Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer Virologie a diagnostika Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno
Alternativní biologické rozpoznávací elementy rekombinantní protilátky nanoprotilátky modifikované bakteriofágy aptamery peptidové scaffoldy
I. Rekombinantní protilátky Protilátkové fragmenty připravené rekombinantními technologiemi
Formáty rekombinantních protilátek VH VL CH1 CL CH2 VH VL CH3 CH1 CL VH VL VH VL VH VL IgG Fab scfv dsfv
Technologie přípravy rekombinantních protilátek B-lymfocyty / hybridomy izolace genetického materiálu fágová knihovna selekce a izolace protilátky vázající antigen expresní systém produkce protilátky
Izolace genetického materiálu B-lymfocyty/hybridomy mrna cdna VL VH primer linker VL VH restrikční místo VL VH
Konstrukce fágové knihovny elektroporace fágemid bakteriální buňka amplifikace fága fágová knihovna
Fágová knihovna Heterogenní směs fágových částic obsahujících různé protilátkové geny exprimující různé fágové protilátky Fág M13
Fágová knihovna Naivní knihovna Knihovna získaná z imunizovaných zvířat Syntetická knihovna
Biopanning selekce fágové protilátky s nejvyšší afinitou k antigenu analogie klonální selekce in vivo
Biopanning Inkubace knihovny s imobilizovaným antigenem Odmytí Odmytí Eluce Eluce Reamplifikace fága
Izolace pozitivního fágového klonu
Produkce rekombinantní protilátky v expresním systému Přenos genu pro rekombinantní protilátku do expresního systému Bakterie (E. coli, B. brevis) Kvasinky (Saccharomyces, Pichia) Savčí buňky Hmyzí buňky Geneticky modifikované rostliny
Produkce rekombinantní protilátky v expresním systému VL VH Signální sekvence His-tag Transport do periplazmatického prostoru nebo ven z buňky Purifikace protilátky afinitní chromatografií
Afinitní maturace in vitro: zvýšení afinity rekombinantní protilátky Mutageneze a rekombinace Analogie afinitní maturace in vivo
Metody afinitní maturace in vitro Náhodná mutageneze error prone PCR bakteriální mutátorové kmeny Místně řízená mutageneze PCR s degenerovanými primery Přeskupování přeskupování řetězců přeskupování DNA
I. Náhodná mutageneze error prone PCR bakteriální mutátorové kmeny
II. Místně řízená mutageneze PCR s degenerovanými primery
III. Rekombinační technologie přeskupování řetězců přeskupování DNA
Přeskupování řetězců VL VL VL VL VL VL vyštěpení endonukleázami smíchání a opětovné spojení ligázou VH VH VH VH VH VH VL VL VL VH VH VH klonování do fágemidu + selekce
Přeskupování DNA 1 2 3 4 5 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 6 7 8 naštěpení na krátké fragmenty 9 7 1 4 6 PCR 7 3 2 6 4 1 7 3 9 5 1 6 3 8 klonování do fágemidu + selekce
Výhody rekombinantních protilátek tvorba protilátky bez imunizace zvířat neomezená produkce genetická manipulace - změna afinity a specifity Nevýhody rekombinantních protilátek nižší affinita a specifita oproti klasickým protilátkám
Nanoprotilátky Protilátky tvořeny těžkým řetězcem Výskyt u čeledi Camelidae a některých paryb Nanoprotilátka Konvenčí protilátka Protilátka tvořená těžkým řetězcem
Nanoprotilátka versus scfv fragment VH nanoprotilátka
Výhody nanoprotilátek Malá velikost penetrace do buněk a tkání Neobvyklé paratopy Vysoká rozpustnost a stabilita Genetické manipulace změna afinity a specifity Nízká imunogenicita diagnostický a TERAPEUTICKÝ potenciál
Aplikační možnosti nanoprotilátek diagnostika a inaktivace patogenů identifikace toxinů a detoxifikace diagnostika malých molekul haptenů diagnostika a terapie nádorových onemocnění imunoafinitní chromatografie biosenzory
II. Bakteriofágy Fágy exprimující na povrchu krátké peptidy rozpoznávající antigen
Bakteriofágy Technologie fágového displeje Využití bakteriofága pro vývoj vysoce citlivých imunoanalytických metod
Fágová peptidová knihovna velikost: 10 12 jednotlivých fágových klonů -GG-C(X) 6-8 C(GGGGS) 3 -
Phage anti-immunocomplex real-time PCR Nekompetitivní imunoanalytická metoda pro detekci malých molekul Rozpoznání imunokomplexu protilátka-analyt Kvantifikace pomocí RT-PCR bakteriofág eluce fágová DNA analyt protilátka fágový peptid RT-PCR
Výhody PHAIA-PCR oproti klasické ELISA Rychlá selekce pozitivního fágového kmene Vyšší citlivost metody - PCR amplifikace Nekompetitivní metoda pro detekci malých molekul
III. Aptamery syntetické oligonukleotidy vázající cílové molekuly
Aptamery ssrna nebo ssdna délka: 30-40 bazí interakce s ligandem založena na vodíkových vazbách
Sekundární a terciární struktury aptamerů
Technologie SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment selekce aptameru s nejvyšší afinitou k antigenu oligonukleotidová knihovna screening cílová molekula regenerace vazba amplifikace cyklů odmytí eluce
Aplikační možnosti aptamerů flow cytometrie kapilární elektroféza elektrochromatografie afinitní chromatografie biosenzory terapie
Výhody aptamerů vysoká stabilita a životnost netřeba imunizovat zvířata rychlá selekce funkčního aptameru
IV. Peptidové/proteinové scaffoldy peptidy nebo proteiny vázající se s vysokou afinitou k cílovým molekulám
Proteinový scaffold hypervariabilní smyčky interakce s ligandem scaffold tvořený α-helixy nebo β-listy hypervariabilní smyčky
Výhody scaffoldů vysoká strukturní stabilita vysoká rozpustnost snadná exprese široký aplikační potenciál
University of California, Davis, USA Department of Entomology Nanoprotilátky Bakteriofágy
Děkuji Vám za pozornost. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno