriho miska, priemer 6 cm), fixovaná, prekrytá kultivačným médiom (D-MEM + 10% fetálneho teľacieho séra, ATB + kyselina askorbová 1ug/ml) a kultivovaná štandardným spôsobom (370 C, humidovaná atmosféra s 5%CO2 v atmosfére). Výsledky: Bunky začali z explantátu vyrastať po 3? 10 dňoch kultivácie. Po 14 dňoch bunky dosiahli konfluenciu, bunky sme separovali a bioptický explantát použili na ďalšiu kultiváciu. V našom laboratóriu sme boli schopní preniesť biopsiu 5. Na fixovanie biopsie na povrch kultivačnej nádoby sme použili fibrínové lepidlo Tissucol. Bunky z biopsie prerastali do Tissucolu a postupne boli schopné pokryť celý povrch kultivačnej nádoby. pričom výťažok z jednej kultivačnej nádoby bol približne 3 4 miliónov buniek a bunky si uchovávajú svoj chondrogénny charakter, produkujú kolagén II. Záver: Metóda kultivácie explantátu umožňuje získať dostatočné množstvo chondrocytov. Môže teda slúžiť ako alternatívna metóda klasickej kultivácie v jednovrstve. Biopsiu môžeme použiť opakovane. Takto získané bunky nemenia ani po niekoľkonásobnom prenesení biopsie svoj chondrocytárny fenotyp. 23

Kultivácia buniek na rôznych typoch matríc vhodných pre prípravu trojrozmerných kožných náhrad Vitteková M. 1, Dragúňová J. 2, Csönge L. 3, Koller J. 2, Bakoš D. 1 Slovenská Technická Univerzita v Bratislave, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská republika 1 Klinika popálenín Lekárskej fakulty Univerzity Komenského Bratislava, Slovenská republika 2 West Hungarian Tissue Bank, Györ, Maďarsko 3 Úvod: Príprava trojrozmerných náhrad kože pre pacientov s rozsiahlymi popáleninami by umožnila zlepšenie prežívania i kvality života pacientov. Dodnes neexistuje plnohodnotná náhrada plnej hrúbky kože. Takáto náhrada by mohla byť prínosom nielen v popáleninovej, ale i plastickej chirurgii. V Centrálnej tkanivovej banke sme pripravili acelulárne dermy alogénneho a xenogénneho pôvodu. Do prípravy sme zahrnuli aj Coladerm H a L, pripravené v spolupráci s FCHPT STU v Bratislave. V predchádzajúcich pokusoch sme dokázali, že žiadna z pripravených acelulárnych deriem nevykazuje cytotoxický efekt. V tejto práci sme sa zamerali na sledovanie rastovej aktivity rôznych typov buniek na membránach. Vypracovali sme jednoduchú metódu, ktorá umožňuje trojrozmernú kultiváciu na nami sledovaných membránach. Materiál a metódy: Pripravené membrány sme umiestnili na kultivačné sitko a prekryli kultivačným médiom. Na druhý deň sme pridali testované bunky (myšie 3T3 fibroblasty, dermálne fibroblasty izolované z explantátovej kultúry kože a mezenchymálne kmeňové bunky izolované z lipoaspirátu. Rast buniek sme sledovali mikroskopicky, testom MTT a po 14 dňoch kultivácie sme kultúry fixovali formalínom a farbili hematoxylín-eozínom. Výsledky: Mikroskopické pozorovania i výsledky farbenia potvrdili, že bunky rastú na povrchu všetkých testovaných matríc. Zistili sme, že nami vypracovaná metóda umožňuje úspešnú kultiváciu všetkých typov buniek. Metóda simuluje podmienky v organizme, pretože membrána je umiestnená na rozhraní fázy médium/vzduch, matrica je vyživovaná zospodu a bunky rastú na povrchu vo vzdušnej fáze. Záver: Metóda kultivácie, vyvinutá v CTB, umožňuje úspešne kultivovať viaceré druhy buniek na pripravených acelulárnych dermách (alogénneho aj xenogénneho pôvodu) ako aj na matriciach Coladerm H a L. Metóda umožňuje trojrozmernú kultiváciu a simuluje podmienky v organizme. Môže sa preto stať východiskom pre prípravu plnohodnotnej náhrady kože a to i vo väčšom rozsahu, pretože metóda umožňuje pripraviť aj náhrady s rozsiahlou plochou. 24

Současné varianty autologní léčby onemocnění pohybového aparátu používané v Nemocnici Znojmo, p.o. Jajtner P. 1, Komzák M. 2 Hematologicko-transfúzní oddělení Nemocnice Znojmo, p.o. 1 Ortopedicko-traumatologické oddělení Nemocnice Znojmo, p.o. 2 Úvod: PRP plazma se dvou či vícenásobnou koncentrací trombocytů oproti normální plazmě. BMC získáván centrifugaci aspirátu KD, obsahuje MSCs pozitivní vliv na regeneraci chrupavky a akceleraci kostního hojení. Myšlenka využití PRP ke stimulaci regenerace chrupavky vychází z fyziologických vlastností trombocytů. Růstové faktory jsou uloženy v alfa granulích, řada z nich má prokázaný vliv na regeneraci chrupavky ( PDGF, TGF-β, IGF, FGF, VEGF ). Z α-granulí uvolnění faktorů trombinem podstatná je aktivace trombocytů, nikoli množství vyplavených působků. Han et al. prokázali lepší efekt PRP in vivo bez předchozí aktivace PRP trombinem. BMC je získán centrifugací aspirátu KD, jedná se o koncentrát obsahující : MSCs - multipotentní nehemopoetické progenitorové buňky schopné diferenciace do různých mezodermálních linií, hemopoetické progenitory s angiogenním potenciálem, charakterizovány přítomností CD34+ a CD45+, trombocyty jako donory růstových faktorů a další. MSCs byl prokázán jednoznačný pozitivní vliv na regeneraci chrupavky, tak na osteogenní diferenciaci. Metody: Aplikace PRP při léčbě chondromalacie kolenního kloubu. Před léčbou je provedeno MR vyšetření pro zhodnocení výšky chrupavky v degenerované oblasti kloubu a je provedeno zhodnocení funkčnosti kloubů, bolestivosti dle příslušných skórovacích systémů ( Lysholm, Tegner, Cincinnati, IKDC subj., obj. ), toto hodnocení následuje po 6 a 9 aplikacích PRP. 4-6 ml PRP jsou získány z 20 30 ml autologní krve specifickou centrifugací. Po skončení centrifugace se zkumavky opatrně vyjmou a přenesou se do aplikační místnosti, kde lékař či laborantka sterilně pomocí obyčejné vysterilizované laboratorní pipety odebere 5-6 ml PRP, které jsou následně aplikovány za aseptických podmínek do kolenního kloubu ortopedem. Zbývající 1 ml PRP je použit pro hematologickou kontrolu - porovnání PRP a plné krve. Harmonogram aplikací je následující: jednou týdně po dobu šesti týdnů a pak jednou za tři měsíce po dobu devíti měsíců, tj. celkem 9 injekcí. Rok po první aplikaci je provedeno druhé MR vyšetření a stav chrupavky ve stejné části kloubu je znovu zhodnocen. Použití BMC u posterolaterálních fúzí páteře. Po odběru kostní dřeně na operačním sále Yamshidiho technikou připravíme štěp jednoduchou technikou denzitní-gradientní centrifugace. Jsou separovány elementy bílé řady a destičky od erytrocytů. Leukocyty a reziduální trombocyty kostní dřeně jsou koncentrovány 5 10x společně s MSCs. Po centrifugaci je dále použit pouze buffy coat s maximálním obsahem jaderných elementů kostní dřeně, erytrocyty a plazma jsou odděleny. Předpokládaný získaný objem koncentrátu leukocytů vč. kmenových buněk je 1 2,0ml na 1 zkumavku, celkový objem je 10 20 ml ze 100ml aspirátu. Koncentrovaný separát (BMC) obsahující MSCs následně na operačním sále ex vivo smíchán s alogenními spongiózními štěpy, které jsou použity právě u laterálních páteřních fúzí, Obsah MSC v separátu je 0,01 0,02 % jaderných elementů kostní dřeně, absolutně 1-10x10na6/l. Hodnocení prováděna na průtkovém cytometru firmy Beckman- Coulter Cytomics FC 500, je použit 4 znakový protokol ( fenotyp CD45- CD34- a koexprese CD90+ CD105+ ). Vlastní rentgenologické hodnocení hojení je uvedeno níže. Výsledky a závěr: Aplikace PRP, zhodnoceno máme 50 pacientů. Studie demonstrovala signifikantní elevaci v klinickém hodnocení u Lysholmova skóre (p < 0,05), Tegner skóre 25

