FUSARIUM MYCOTOXINS IN THE GRAIN OF BARLEY FUSARIOVÉ MYKOTOXINY V ZRNU JEČMENE JARNÍHO Marková J. 1, Lancová K. 2, Ehrenbergerová J. 1, Vaculová K. 3 1 Ústav pěstování, šlechtění a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělsk a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. 2 Vysoká škola chemicko technologická v Praze 3 Zemědělský výzkumný ústav Kroměříž, s.r.o. E-mail: markova.jaroslava@seznam.cz, ehren@mendelu.cz ABSTRACT The aim of this work was to determinate content of the most frequent Fusarium toxins and others species of fungi in the grain of barley. In term of content of mycotoxins was also evaluated the influence of growing localities and fungicide treatment. The multidetection method of high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometer (LC/MS-MS) was used to determine selected mycotoxins in grain samples. The highest levels of the studied toxins were found in the locality Kroměříž. In the fungicide treatment barley samples were levels of contaminations higher than in samples which were not chemically treated. The hygienic standard for tolerance limit for deoxynivalenol in non-processed cereals was not exceeded in any analyzed samples. Key words: barley, deoxynivalenol, r.fusarium. 1
ÚVOD V minulosti nebyl jarní ječmen považován za hlavní hostitelskou rostlinu pro houby rodu Fusarium, ale v současné době se ukazuje, že i na jarním ječmeni je v některých letech silné napadení. Tato změna může souviset se změnami v průběhu počasí (celkové oteplení, několik po sobě jdoucích sušších a teplejších let), ale také měnící se odrůdovou skladbou. Mezi další důležité faktory, přispívající k rozvoji těchto patogenů, patří pěstitelské postupy a rotace plodin. Z mykologického hlediska lze v poslední době zaznamenat určitou změnu ve druhovém spektru původců fuzarióz. V České republice je nejčastějším izolovaným druhem F. culmorum (Hýsek et al.,1999) dále F. graminearum, F. avenaceum, F. poae. Za nejzávažnější kontaminanty jsou považovány fusariové mykotoxiny, ke kterým patří skupina trichothecenů (DON, NIV, Fus-X, HT-2, T-2), fumonisiny a zearelanon. Obiloviny mohou být jimi kontaminovány v průběhu růstu a dozrávání na poli nebo pak po sklizni, při nevhodném skladování. Na základě dosavadních výsledků se jeví jako hygienicky i ekonomicky nejzávažnějším mykotoxinem deoxynivalenol. MATERIÁL A METODIKA V roce 2005 bylo vybráno 12 odrůd jarního ječmene (sladovnické pluchaté odrůdy: Amulet, Bojos, Jersey, Malz, Merlin (bezpluchý), Prestige, Sebastian, Tolar a bezpluché linie vyšlechtěné v Zemědělském výzkumném ústavu Kroměříž: KM 1057, KM 1910, KM 2084, KM 2283).Veškeré genotypy byly pěstovány ve dvou lokalitách (Žabčice, Kroměříž). Porosty z pěstební lokality Žabčice byly pěstovány ve dvou variantách - chemicky neošetřené a nehnojené minerálními hnojivy a variantě chemicky ošetřené proti houbovým chorobám (Cerelux, Horizon 250 EW a Mirage 45 ECNA) a hnojené minerálními hnojivy. Porosty ječmene z pěstební lokality Kroměříž byly chemicky neošetřeny. V roce 2006 bylo z lokality Kroměříž použito stejných odrůd a linií ječmene jako v roce 2005, dále sedm náhradních vzorků odrůd (za lokalitu Žabčice, kde byly porosty v roce 2006 znehodnoceny porůstáním v důsledku nepříznivého počasí) z lokalit Branišovice a Uherský Ostroh - odrůdy Bojos, Jersey, Malz, Prestige, Sebastian, Tolar a linie KM 1910. Porosty ječmene z pěstební lokality Kroměříž byly chemicky neošetřeny. Odrůdy z lokalit Branišovice a Uherský Ostroh byly pěstovány ve dvou variantách - chemicky neošetřené (použito moření a nízká dávka N) a chemicky ošetřené (Secator, Alto Combi 420EC, Tangosuper a hnojené- zvýšenou dávkou N o 40kg.ha -1 ). Analytická metoda Stanovení mykotoxinů jsme provedli ve spolupráci s VŠCHT v Praze pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickým detektorem (LC/MS-MS). Princip metody spočívá v extrakci desintegrovaného vzoreku obiloviny vodným acetonitrilem (Eriksen a Petterson, 2004). Zfiltrovaný extrakt je přečištěn pomocí metody extrakce na tuhou fázi (SPE) za použití kolonky MycoSep TM 226. Alikvot přečištěného extraktu je odpařen na rotační vakuové odparce, a poté převeden do vodného methanolu. Identifikace a kvantifikace analytů je realizována pomocí metody LC/MS-MS po 2
separaci na koloně Synergi Hydro RP (150 mm x 3 mm x 4 µm) s využitím hmotnostního spektrometru LCQ Deca (Finnigen, USA) s analyzátorem typu iontová past. Dodané vzorky ječmene byly vyšetřeny na obsah následujících fusariových mykotoxinů: trichotheceny typu A - HT-2 toxin (HT-2), T-2 toxin (T-2), trichotheceny typu B - deoxynivalenol (DON), nivalenol (NIV), fusarenonu-x (Fus- X), suma l3-acetyldeoxynivalenol a 15-acetyldeoxynivalenol (suma ADON), zearalenon (ZON) Statistické vyhodnocení: Výsledky byly statisticky vyhodnoceny vícefaktorovou analýzou variance s následným testováním rozdílů průměrných hodnot LSD-testem (P = 0,05) (program STATISTICA 7). VÝSLEDKY A DISKUZE Rok 2005 Ve všech vzorcích ječmene byla prokázána přítomnost DONu (jeho hodnoty se pohybovaly v rozmezí hladin vyšších než jeho mez detekce (LOD = 0,5 µg.kg -1 ) až do 170 µg.kg -1. U 28% vzorků ječmene byl prokázán obsah NIVu. Nejvyšší hodnoty obsahu DONu byly zjištěny ve vzorcích vypěstovaných v lokalitě Kroměříž, varianty bez chemického ošetření. Nejnižší hodnoty DONu byly zjištěny ve vzorcích z lokality Žabčice, také bez chemického ošetření. Hladiny ostatních fusariových mykotoxinů ( Fus-X, ADON, ZON) byly pod mezí kvantifikace nebo detekce jednotlivých toxinů. U chemicky neošetřených variant, v lokalitě Žabičce, byla průměrná hodnota DONu 19,05 µg.kg -1, což bylo statisticky významně méně než průměrná hodnota vzorků z lokality Kroměříž 54,10 µg.kg -1. V průměru obou lokalit měla statisticky významně více DONu odrůda Sebastian (96,50 µg.kg -1 ) a statisticky se tak významně lišila (s výjimkou odrůdy Tolar 52,32 µg.kg -1 ) od všech ostatních odrůd s nižším obsahem. Přičemž nejnižší hodnotu DONu vykázala odrůda Merlin (9,05 µg.kg -1 ). Obdobně tomu bylo u NIVu. Byly nalezeny významné rozdíly v obsahu tohoto mykotoxinu z lokalit. Statisticky významně nižší průměrná hodnota byla stanovena u lokality Kroměříž (0,95 µg.kg -1 ) oproti lokalitě Žabičce (4,35 µg.kg -1 ). Nejvyšší hodnotu tohoto mykotoxinu vykázala rovněž odrůda Sebastian (7,70 µg.kg -1 - v průměru obou lokalit) a statisticky významně se lišila od většiny odrůd v souboru. Nejnižší hodnotu NIVu měla odrůda Amulet (0,001 µg.kg -1 ). Z našich pokusů vyplývá, že i napadení zrn houbami r. Fusarium bylo v tomto roce nízké. Nejčastěji izolovaným druhem bylo F. culmorum. (Šafránková et al., 2007). Což koresponduje i s výsledky Hýsek et al. (1999), kteří uvádějí jako nejčastěji izolované druhy r. Fusarium v České republice F. culmorum (70%). 3
Rok 2006 Incidence fusariových mykotoxinů ve vzorcích ječmene Ve všech vzorcích ječmene pěstovaných v lokalitách Branišovice, Kroměříž a Uherský Ostroh byla prokázána přítomnost DONu. Jeho hodnoty se pohybovaly v rozmezí hladin vyšších než jeho mez detekce (LOD = 0,5 µg.kg-1) až po hodnotu 62,1 µg.kg-1. Průměrná koncentrace DONu ve vzorcích ječmene byla 13,1 µg.kg-1. Z trichothecenů typu B byla dále prokázána přítomnost NIV ve 33 % vzorků s maximální hladinou 24,1 µg/kg. Vliv pěstební lokality na hladiny fusariových mykotoxinů Z grafu 1 je patrné, že ve vzorcích zrna ječmene vypěstovaného v Kroměříži byly nejvyšší nálezy sledovaných toxinů ze všech lokalit. Vzorky z této lokality obsahovaly trichotheceny typu A i B. Odrůda ječmene Malz a linie KM 1910 obsahovaly relativně vysoké množství toxického HT-2 toxinu (koncentrace do 65,6 µg.kg -1 ). Vzorky ječmene vypěstované v lokalitě Branišovice byly kontaminovány pouze trichotheceny typu B, dominantním byl DON, avšak hladiny byly velmi nízké (pod 10 µg.kg -1 ). Vzorky ječmene z lokality Uherský Ostroh byly kontaminovány fusariotoxiny typu A i B na velmi nízkých hladinách, suma sledovaných toxinů nepřesáhla hodnotu 25 µg.kg -1. NIV DON HT-2 T-2 obsah fusariových mykotoxinů (µg/kg) 90 75 60 45 30 15 0 pod LOQ Bojos Jersey KM 1910 Malz Prestige Sebastian Tolar Bojos Jersey KM 1910 Malz Prestige Sebastian Tolar Bojos Jersey KM 1910 Malz Prestige Uherský Ostroh Branišovice Kroměříž Sebastian Tolar Graf 1. Vliv pěstební lokality na kontaminaci vzorků ječmene fusariovými mykotoxiny Vliv fungicidního ošetření na obsah fusariových mykotoxinů Vzorky ječmene z lokalit Branišovice a Uherský Ostroh byly pěstovány ve dvou variantách chemicky ošetřeny a neošetřeny. Na základě kontaminace fusariotoxiny těchto vzorků byl diskutován vliv fungicidního ošetření. Spektrum i nálezy trichothecenů byly větší ve vzorcích ječmene fungicidně ošetřených než u vzorků fungicidně neošetřených, viz graf 2-3. Moravcová et al. (2006) uvádějí, že fungicidní ošetření v době metání a kvetení může prodloužit životnost praporcovitého listu i klasu, a tím prodloužit časové období pro možnost 4
vzniku infekce. Velmi důležitá je i doba aplikace fungicidních přípravků, nejvhodněkší termín aplikace je dle Váňové (2006) fáze plného květu. suma fusariových mykotoxinů (ug/kg) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pod LOQ DON NIV Fus-X suma ADON HT-2 T-2 ZON lokalita Uherský Ostroh 1 varianta "chemicky neošetřeno" 2 varianta "chemicky ošetřeno" 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Sebastian Bojos Malz Tolar Prestige Jersey KM 1910 Graf 2. Vliv fungicidního ošetření na hladiny fusariotoxinů v ječmenech z lokality Branišovice. suma fusariových mykotoxinů (ug/kg) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 pod LOQ DON NIV Fus-X suma ADON HT-2 T-2 ZON lokalita Branišovice 1 varianta "chemicky neošetřeno" 2 varianta "chemicky ošetřeno" 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Sebastian Bojos Malz Tolar Prestige Jersey KM 1910 Graf 3. Vliv fungicidního ošetření na hladiny fusariotoxinů v ječmenech z lokality Uherský Ostroh Statisticky významně vyšší (P=0,05) obsah DONu byl stanoven u vzorků z lokality Kroměříž (25,528 µg.kg -1 ) oproti lokalitám Uherský Ostroh (8,992 µg.kg -1 ) a Branišovice (6,392 µg.kg -1 ). Statisticky významné zvýšení průměrného obsahu deoxynivalenolu bylo zjištěno u sladovnické odrůdy Sebastian (30,716 µg.kg -1 ) a bezpluché linie KM 1910 (20,350 µg.kg -1 ) oproti ostatním odrůdám. Statisticky významně nižší průměrný obsah, oproti všem odrůdám s výjimkou odrůdy Malz (6,833 µg.kg -1 ), byl zaznamenán u odrůdy Tolar (5,483 µg.kg -1 ). 5
ZÁVĚR Obsah mykotoxinů byl významně ovlivňován jak odrůdou, tak pěstebními lokalitami, přičemž za tyto dva roky (2005,2006) nebyl překročen u žádného vzorku zrna ječmene hygienický limit pro obsah DONu v nezpracovaných cereáliích (nejvyšší přípustné množství - NPM=1250 µg.kg -1 ), který je deklarován Směrnicí Evropské komise č. 856/2005 z 6. června 2005. Lze konstatovat, že výskyt fusariových mykotoxinů ve vzorcích zrna ječmene za oba roky byl nízký. Z mykologického hlediska vyplývá též nízké napadení zrn houbami r. Fusarium V obou letech bylo možné sledovat relativně vyšší obsah DONu ve zrnu ječmene vypěstovaného v lokalitě Kroměříž. LITERATURA Eriksen G., Petterson H. (2004): Toxicological evaluation of trichothecenes in animal feed. Animal Feed Science and Technology 114: 205-239. Hýsek J., Váňová M., Hajšlová J., Radová Z., Koutecká J., Tvarůžek L (1999): Fusarioses of barley with Emphasis on the Content of Trichothecenes. Plant. Protection Science, 36(5): 96-102. Moravcová H., Nedělník J., Ostrý V. (2006): Kontaminace pšenice fuzáriovými a alternáriovými toxiny. Úroda 9: 20-23. Směrnice komise č. 2005/38/ES z 6. června 2005, kterou se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství fusariových toxinů v potravinách Šafránková I., Marková J., Vejražka K., Hübschová J., Ehrenbergerová J., Vaculová K. (2007): Mykoflŕa zrn ječmene jarního se zaměřením na druhy r. Fusarium. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis 1:165-171. Váňová M., Hobzová D. (2001): Choroby jarního ječmene a ochrana proti nim. Úroda 4:8-9. Příspěvek byl vypracován za podpory Výzkumného centra pro studium obsahových látek ječmene a chmele 1M0570. 6