Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Fakulta veterinárního lékařství Palackého třída 1946/1, 612 42 Brno CERTIFIKOVANÁ METODIKA Intrafolikulární injekce u skotu. Autoři doc. MVDr. Svatopluk Čech, Ph.D. MVDr. Michaela Andrlíková MVDr. Eva Indrová MVDr. Jana Nováková Ing. Luboš Žilka Metodika vznikla v rámci řešení projektu IGA č. 6/2011/FVL IGA VFU. 2017
ISBN 978 80 7305 789 3
OBSAH I) II) Úvod Cíl metodiky 4 6 III) Vlastní popis metodiky 6 IV) Srovnání novosti postupů 10 V) Popis uplatnění metodiky 11 VI) Ekonomické aspekty 11 VII) Seznam použité literatury 12 VIII) IX) Seznam publikací předcházejících metodice Seznam zkratek 13 13
I) Úvod Injekce hormonálních preparátů přímo do ovariálních struktur byla popsána v roce 1953 (Paredis a Vandeplassche 1953). Transvaginální intracystická injekce humánního choriového gonadotropinu (hcg) byla provedena krátkou injekční jehlou napojenou přes dlouhou hadičku na injekční stříkačku. Jehla byla zavedena co nejhlouběji do pochvy a pod rektální kontrolou vbodnuta do cílového útvaru. Po odsátí části obsahu cysty byl připojenou stříkačkou injikován roztok hcg (250 2500 IU v objemu 1 5 ml destilované vody). Transvaginální injekce hcg do ovariálních cyst se však pro relativní náročnost uplatnila jen omezeně (Holý a Kudělka 1958, Holý 1962, Bühner a Liebetrau 1963, Pepper 1973), tato technika však znamenala předstupeň, na který bylo možné později navázat. Po vypracování metody transvaginální sonografické punkce vaječníků (ovum pick-up, OPU) (Pieterse et al. 1988) se intraovariální injekce dostala na vyšší úroveň. Nástroje k intraovariální injekci jsou zapracovány do zařízení pro OPU, tím se injekce zpřesnila a je možno ji provést i do malých ovariálních struktur. Různé modifikace původních instrumentů pro OPU používané pro intrafolikulární injekci (Gastal, Kot et Ginther 1995, Hanstedt et al. 2011) mají podobnou konstrukci. V pracovním tubusu plastového držáku sonografické sondy je namísto klasické aspirační jehly veden dlouhý nástroj (přibližně 50 cm), jehož kanálek nebo jehla se zcela vyplní určenou substancí (léčivem, roztokem). Na vyústění kanálku na vnějším konci nástroje je připojena injekční stříkačka, která tlakem pístu vpraví požadovaný objem roztoku (0,1 0,3 ml) do cílového útvaru. Jehla je při injekci viditelná jako echogenní útvar v dutině folikulu, proudění tekutiny do folikulu je po dobu tlaku na píst stříkačky viditelné na obrazovce sonografu (Kot et al. 1995, Bergfelt et al. 1998). K intrafolikulární injekci (intrafollicular treatment, IFT) byly použity dvoukanálové jehly, kdy vnější jehla měla průměr 20G a vnitřní jehla 25G. Vnější jehla pronikala přes poševní stěnu, peritoneum a ovariální stroma a vnitřní jehla pak přímo do folikulu (Kot et al. 1995, Shahiduzzaman et al. 2010). Technikou transvaginální intraovariální injekce byly aplikovány různé aktivní substance do vaječníků u krav i klisen. Efekt punkce folikulu a současné intrafolikulární injekce pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) na následný folikulární vývoj, ovulaci a formaci žlutého tělíska byl zkoumán u jalovic. Za 3 dny po ošetření prostaglandiny byl aplikován PBS (0,2 ml) do preovulačního folikulu za použití 25G jehel. Při hodnocení průměru dominantního folikulu před ovulací, v termínu ovulace po ošetření prostaglandiny, v termínu první detekce a průměru žlutého 4
tělíska nebyly zjištěny diference mezi ošetřenými a kontrolními zvířaty (Bergfelt et al. 1998). Stejným vybavením byly do preovulačních folikulů injikovány oocyty (6 7 oocytů v 0,2 ml transferového média na folikul). Bezprostředně po injekci byl aplikován LH a jalovice byly inseminovány. Z celkového počtu 43 oocytů bylo zpětně získáno 16 oocytů/embryí (37 %), z čehož byla polovina (8) embryí (Bergfelt et al. 1998). Efekt aplikace hcg do dominantního folikulu u jalovic v D6 (průměr 13 19 mm) je závislý na použité dávce. Po aplikaci 1,0 IU nastala ovulace u všech pokusných zvířat (3/3), po aplikaci 0,1 IU u 75 % (3/4). Po aplikaci 0,01 IU ovulace nenastala a u poloviny zvířat se vytvořily cystické folikuly. Na základě propočtu množství receptorů ve folikulu a počtu molekul hcg v jedné mezinárodní jednotce autoři vypočítali, že dostačující dávka pro IFT je kolem 1/10 000 systémové dávky (Kot et al. 1995). Byl prokázán vliv intrafolikulární injekce IGF1 na interfolikulární vztahy u jalovic. Aplikace IGF1 do druhého největšího folikulu v čase očekávaného začátku deviace (průměr prvního největšího folikulu 8,2 mm) vedla ke zvýšení koncentrace estradiolu a androstendionu (Ginther et al. 2004) a ke ztrátě dominance největšího folikulu, kterou převzal folikul po injekci IGF1 (Shahiduzzaman et al. 2010). Práce popisující technické aspekty intrafolikulární injekce (intrafollicular treatment, IFT) řeší zejména maximální ostrost jehel a jejich průměr (většinou 25G Kot et al. 1995, Bergfelt et al. 1998 nebo 0,45 mm Hanstedt et al. 2011). Nezbytná je jemná manipulace s vaječníkem s co nejnižším tlakem prstů, eventuálně fixace vaječníku pouze za mesovarium (Hanstedt et al. 2011) a uvolnění vaječníku okamžitě po IFT. To vše je důležité pro minimalizaci vnějšího tlaku na vaječník a zabránění postinjekčního výtoku folikulární tekutiny (Shahiduzzaman et al. 2010), který je pravidelně popisován (Gastal et al. 1995, Kot et al. 1995, Bergfelt et al. 1998). Mezi hlavní problémy doprovázející IFT patří ruptura folikulu při manipulaci, nemožnost udržet jehlu před a během aplikace v dutině folikulu a přílišná redukce průměru folikulu po IFT (Kot et al. 1995). Autoři doporučují vést jehlu při injekci přiměřeně velkou hloubkou ovariálního stromatu (3 mm), aby se předešlo úniku folikulární tekutiny (Kot et al. 1995, Shahiduzzaman et al. 2010, Hanstedt et al. 2011). Každá injekce se provádí novou jehlou, protože po jednom použití již ostrost nedostačuje. Kritériem úspěšnosti IFT je viditelná echogenní turbulence v dutině folikulu v okamžiku aplikace a zachování tvaru folikulu po aplikaci (Bergfelt et al. 1998). 5
II) Cíl metodiky Cílem metodiky intrafolikulární injekce u skotu bylo vypracovat takový postup IFT, který minimalizuje možnost poškození folikulu, nezvyšuje intrafolikulární tlak během injekce, je rychlý a proveditelný ve stájových podmínkách. Metodika využívá nový aplikační nástroj vyvinutý speciálně pro tuto činnost. III) Vlastní popis metodiky Metodika intrafolikulární injekce (dále metodika ) je modifikací postupu transvaginální ultrasonografické punkce vaječníků u krav (metoda ovum pick-up, OPU). Obvyklý postup při OPU začíná zavedením tyčového plastového držáku sektorové ultrazvukové sondy na patřičné místo v poševní klenbě. Vaječník je přitlačen manuálně per rectum proti sondě, tím jsou všechny struktury přítomné na vaječníku vizualizovány na obrazovce sonografu. Mezi aktivní plochou sondy a vaječníkem se nyní nachází pouze tenká poševní stěna, přes kterou lze snadno a bez následků proniknout aspirační jehlou. V horní části držáku sondy je zabudován kovový vodicí tubus, ve kterém operatér pohybuje jednorázovou aspirační jehlou (zpravidla 17G, délka 60 cm), napojenou na podtlakový aspirační systém. Špička jehly pronikající do folikulu je viditelná na obrazovce sonografu, operatér podle situace na obrazovce ovládá jednou rukou držák a jehlu, druhou rukou vaječník a nohou spínač podtlakové aspirační pumpy. Aspirační puma generuje regulovaný podtlak, který aspiruje obsah punktovaných útvarů do sběrné nádobky. K odběru folikulární tekutiny může být využit zkrácený aspirační systém, kdy je přímo na hadičku napojena injekční stříkačka ovládaná pomocníkem. Nový aplikační nástroj využitý v metodice modifikuje výše popsaný systém OPU. Liší se náhradou vodiče aspirační jehly a samotné aspirační jehly speciálním mechanismem v horní části tyčového držáku. Součástí je rovněž aplikační systém, který umožňuje injekci účinných látek do folikulárních útvarů. 6
Popis zařízení k intrafolikulární injekci Zařízení se skládá z těchto částí: 1) Ultrazvuková sonda 2) Držák sondy 3) Vodící tubus 4) Dvoukanálový vodič punkční jehly 5) Punkční jehla 6) Aplikační souprava Popis jednotlivých částí (obr. 1, 2, 3): Ultrazvuková sonda (1) Pro aspiraci je možné použít standardní ultrazvukovou sondu. Ultrazvuková sonda je v držáku (2) umístěna pod úhlem tak, aby při vlastní manipulaci bylo možné dobré zobrazení aspirační jehly na obrazovce sonografu. Držák sondy (2) Je vyroben ze dvou plastových dílů, které jsou spojeny šrouby. Do držáku je upevněna sonda (1) a vodící tubus (3). Pro snadnou údržbu je možné držák rozmontovat. Vnější rozměry a délka držáku sondy umožňuje svou konstrukcí bezproblémové zavedení do pochvy vyšetřovaného zvířete. Vodící tubus (3) Je vyroben z trubičky. Je uložen v držáku sondy (2) a slouží pro zavedení vodiče punkční jehly (4) a jeho volné posouvání. Dvoukanálový vodič punkční jehly (4) Je vnitřní pohyblivá část, kterou operatér pohybuje při vlastní aspiraci společně s punkční jehlou (5). Vodič punkční jehly (4) obsahuje ve vnitřní části dva kanálky, které ústí vedle sebe na vrcholu kónického zakončení přední části vodiče do konusu jediné injekční jehly (5). Na zadním konci je vodič punkční jehly 4 opatřen dvěma vývody s koncovkami typu 7
Luer (7), pro každý kanálek zvlášť. Na vývody se připojuje vyměnitelná aplikační souprava (6). Mezi oběma vývody se nachází držadlo (8) pro manipulaci při vlastním operačním zákroku. Punkční jehla (5) Je použita standardní jednorázová injekční jehla typu Luer odpovídající délky a průměru (nejčastěji 0,5-0,7x40 mm). Aplikační souprava (6) Na vývody kanálků (7) vodiče jehly jsou připojeny zkrácené infuzní hadičky (11) zámkem typu Luer. Pro napojení aspirační a aplikační stříkačky slouží zkrácené injekční jehly 18G (9). Zesílené konce jehel (10) umožňují jejich těsné zasunutí do zkrácených konců infuzních hadiček. Do injekčních jehel se napojí injekční stříkačky o objemu 1 ml (12). Obr. 1: Kompletní zařízení k intrafolikulární injekci 8
Obr. 2: Schéma zařízení k intrafolikulární injekci Obr. 3: Schéma aplikační soupravy 9
Metodický postup intrafolikulární injekce Základním předpokladem úspěšného provedení IFT je dokonalá fixace zvířete, sedace zpravidla není nutná. U zvířete je provedena epidurální anestezie, po nástupu účinku je vyprázdněno rektum a provedena očista a desinfekce vulvy i perianálního prostoru. Před zavedením vodiče jehly (4) do vodícího tubusu (3) v držáku sondy (2) se zkompletuje aplikační souprava (6). Dvě injekční stříkačky (12) (aspirační stříkačka prázdná, aplikační stříkačka obsahující léčivý přípravek) se spojí přes zkrácené infuzní hadičky (11) se dvěma vývody (7) na zadním konci vodiče punkční jehly (4). Kromě operatéra je potřebný pomocník, který manipuluje se stříkačkami. Tlakem na píst aplikační stříkačky se aplikační kanálek zcela vyplní potřebným léčivým přípravkem, tím se z něj vytlačí vzduch (0,35 ml) a na přední kuželový konec vodiče punkční jehly (4) se nasadí punkční jehla (5). Držák sondy (2) se zavede jednou rukou hluboko po pochvy zvířete tak, aby stěna poševní byla napjatá. Aktivní plocha sonografické sondy (1) se dotýká poševní klenby v místě, kde se za poševní stěnou v dutině břišní nachází vaječník, který per rectum přidržuje operatér pomocí prstů druhé ruky. Operatér za pomoci sonografické sondy (1) vyhledá cílový útvar na vaječníku (folikul, cysta). Vodič punkční jehly (4) s napojenou aplikační soupravou se zavede do vodícího tubusu (3) tak, aby aspirační jehla (5) nevyčnívala před držák sondy (2). Operatér za pomoci sonografické sondy (1) vyhledá optimální místo pro vpich punkční jehly, který je proveden pohybem celého nástroje za držadlo (8). Pomocník odsaje aspirační stříkačkou potřebný objem