(p < 0,05), IKDC (p < 0,05) a Cincinnati skóre (p < 0,05) po aplikaci 9 injekcí PRP do kolenního kloubu. Magnetická rezonance však nepotvrdila zvětšení šíře chrupavky (p o 0,05). Posterolaterální fúze páteře: Bylo hodnoceno celkem 80 pacientů, kteří byli rozděleni do 2 stejně velikých skupin. Ve skupině I ( bez BMC s) byla popsána úplná fúze na RTG u 0 případů ve 12 měsících, ve 24 měsících ve 4 případech (10%). Ve skupině II ( s BMC s) byla popsána úplná fúze ve 12 měsících v 6 případech (15%), ve 14 případech (35%) ve 24 měsících po operaci. Statistické zhodnocení těchto výsledků pro obě skupiny prokázalo statistickou významnost na hladině pravděpodobnosti po0,05 (p = 0,041 ve 12 měsících, p = 0,011 ve 24 měsících). CT vyšetření pak prokázalo totální fúzi u 16 případů ve skupině I a 28 případů ve skupině II. 26

Vliv dynamické zátěže na expresi mrna connexinu 43 v hladkých svalových buňkách hrudní aorty Musílková J. 1, Riedel T. 2, Brynda E. 2, Bačáková L. 1 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. 1 Ústav makromolekulární chemie AV ČR 2 V moderních bioarteficiálních cévních náhradách vytvářených metodami tkáňového inženýrství je třeba rekonstruovat přirozené složky cévní stěny, včetně tunica media obsahující hladké svalové buňky (HSB). Jedním z účinných prostředků, jak dosáhnout v podmínkách in vitro fenotypické maturace těchto buněk, je jejich mechanická stimulace. HSB izolované z hrudní aorty potkana jsme proto podrobili zátěži periodického natahování podél jedné osy v dynamickém kultivačním systému STREX. (B Bridge International, Ltd) V jednotlivých vzorcích buněk odebraných v daných časových intervalech jsme sledovali expesi mrna Connexinu 43. Jako referenční gen byl použit β-aktin. Flexibilní silikonové komůrky byly pokryty kolagenem typu I a fibronektinem a osazeny HSB (4 7 pasáž) v hustotě 45 000 buněk / cm2. Po 2 dnech statické kultivace byly komůrky vloženy do dynamického systému STREX a natahovány s amplitudou 5% a frekvencí 0.5Hz. Vzorky jsme odebírali v intervalech 30, 60, 90, 120 min a 48 hod. Po 2 dnech jsme zvýšili frekvenci na 1Hz a odebírali vzorky v časech 15, 30, 60, 90 a 120 min a 24 hod. Paralelně byly v komůrkách kultivovány kontrolní buňky za statických podmínek. Změny exprese connexinu 43 (GJA1) byly měřeny pomocí qrt-pcr. Bylo zjištěno, že exprese GJA1 v HSB za podmínek periodického natahování statisticky významně vzrůstá. Při počátečním natahování při frekvenci 0.5Hz bylo maxima exprese dosaženo po 60min. Po následném zvýšení frekvence na 1Hz došlo prakticky okamžitě k opakovanému zvýšení exprese GJA1, a to téměř 5 vůči kontrolním buňkám s maximem během prvních 30 minut. Později opět došlo ke snížení exprese. Connexin 43 je proteinem skupiny integrálních membránových proteinů connexinů, vytvářejících u obratlovců spojení typu gap junction. Jejich funkcí je vytvoření signálního spojení mezi sousedními buňkami. Lze tedy uzavřít, že dynamická stimulace podporuje mezibuněčnou komunikaci u HSB, a činí tak jejich fenotyp výhodnějším pro rekonstrukci tunica media u cévních náhrad. Ke stimulaci dochází lépe při postupné zátěži kladené na buňky. Podporováno GAČR (granty č. P108/11/1857 a P108/10/1106). 27

Vliv zpracování destičkového lyzátu na hladinu vybraných destičkových faktorů Kubešová B., Karkošková L. Národní Tkáňové Centrum a.s. Úvod: V naší práci jsme hledali vhodný proces získání obsahu alfa granulí z lidských trombocytů. Důvodem našeho snažení jsou vysoké hojivé a biostimulační účinky destičkových faktorů, které mají stimulační vliv na celou řadu buněk. Stimulující účinky jsou popsány na osteoblastech, fibroblastech, cévním endotelu, buňkách získaných z periostu a na mesenchymálních kmenových buňkách. Destičkový lyzát jsme chtěli zpracovat tak aby byl připraven k snadnému použití a aby nedošlo k velkému snížení hladiny vybraných destičkových faktorů. Sledovali jsme destičkové faktory, které mají mohutný biostimulační účinek. To jsou především PDGF (platelet derived growth factor) a TGF-beta (transforming growth factor). V naší práci jsme se rozhodli sledovat z dalších faktorů ještě IGF (insulin like growth factor) a VEGF (vascular endothelial growth factor). Materiál a metodika: PRP (platelet rich plazma) jsme opakovaně zmrazili a rozmrazili, pak sérokonvertovali tak, aby došlo i k inaktivaci komplementu. Z důvodu maximální bezpečnosti jsme provedli inaktivaci patogenů. Výsledný lyzát jsme zlyofilizovali. Na začátku procesu jsme změřili hladiny čtyř destičkových faktorů. Získané hodnoty jsme porovnali s měřením na konci procesu. Změřené hodnoty nevykázaly statisticky významnou odchylku. Závěr: Naše metodika získání a zpracování destičkového lyzátu vede k bezpečnému produktu, který lze využít jak ke kultivaci buněk, tak i ke stimulaci hojení. Toto téma je řešeno v rámci projektu ChronosiX číslo TA02011402 za finanční podpory TA ČR. 28

Validace systému MIRASOL PRT pro inaktivaci patogenů v plazmě bohaté na destičky Karkošková L. 1, Kubešová B. 1, Kocmanová I. 2, Vrba M. 2 Národní Tkáňové Centrum a.s. 1 Fakultní nemocnice Brno 2 Úvod: Mirasol? Pathogen Reduction Technology (PRT) je systém, který zajišťuje inaktivaci virů, bakterií a parazitů v krevních destičkách a v plazmě. Mirasol PRT systém využívá jedinečné vlastnosti riboflavinu (vitamín B2), přirozeně se vyskytující sloučeniny, a ultrafialového světla. Molekuly riboflavinu se spojují s nukleovými kyselinami patogenů. Po následné expozici UV zářením působí chemické změny funkčních skupin nukleových kyselin, což vede k tomu, že patogeny se nemohou replikovat. Jelikož má být redukční systém využit pro inaktivaci patogenů v destičkovém lyzátu, bylo nutné provést validaci systému pro tento specifický produkt. Při nastavení procesu validace jsme vycházeli jednak z doložených postupů efektivity inaktivace od výrobce a jednak z vědeckých publikací. Materiál a metodika: K validaci byly použity dva lékopisné bakteriální kmeny (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) a jeden nelékopisný kmen (Staphylococcus epidermidis) v koncentraci 104 a 106 CFU/ml. Z PRP (platelet rich plasma) bylo opakovaným zamražením a rozmražením připraveno potřebné množství destičkových lyzátů, které byly před kontaminací aplikovány do ozařovacího vaku. Destičkové lyzáty byly kontaminovány bakteriálními kmeny v uvedených koncentracích a následně ozářeny systémem MIRASOL PRT. Příprava bakteriálních kmenů s následnou kontaminací probíhala na Oddělení mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno. Vzorky destičkových lyzátu na bakteriologické vyšetření byly odebrány po provedené kontaminaci (pro potvrzení kontaminace) a po ozáření systémem MIRASOL PRT. Vzorky byly aplikovány do aerobních a anaerobních hemokultivačních lahviček. Kultivace probíhala v kultivačním systému BacT/ALERT? v NTC. Při pozitivitě byly výsledky ještě potvrzeny vyočkováním hemokutivačních lahviček na živné půdy. Závěr: Validace prokázala, že inaktivace byla efektivní už při koncentraci 104 CFU/ml u Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Pro Staphylococcus epidermidis byla efektivní inaktivace prokázána dokonce při koncentraci 106 CFU/ml. Tyto koncentrace vysoce překračují možnou kontaminaci odebrané krve. 29

Rekonštrukcie alveolárnych výbežkov maxilly autológnymi kmeňovými bunkami, biodegradovateľnou matrix, hydroxiapatitom a trombocytárnym lyzátom. Mračna J. 1, Vojtaššák J. 2,3, Stanko P. 1,Danišovič L. 3, Galbavý Š. 4 Klinika stomatológie a maxillofaciálnej chirurgie Lekárskej fakulty UK a OÚSA, Bratislava 1 Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej Univerzity, Trnava 2 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky Lekárskej fakulty UK, Bratislava 3 Ústav súdneho lekárstva Lekárskej fakulty UK, Bratislava 4 Maxilla je často charakterizovaná nedostatkom kostného podkladu pre implantáty. Nedostatok kostného podkladu vzniká zlými anatomickými predpokladmi, atrofiou alveolárnych výbežkov, úrazmi a rôznymi patologickými procesmi. Na riešenie týchto problémov sú používané rôzne techniky sínus elevácií, modifikovaná osteotómia maxily alebo ich vzájomné kombinácie. Operačný zákrok by mal vytvoriť podmienky pre augmentáciu ako zámku vytvorenia kostného podkladu. Na augmentáciu alveolárnych výbežkov maxily boli použité autológne mezenchýmové kmeňové bunky pacientov, biodegradovateľná matrix na báze kolagénu, hydroxyapatit a trombocytový koncentrát alebo trombocytový gél. Autológne mezenchýmové kmeňové bunky boli získané z aspiračnej biopsie kostnej drene z veľkej lopaty bedrovej kosti. Po izolovaní boli expandované v in-vitro podmienkach (37ºC, humidifikovaná atmosféra, 5%CO 2, alfa MEM + 20% BFS) a ich mezenchýmový charakter bol verifikovaný prietokovou cytometriou (pozitivita na cd 34, 90, 105 a negativita cd 45) počas 2-8 týždňov (2. - 6. pasáž). Po dosiahnutí dostatočného počtu buniek (9 až 30. 10 6 ), v závislosti od veľkosti defektu a proliferačnej aktivity buniek, bola časť buniek vysiata na kolagénovú membránu a kultivovaná na nej počas niekoľkých dní. Posledných 24 hodín pred zákrokom boli bunky kultivované v bez sérovom médiu, následne enzymaticky uvoľnené z kultivačných fliaš a použité na kombinovanú aplikáciu v suspenzii v kombinácii s trombocytovým koncentrátom alebo trombocytovým gélom a hydroxiapatitom. Súčasne, ešte pred aplikáciou, bol opätovne verifikovaný ich MSC charakter prietokovou cytometriou. Pooperačný priebeh bol u všetkých pacientov bez komplikácií. S odstupom šiestich až dvanástich mesiacov bolo urobené kontrolné OPG alebo CT vyšetrenie pre porovnanie stavu pred a po zákroku. U pacientov bola pozorovaná tvorba nového tkaniva, ktorého charakter bol verifikovaný histologicky z materiálu odobratého pri osádzaní implantátov. Histológia potvrdila prítomnosť použitého hydroxyapatitu, väzivového a chrupavkovitého tkaniva ako aj tvorbu novej kosti. Štúdia bola podporená grantom MZSR 2007/36-UK-07. 30

Vliv neurotransplantace na motoriku myší s olivocerebelární degenerací Babuška V., Cendelín J., Houdek Z., Kulda V., Čedíková M., Králíčková M., Vožeh F. Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova v Praze Terapie založené na využití embryonálních kmenových buněk (ESC) mají ohromný potenciál pro léčbu různých degenerativních onemocnění. Je však třeba pochopit chování transplantovaných buněk v novém prostředí a jejich způsob ovlivňování svého okolí. Cílem naší práce bylo srovnat chování transplantátu u zdravých myší (Wild) a myší s olivocerebelární degenerací (Lurcher) a zjistit jeho vliv na motorické funkce. Pro transplantaci byly použity neuroprogenitorové buňky odvozené od GFP modifikovaných myších embryonálních kmenových buněk a embryonální tkáň mozečku ve formě suspenze a solidní tkáně. Diferenciace neuroprogenitorů byla ověřena metodou kvantitativní RT-PCR. Všechny transplantáty byly aplikovány do mozečků myší obou typů. Dva a šest měsíců po transplantaci byla u všech myší testována explorační aktivita v otevřeném poli a motorické schopnosti na rotarodu, břevně a hrazdě. Poté byly mozky histologicky vyšetřeny. Statisticky významně častěji přežívaly neuroprogenitory u myší Wild oproti myším Lurcher. Embryonální tkáň mozečku přežívala u obou typů stejně. U myší Wild byl transplantát lokalizován v mozečku, zatímco u myší typu Lurcher byla tato lokalizace vzácná. Purkyňovy buňky byly nalezeny v transplantované embryonální tkáni, u transplantovaných neuroprogenitorů prokázány nebyly. Pozitivní vliv transplantace na motorické funkce prokázán nebyl. 31

Validace výroby léčivého přípravku z mesenchymálních stromální buněk pro léčbu reakce štěpu proti hostiteli Lysák D., Holubová M., Jindra P. Hematologicko- onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň Reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) je jednou se závažných komplikací u pacientů po alogenní transplantaci hemopoetických kmenových buněk. Zásadním způsobem ovlivňuje kvalitu života i mortalitu transplantovaných nemocných. Mesenchymální stromální buňky (MSC) jsou díky svým imunomodulačním vlastnostem slibnou metodou léčby této imunitní komplikace zejména u příjemců špatně odpovídajících na standardní imunosupresivní terapii. Pomocí opakovaných validačních studií jsme ověřovali postupy přípravy léčivého přípravku (LP) z MSC pro budoucí klinické hodnocení léčby steroidně refrakterní GVHD. Cílem bylo otestovat zvolený design výroby a bezpečnost připravených LP. MSC byly izolovány z kostní dřeně zdravých dárců a kultivovány v kompletním mediu (α- MEM + 10 % destičkový lyzát). MSC ze 2.? 3. pasáže byly komplexně charakterizovány (imunofenotyp, viabilita, čistota, sterilita, Mycoplazma) a kryokonzervovány ve formě aliquotů s obsahem cca 1 106 MSC/aliquot. Jako kryoprotektant byl použit 10 % roztok DMSO. Aliquoty byly následně uchovávány v plynné fázi tekutého dusíku. S odstupem zhruba 1 měsíce byl vždy jeden aliquot rozmražen, MSC byly několik dní kultivovány a byla opakována kontrola kvality včetně ověření růstové schopnosti. Při splnění všech kritérií (viabilita nad 70 % po rozmražení; sterilní, negat. Mycoplazma, typický imunofenotyp a čistota 95 % po kultivaci) byly MSC uvolněné jako meziprodukt pro další výrobu LP. Pro výrobu léčivého přípravku se využilo 5 kryokonzervovaných aliquotů, které po cca 7? 10 denní kultivaci umožňují získat množství MSC dostatečné pro jednu aplikaci příjemci obvyklé hmotnosti (cca 1 106/kg). Kvalita a bezpečnost LP byla před propuštěním znovu kontrolována. Výroba meziproduktů i finálního LP byla prováděna v třídě čistoty A/B. Při všech výrobních procedurách byly sledovány parametry čistoty prostředí v laminárním boxu (částice, spady) a byla prováděna pravidelná monitorace čistého prostoru. V rámci stabilitní studie byly ověřovány imunomodulační vlastnosti kryokonzervovaných a znovu kultivovaných MSC (po 1? 3? 6? 12 měsících skladování). MSC byly po dobu 4 dnů kokultivovány s alogenními lymfocyty stimulovanými phytohemagglutininem (PHA). Byla porovnávána metabolická aktivita (MTT), proliferace (CMT) a aktivace lymfocytů (exprese aktivačních antigenů) v závislosti na přítomnosti či absenci MSC. Přidání MSC do kultury vedlo s poklesu počtu dělících se lymfocytů (pokles absorbance z 35 na 11, medián, p<0,0001), snížení jejich metabolické aktivity (pokles mediánu absorbance z 1,4 na 1,0 p<0,0001). Intenzita exprese antigenů CD 25 a CD69 na CD 4+ i CD8+ lymfocytech se bez přidání MSC zvyšovala, zatímco při kokultivaci s MSC nedocházelo ke změnám kinetiky obou antigenů. Také absolutní hodnota exprese těchto znaků byla po přidání MSC signifikantně nižší po celou dobu kokultivace (<0,0001). Imunomodulační vlastnosti MSC nebyly ovlivněny dobou skladování meziproduktu. Ověřili jsme metodu přípravy LP z kryokonzervovaného meziproduktu MSC a potvrdili trvající imunosupresivní potenciál kryokonzerovovaných a následně expandovaných MSC. Kryokonzervované aliquoty MSC jsou optimálním východiskem přípravy LP pro léčbu GVHD, umožňují v krátké době připravit MSC v potřebném množství a zároveň podávat pacientovi při všech konsekutivních aplikacích MSC ze stejného meziproduktu, od stejného dárce. Práce byla podpořena grantem Nadace pro transplantaci kostní dřeně. 32