folikulární tekutiny (0,1 0,5 ml) do aspiračního kanálku a dále do aspirační stříkačky. Vzápětí tlakem na píst aplikační stříkačky aplikuje stejné množství léčivého přípravku z aplikačního kanálku a aplikační stříkačky do folikulu. Na obrazovce sonografu je moment aplikace přípravku zřetelně viditelný jako krátká turbulence způsobená výstřikem tekutiny ze špičky injekční jehly. Následně je vodič punkční jehly (4) zatažen do držáku sondy (2) a celý instrument je opatrně vyjmut z pochvy zvířete. IV) Srovnání novosti postupů Metodika využívá modifikovaný nástroj pro OPU. Nejdůležitější součástí a zároveň hlavní inovací je dvoukanálový válcový vodič jehly, který se pohybuje ve vodícím tubusu umístěným v horní části speciálně upraveného plastového držáku sondy obdobně jako u původního systému OPU, rozměry a tvarem se však liší. Oba kanálky vodiče jehly začínají 10
každý zvlášť ve vývodech v zadní části vodiče a ústí naopak těsně vedle sebe na vrcholu konusu v přední části vodiče tedy do jediné injekční jehly. Jednoduchá aplikační souprava složená ze dvou stříkaček a hadiček umožní ovládat oba kanálky odděleně. Nejprve se odsaje část folikulární tekutiny a vzápětí se ve stejném objemu do folikulu vpraví účinná látka. Během aplikace tedy nedochází ke zvýšení intrafolikulárního tlaku a po vytažení jehly z folikulu nehrozí riziko úniku obsahu dutiny folikulu nebo dokonce ruptura folikulu. Podobný instrument nebyl doposud popsán ani v mezinárodním měřítku. V) Popis uplatnění certifikované metodiky Metodika intrafolikulární injekce je určena především pracovištím zabývajícím se klinickým výzkumem reprodukce velkých zvířat. Metodika umožní intrafolikulární nebo intracystickou injekci různých účinných látek za účelem ovlivnění reakce samotné cílové struktury nebo oocytu uvnitř ošetřeného folikulu. U zvířat po ošetření mohou být provedeny další analýzy vnitřního prostředí. Metodika je určena primárně pro skot, ale může být prováděna i u ostatních druhů velkých zvířat (koně, exotická zvířata). Tato metodika otevírá cestu perspektivní oblasti klinického výzkumu v reprodukci u velkých zvířat. Využití v praxi k řízení reprodukce v komerčních chovech se předpokládá výjimečně. VI) Ekonomické aspekty Metodika intrafolikulární injekce není primárně určena ke komerčnímu využití a nebude generovat zásadní ekonomický přínos pro uživatele. Hlavním přínosem je samotná možnost zákroku, která v našich podmínkách před vypracováním metodiky neexistovala. Náklady na pořízení nového nástroje k provádění odběrů jsou 25 000,- Kč (výroba držáku sondy 15 000,- Kč, výroba držáku jehly 10 000,- Kč). Prostou kalkulací nákladů může být zhodnocena ekonomika indukce ovulace pomocí IFT a běžně používaná intramuskulární aplikace GnRH. Náklady na léčiva pro intramuskulární injekci za účelem indukce ovulace jsou přibližně 40 Kč v závislosti na použitém preparátu. Náklady na léčiva pro indukci ovulace pomocí IFT jsou přibližně 10 Kč (10 UI hcg a epidurální anestezie). Rozdíl v nákladech na léčiva je 30 Kč na jedno ošetření. Indukce ovulace pomocí IFT může být provedena u případů ovariální acyklie, ovariálních cyst nebo u synchronizace metodou Ovsynch (2 injekce GnRH). Ve stádě 500 krav se ročně provádí cca 100x ošetření poruch ovulace (rozdíl v nákladech na GnRH je 3 000,- Kč) a cca 300x 11
synchronizace Ovsynch (rozdíl v nákladech na GnRH je 18 000,- Kč) v závislosti na četnosti poruch ovulace a úrovni zabřezávání. V prvním roce používání IFT je po odečtení pořizovacích nákladů nulová úspora nákladů na léčiva, v dalších letech pak 21 000 Kč ročně. Tato kalkulace však nezahrnuje pracovní náklady, které jsou určeny tržním způsobem a u jednotlivých chovatelů se zásadně liší. S ohledem na pracovní náročnost IFT metoda najde uplatnění především ve výzkumu v oblasti reprodukce velkých zvířat. VII) Seznam literatury Bergfelt D. R., Brogliatti G. M., Adams G. P. (1998): Gamete recovery and follicular transfer (GRAFT) using transvaginal ultrasonography in cattle. Theriogenology 50, 15-25. Bühner F., Liebetrau R. (1963): Treatment of ovarian cysts in cattle by direct ovarian injection of chorionic gonadotropin. Tierärztliche Umschau 18, 232-234, 239-240. Gastal E. L., Kot K., Ginther O. J. (1995): Ultrasound-guided intrafollicular treatment in mares. Theriogenology, 44, 1027-1037. Ginther O. J., Bergfelt D. R., Beg M. A., Meira C., Kot K. (2004): In vivo effects of an intrafollicular injection of insulin-like growth factor 1 on the mechanism of follicular deviation in heifers and mares. Biology of Reproduction 70, 99-105. Hanstedt A., Stinshoff H., Piechotta M., Bollwein H., Wrenzycki C. (2011): Ultrasoundmediated intrafollicular injection and aspiration of bovine follicles. Reproduction in Domestic Animals 48, 18. Holý L., Kudělka E. (1958): Hormonální terapie při cystosní degeneraci ovarií u skotu. Veterinární Medicína, 705. Holý L. (1962): Příspěvek k etiotropní léčbě ovariálních cyst u skotu choriongonadotropními hormony. Veterinární Medicína, 593-602. Kot K., Gibbons J. R., Ginther O. J. (1995): A technique for intrafollicular injection in cattle: Effects of hcg. Theriogenology 44, 41-50. Paredis F., Vandeplassche M. (1953): Intrafollicular administration of pregnancy urine hormone (P.U.) as a treatment for nymphomania in dairy cattle. Proceedings of the 15th International Veterinary Congress 163, 738-742. Pepper R. T. (1973): A technique for intracystic injection in the treatment of cystic ovarian disease in bovine animals. The Veterinary Record 92, 16. Pieterse MC, Kappen KA, Kruip TAM, Taverne MAM, 1988: Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology 30 751-762. Shahiduzzaman A. K. M., Beg M. A., Palhao M. P., Siddiqui M. A. R., Shamsuddin M., Ginther O. J. (2010): Stimulation of the largest subordinate follicle by intrafollicular treatment with insulin-like growth factor 1 is associated with inhibition of the dominant follicle in heifers. Theriogenology 74, 194-201. 12
VIII) Seznam publikací předcházejících metodice Cech S, Dolezel R, Indrova E, Lopatarova M, Mala J, Pechova A (2011): Limitations of ultrasound guided follicular aspiration for analysis of ovarian follicular fluid in dairy cattle. Acta Vet., 80, 179-184. Cech S, Mala J, Indrova E, Lopatarova M, Dolezel R, Dluhosova H, Zilka L (2013): The introduction of a double-channel system for the intrafollicular treatment of cattle. Veterinarni Medicina, 58, 10-15. Mala J, Beckers J - F, Melo de Sousa N, Indrova E, Lopatarova M, Dolezel R, Cech S. (2013): Intrafollicular LH administration in dairy heifers treated with a GnRH agonist. Veterinarni Medicina, 58, 81-86. Mala J, Beckers J - F, Melo de Sousa N, Indrova E, Lopatarova M, Dolezel R, Cech S (2013): Determination of minimum effective doses of luteinizing hormone and human chorionic gonadotropin for intrafollicular treatment to induce ovulation in dairy heifers. Acta Vet. Brno, 82, 375-379. IX) GnRH hcg IFT IGF1 IU LH PBS OPU Seznam zkratek gonadotropiny uvolňující hormon humánní choriový gonadotropin intrafolikulární injekce inzulínu podobný růstový faktor mezinárodní jednotka luteinizační hormon pufrovaný fyziologický roztok transvaginální sonografická aspirace oocytů 13
Vydal: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého tř. 1, 612 42 Brno Název: INTRAFOLIKULÁRNÍ INJEKCE U SKOTU Autoři: doc. MVDr. Svatopluk Čech, Ph.D. MVDr. Michaela Andrlíková MVDr. Eva Indrová MVDr. Jana Nováková Ing. Luboš Žilka Oponenti: Ing. Jan Vodička Ministerstvo zemědělství odbor živočišných komodit Těšnov 65/17, 110 00 Praha prof. MVDr. Jiří Rubeš, CSc. VÚVeL, v. v. i. Hudcova 70, 621 00 Brno ISBN 978 80 7305 789 3 Dedikace metodiky Metodika byla vyvinuta za podpory grantu IGA č. 6/2011/FVL IGA VFU. Vydáno bez jazykové úpravy. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno