ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra mikrobiologie, výţivy a dietetiky Porovnání ekotoxikologických a mikrobiologických testů při hodnocení zátěţe půdy DISERTAČNÍ PRÁCE Autor: Školitel: Ing. Vladimír Dvořák prof. Ing. Karel Voříšek, CSc. Praha 2009
Poděkování: Děkuji školiteli panu prof. Ing. Karlu Voříškovi, CSc., za odborné vedení v průběhu doktorského studia, za cenné rady při zakládání testů a za odbornou pomoc se zpracováním a měřením výsledků a se zpracováním doktorské práce. Dále děkuji pracovníkům Katedry biologie Univerzity Hradec Králové za vytvoření podmínek pro moje studium a za umoţnění výzkumné práce po celou dobu doktorského studia. Dále děkuji Doc. RNDr. Františku Malířovi, Ph.D., za poskytnutí cenných rad a literatury při zpracování disertační práce a také děkuji Zdravotnímu ústavu v Hradci Králové, oddělení biologických analýz, kde jsem mohl část testů v rámci své disertační práce prakticky vykonat. 2
Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem disertační práci na téma Porovnání ekotoxikologických a mikrobiologických testů při hodnocení zátěţe půdy vypracoval samostatně a uvedl pravdivé výsledky. Datum: Podpis autora: 3
Abstrakt Ekotoxikologické i mikrobiologické testy jsou v posledních letech čím dál více vyuţívány při hodnocení nepříznivých účinků chemických látek a jejich směsí na ţivotní prostředí. V případě hodnocení kontaminovaných území a při zjišťování rizik spojených s přítomností znečišťujících látek se nabízí nově vyuţití biologických testů pro komplexní hodnocení směsí znečišťujících látek, kterou nelze přesně popsat chemickou analýzou. Celková koncentrace kontaminantu v půdě tedy nemůţe poskytnout přesnou informaci o ekologickém riziku, zatímco při pouţití testů ekotoxicity v kombinaci s chemickou analýzou lze lépe a přesněji definovat sanační limity. Z velké řady jiţ publikovaných výsledků a popisů vlastností jednotlivých testů ekotoxicity je zřejmé, ţe existuje dostatek testů s velmi vysokou vypovídací schopností pro hodnocení nebezpečných vlastností zemin. Cílem práce bylo zjistit a porovnat moţnost vyuţití vybraných ekotoxikologických testů toxicity a bakteriálního bioluminiscenčního testu toxicity při posuzování zátěţe půdy těţkými kovy a ropnými látkami. Pro praktické provedení byly vybrány metody s dostatečnou citlivostí k nízkým koncentracím uvedených kontaminantů v zemině a se standardním provedením podle norem ČSN, EN, ISO a OECD. Výsledky všech ekotoxikologických testů toxicity byly porovnány s výsledky nově zavedeného testu toxicity bakteriálního bioluminiscenčního testu. K provedení práce byla vybrána následující sada obsahující tyto testy toxicity: test akutní toxicity na vodním členovci, test inhibice růstu zelené řasy, test inhibice růstu kořene hořčice bílé a bakteriální test inhibice bioluminiscence. Jako kontaminující látky byly vybrány toxické kovy často znečišťující půdní a ţivotní prostředí. Jedná se o Cu, Cr, Ni, Pb, Zn, Cd. Dále byl vybrán zástupce častého ropného znečištění směsný vzorek ropných látek (NEL). Vybrané vzorky půdy byly kontaminovány zvolenými chemickými látkami a z takto připravených vzorků byl připraven vodný výluh v poměru 1:10 s destilovanou vodou podle stanovené metodiky (MŢP). Po filtraci byly vzniklé výluhy podrobeny ekotoxikologickým testům a srovnávacím chemickým analýzám. Jako nejcitlivější ke zvoleným kontaminantům se ukázaly test akutní toxicity na vodním členovci a test inhibice růstu zelené řasy. V porovnání s těmito testy niţší, ale stále dostatečnou citlivost prokázaly testy zaloţené na inhibici růstu kořene a na inhibici bioluminiscence. Získané výsledky prokázaly dobře zvolenou metodiku práce, vhodný výběr ekotoxikologických testů a 4
zajímavé výsledky bakteriálního testu inhibice bioluminiscence, plně srovnatelné s výsledky ostatních pouţitých biotestů. Ukázalo se, ţe mikrobiální testy mohou být dobrým indikátorem půdního znečištění. Výsledky této disertační práce tak mohou pomoci k zavedení ekotoxikologických a mikrobiologických testů jako standardních hodnotících postupů pro posuzování toxicity kontaminovaných zemin nebo zemin po biodegradaci. Klíčová slova: ekotoxikologické testy, akutní toxicita, inhibice růstu, vodný výluh, bakteriální bioluminiscenční test, toxické kovy, kontaminace zemin. 5
OBSAH : 1. ÚVOD 1 2. LITERÁRNÍ REŠERŠE 2 2.1. EKOTOXIKOLOGICKÉ TESTY 2 2.1.1. Současná úroveň ekotoxikologického testování 2 2.1.2. Postavení biotestů v ekologickém monitoringu 2 2.1.2.1. Definice a základní účel biotestů 3 2.1.2.2. Vývoj a dnešní podoba ekotoxikologie 4 2.1.2.3. Výhody a nevýhody biotestů 5 2.1.2.4. Vztahy mezi chemickou analýzou a testy ekotoxicity 5 2.1.2.5. Biotesty a odběr vzorků 6 2.1.3. Přehled ekotoxikologických testů 6 2.1.3.1. Rozdělení ekotoxikologických testů 6 2.1.3.2. Ekotoxikologické testy ve světových normách a metodikách 7 2.1.3.3. Ekotoxikologické testy v normách ČR 8 2.1.4. Výpovědní hodnota ekotoxikologických testů 9 2.1.5. Sloţení a tvorba sad ekotoxikologických testů 10 2.1.5.1. Základní sady ekotoxikologických testů 11 2.1.5.2. Rozšířené sady ekotoxikologických testů 12 2.1.6. Bakteriální testy ekotoxicity 12 2.1.6.1. Princip testů měření bioluminiscence 12 2.1.6.2. Faktory ovlivňující měření bioluminiscence 13 2.1.6.3. Výhody bakteriálního bioluminiscenčního testu 13 2.1.6.4. Možnosti využití testu Microtox 14 2.2. PROBLEMATKA KONTAMINACE PŮD 16 2.2.1. Nepříznivé vlivy kontaminovaných půd na ţivotní prostředí 16 2.2.2. Nejčastější zdroje kontaminace půd 17 2.2.2.1. Znečištěná atmosféra 17 2.2.2.2. Kontaminovaná odpadní, průsaková a závlahová voda 18 2.2.2.3. Matečná hornina a půdotvorný substrát 18 6
2.2.3. Problematika největších zdrojů plošné kontaminace půd 19 2.2.3.1. Nepříznivý vliv imisí a ropných látek z dopravy 19 2.2.3.2. Nepříznivý vliv imisí z energetiky 20 2.2.3.3. Nepříznivý vliv imisí z metalurgie 21 2.2.3.4. Nepříznivý vliv imisí ze silikátového průmyslu 22 2.2.3.5. Nepříznivý vliv imisí z chemického průmyslu 23 2.2.4. Dlouhodobý nepříznivý vliv emisí a imisí na půdu 23 2.3. ROSTLINY A TĚŢKÉ KOVY V PŮDĚ 25 2.3.1. Vliv těţkých kovů v půdě na rostliny 25 2.3.1.1. Zinek 26 2.3.1.2. Kadmium 26 2.3.1.3. Rtuť 27 2.3.1.4. Olovo 27 2.3.1.5. Arsen 27 2.3.2. Mechanismy vstupu těţkých kovů a jejich detoxikace u rostlin 28 2.3.2.1. Přístupnost různých forem těžkých kovů pro rostliny 28 2.3.2.2. Transportní mechanismy těžkých kovů v rostlinách 29 2.3.3. Schopnost akumulace těţkých kovů rostlinami 30 3. CÍLE PRÁCE 33 4. METODIKA 34 4.1. Pracoviště pro provedení zkoušek 34 4.2. Výběr metod 34 4.3. Metodika provedení zkoušek 35 4.3.1. Test akutní toxicity na vodním členovci 37 4.3.2. Test inhibice růstu na řase 38 4.3.3. Test inhibice růstu kořene rostlin 40 4.3.4. Bakteriální test inhibice bioluminiscence 41 4.4. Příprava roztoků 42 7
4.5. Příprava a zpracování vzorků 44 4.6. Příprava vodného výluhu 45 4.7. Přístroje a laboratorní vybavení 46 5. VÝSLEDKY 48 5.1. Výsledky testů akutní toxicity na vodním členovci 49 5.2. Výsledky testů inhibice růstu na řase 55 5.3. Výsledky testů inhibice růstu kořene rostlin 61 5.4. Výsledky bakteriálních testů inhibice bioluminiscence 67 6. DISKUSE 73 7. ZÁVĚR 86 8. POUŢITÁ LITERATURA 88 9. PŘÍLOHY 96 Příloha A: Normy vydané v ČR pro ekotoxikologické testy 97 Příloha B: Seznam vybraných pouţitých zkratek a symbolů 99 Příloha C: Přehled vlastních publikací autora 100 8
1. ÚVOD Ekotoxikologické testy jsou v posledních letech stále více vyuţívány při hodnocení nepříznivých účinků škodlivých látek a jejich směsí na ţivotní prostředí, pro hodnocení toxicity znečištěných povrchových a podzemních vod, zemin a při hodnocení nebezpečných vlastností odpadů. V poslední době tyto testy také stále více nacházejí uplatnění při kontrole kontaminovaných území a rizik spojených s přítomností znečišťujících látek. Při hodnocení rizik kontaminovaných území je nedílnou součástí určení typů a koncentrace znečišťujících látek v zasaţené lokalitě. Soubory získaných dat ze vzorkování včetně chemických analýz jsou následně porovnávány se stanovenými limity. Na základě komplexního zhodnocení celého území je rozhodováno o provedení nápravných opatření a cílových limitech. Cílové limity jsou určovány především zbytkovými koncentracemi stanovených polutantů v zemině, příp. v podzemní vodě nebo půdním vzduchu. Hodnocení rizika kontaminovaného území ve vztahu k ekologickým receptorům (půdním mikroorganismům) je velmi důleţité, neboť se obvykle hodnotí směs látek, kterou nelze přesně popsat chemickou analýzou. Bylo prokázáno, ţe biologická vyuţitelnost chemických látek receptory, jako jsou půdní mikroorganismy, můţe být ovlivňována vazbou látek na částice zeminy a závislá na vlastnostech půdy. Navíc rychlost a rozsah, v jakém je chemická látka uvolňována z půdy do vodné fáze nebo ovzduší, se můţe měnit s časem. Celková koncentrace kontaminantu v půdě tedy nemůţe poskytnout přesnou informaci o ekologickém riziku. Při pouţití ekotoxikologických testů v kombinaci s chemickou analýzou lze lépe a přesněji definovat sanační limity. V současné době existuje velké mnoţství testů toxicity vyuţívajících nejrůznější indikátorové organismy. Z hlediska pouţití mají pro posouzení ekotoxicity kontaminovaných zemin výhodu ty testy, které umoţňují přímé stanovení toxických účinků na půdní prostředí. Z dosud publikovaných výsledků a popisů vlastností jednotlivých testů ekotoxicity je zřejmé, ţe existuje dostatek testů s velmi vysokou vypovídací schopností pro hodnocení nebezpečných vlastností zemin. Současně však je patrné, ţe pro dokonalé hodnocení nebezpečných vlastností je třeba pouţívat sadu testů. Jedním vybraným testem nejsme schopni postihnout souhrn rizikových faktorů daného půdního vzorku. 9
2. LITERÁRNÍ REŠERŠE 2.1. EKOTOXIKOLOGICKÉ TESTY 2.1.1. Současná úroveň ekotoxikologického testování Ekotoxikologické testy mají významné místo v monitoringu ţivotního prostředí. Podávají informaci komplementární k chemickým analýzám environmentálních sloţek. Slouţí pro odhady rizik spojených s výskytem testované látky v ţivotním prostředí. Pro jejich intenzivní zapojení do praktického monitoringu je třeba vytvořit podklady nejen pro samotné testy, ale i pro jejich návaznost na chemické nebo ekonomické nástroje ochrany ţivotního prostředí (Newman, 1998). 2.1.2. Postavení biotestů v ekologickém monitoringu Ekotoxikologické testy můţeme zkráceně nazývat také jako biotesty (od anglického bioassay, zkouška vyuţívající biologický systém ). Biotest zahrnuje expozici organismu testovanou látkou a stanovuje odpověď organismu. Můţeme rozlišit několik modifikací biotestů: test, který měří efekt (např. akutní, subletální, chronickou toxicitu) a test bioakumulační, který měří určitý jev (Chapman, 1997). Dnes se jako testovací organismy pouţívají široké škály organismů, jako jsou bakterie, sinice, řasy, vyšší rostliny, vodní a půdní organismy, mechy a lišejníky, ale také teplokrevní obratlovci, především hlodavci nebo ptáci. Ekotoxikologie je poměrně nový pojem, spojující ekologické a toxikologické disciplíny. Původně byly testy toxicity, jejich metodické postupy a testovací organismy vybírány na základě neekologických faktorů, protoţe faktory ekologické byly obecně nevýznamné. První environmentální problémy, které se objevily, byly akutní a viditelné, zahrnovaly např. hynutí organismů vlivem nedostatku kyslíku a vedly k vyuţití převáţně rybích druhů při testování vody (Moriarity, 1998). Původní problémy byly relativně jednoduché, zahrnovaly polutanty typu organická hmota, kovy a pesticidy. V průběhu století se však znečištění stalo komplexnějším a nyní zahrnuje směsi chemikálií ve více environmentálních sloţkách (voda, půda, tkáně, aj.) Efekty znečištění se jiţ netýkají pouze mortality, ale do popředí se dostávají dlouhodobější a obtíţněji detekovatelné účinky jako mutagenita, karcinogenita, vlivy na růst, reprodukci, atd. To vede i k rozvoji různých metod stanovujících příčiny a efekty znečištění a ke změně opatření k nápravě způsobených škod včetně prevence a ochrany zdraví ekosystému (Chapman, 1995). 10
V současné době jsou známy desítky milionů organických sloučenin. Spolu s dalšími přírodními sloučeninami produkovanými ţivými organismy a anorganickými látkami tvoří směsi, jejichţ toxicitu lze obtíţně efektivně monitorovat instrumentálními metodami analytické a environmentální chemie, jelikoţ jsou povětšinou cíleny na určitou látku. Proto má ekotoxikologický test jako test nespecifický a relativně levný v ekologickém monitoringu své důleţité místo (Chapman, 1999). 2.1.2.1. Definice a základní účel biotestů Ekotoxikologické biotesty se definují jako testy, které pro stanovení sledovaného jevu vyuţívají detekční systémy (organismy, tkáně apod.) a které mají dostatečnou výpovědní hodnotu pro sledované ekosystémy či matrice (vodní, půdní ekosystémy, chemické látky, odpady apod.) V zákonech a normách je ekotoxicita uváděna jako samostatný obor, který vţdy sleduje a definuje účinky testované substance na úrovni producentů, konzumentů nebo destruentů. Principem biotestu je kontakt (akutní nebo chronický) testované látky, směsného či přírodního vzorku za určitých, předem definovaných a kontrolovatelných podmínek s detekčním systémem (zkušebním organismem, tkání, populací, společenstvem apod.). Z jeho reakce potom usuzujeme, zda testovaná látka je toxická, zda vzorek vody obsahuje vyuţitelné ţiviny, zda je za těchto podmínek sledovaná substance rozloţitelná apod. Biotest většinou nemůţe podat informaci, která látka a v jakém mnoţství je v příslušném vzorku z přírodního prostředí, to je vyhrazeno aţ chemické analýze, můţe však velmi jednoduše a rychle říci, zda je či není ve vzorku biologicky aktivní, nebo zda sledovaný jev ovlivňuje daná látka nebo směs látek (Hoffman et al., 2003). V současné době je trendem vyvíjet takové metodiky ekotoxikologických testů, které jsou miniaturizované, plně validovatelné a umoţňují tedy sledovat nepříznivý vliv látek na ţivé organizmy za standardních, reprodukovatelných podmínek (Moriarity, 1988). Metody musí umoţnit srovnání účinků různých látek či různých organismů mezi sebou a především srovnání odpovídajících výsledků z různých laboratoří. Vysoký stupeň standardizace ekotoxikologických testů je samozřejmostí, která je však často interpretována zároveň jako nevýhoda, protoţe laboratorní podmínky jsou často vzdáleny přírodním podmínkám, coţ je nutno brát v úvahu při interpretaci výsledků testů. Ekotoxikologické testy pak poskytují podklady pro ekotoxikologické studie, hodnocení rizik apod. (Chapman, 1997). 11
Hodnocení ekosystému probíhá na třech základních úrovních biologické organizace: individuální, populační a na úrovni společenstva. Testy toxicity se zaměřují na biochemické a fyziologické odpovědi organismu k environmentálnímu znečištění. Jejich výhodou je, ţe jsou standardizované, mohou indikovat "včasné varování." Na druhé straně jim chybí dlouhodobá ekologická významnost a jejich interpretace můţe být irelevantní přírodním podmínkám (Wong a Dixon, 1995). 2.1.2.2. Vývoj a dnešní podoba ekotoxikologie Pokud definujeme ekotoxikologii jako vědní disciplínu, která se zabývá studiem toxického působení látek lidského či přírodního původu na ţivé organismy, jejich populace a společenstva, tak kromě sledování účinků látek na organismy bývá předmětem jejího zájmu i pohyb polutantů v ţivotním prostředí (Elvers a Hawkins, 1990). Hlavním cílem ekotoxikologie je vyvíjet takové metody, které umoţňují sledovat nepříznivý vliv látek na ţivé organismy a jejich společenstva za standardních reprodukovatelných podmínek. Vybrané metody by měly umoţnit srovnání účinků různých látek či různých organismů mezi sebou a také porovnání odpovídajících výsledků získaných v různých laboratořích (Rand a Petrocelli, 1995). Termín ekotoxikologie pouţil jako první přibliţně okolo roku 1969 člen francouzské akademie věd Dr. René Truhaut. Jednalo se o přirozené rozšíření toxikologie, vědy zkoumající účinky látek na jedince. Toxikologie byla rozšířena o oblast ekologických dopadů polutantů. V širším smyslu se jedná o testování toxicity na jednu nebo více oblastí přírodního ekosystému. Definice ekotoxikologie můţe být obohacena i o oblast předpovídání účinků potencionálně toxických látek na ekosystémy a různé druhy ţivočichů. Souhrnně můţeme říci, ţe ekotoxikologie se zabývá zkoumáním účinků polutantů na společenstva a snaţí se chránit celý ekosystém, a ne pouze určitou jeho část. Nejrozšířenější oblastí ekotoxikologie je oblast vodní, tzv. akvatická ekotoxikologie. Tato vědní disciplína poskytuje mnoho metod k testování toxických účinků látek. První standardní metodika byla publikována Hartem (Hart et al., 1945) a posléze byla začleněna do systému ASTM (American Society for Testing and Materials). S rostoucí potřebou testovat látky ve vodě špatně rozpustné či vzorky jako jsou zeminy, začaly se metodiky testování pomocí vodních organismů přizpůsobovat především v oblasti úpravy vzorků. Současně se začaly vyvíjet metodiky testování v tzv. kontaktním uspořádání - terestriální testy toxicity. 12
2.1.2.3. Výhody a nevýhody biotestů Vţdy byly podstatou ekotoxikologické laboratorní práce testy, slouţící k zjištění či odhadu moţného toxického vlivu testovaných látek na ţivé organizmy. Testy toxicity nejsou specifické, to znamená, ţe zachycují celkové toxické účinky všech látek přítomných v testovaných vzorcích bez nutné bliţší znalosti jejich sloţení či chemické struktury. Tato nespecifičnost má své výhody i nevýhody. Hlavní výhodou je rychlé, dostatečně informativní a ekonomické zhodnocení daných vzorků, např. odpadů či látek uvolněných do prostředí v důsledku ekologické havárie. V těchto případech hraje roli především čas a je nezbytné na prvním místě zjistit, zda je daný vzorek toxický či nikoliv. Podrobná chemická analýza je záleţitost dlouhodobá a hlavně nákladná. Z toho důvodu se provádí teprve u vzorků, které vykazují toxické účinky, a je tedy důleţité se jimi podrobněji zabývat. Zároveň není moţné u vzorku obsahujícího více látek odhadnout, natoţ určit jeho toxické účinky pouze na základě chemického sloţení (Cooney, 2003). Jestliţe má test ekotoxicity slouţit k hodnocení negativního vlivu látek ovlivňujících ekosystém, posuzuje se látka v těch koncentracích, v jakých do prostředí vstupuje nebo v jakých koncentracích se můţe v prostředí vyskytnout. Výroba a uţívání chemických látek, včetně konečného ukládání, vede ke zvyšování jejich koncentrace v ţivotním prostředí. Způsob, jakým se látky dostávají do prostředí, závisí na jejich chemicko-fyzikálních vlastnostech, podmínkách výroby, dostupnosti z přírodních zdrojů či podmínkách uloţení. Látky se mohou do prostředí dostávat také jako vedlejší produkty lidské činnosti. Je-li tedy saturační kapacita ekosystému vlivem stále narůstající koncentrace vyčerpána, můţe dojít k jeho narušení. Riziko způsobené jednou látkou či směsí látek je pak závislé na citlivosti jednotlivých organismů vůči dané látce a na její koncentraci v ţivotním prostředí (Hoffman et al., 2003). 2.1.2.4. Vztahy mezi chemickou analýzou a testy ekotoxicity Je-li naším cílem zhodnotit důsledky vlivu dané látky na prostředí, obvykle začneme stanovením koncentrace látky ve sledované lokalitě. Znalost reálné koncentrace polutantu je bezesporu základem monitoringu ţivotního prostředí. Přesto však znalost např. i dlouhodobé koncentrace polutantu nám neposkytne informaci o skutečném vlivu látky na ţivé organismy a následně na ekosystém. Tuto propast mezi analytickým stanovením a účinky látek na organismy se snaţí překonat testy na organismech, tkáních či kulturách. 13
Z tohoto pohledu můţeme říci, ţe ekotoxikologie je vědní disciplína zabývající se zkoumáním účinků látek na ţivé organismy a jejich společenstva aţ po globální dopady výskytu takových látek v geosféře. Důleţitou část ekotoxikologie tvoří vedle sledování účinku i chemický monitoring nebezpečných látek ve vzduchu, zeminách, vodách i ţivých matricích (Dočkal, 1991). Ekotoxikologie je tedy disciplína spojující chemický a biologický přístup k monitoringu ţivotního prostředí. Oba dva přístupy se zde vhodným způsobem doplňují a zvyšují tak výpovědní hodnotu získaných výsledků. 2.1.2.5. Biotesty a odběr vzorků U monitoringu ţivotního prostředí jsou dvě problematická místa. Prvním je oblast vzorkování a druhým je rozdíl mezi laboratorní a sledovanou oblastí. Jedná se o zmírnění rozdílů při působení testované látky na organismy v laboratorním uspořádání testu a působením látky na dané lokalitě, kde hraje roli mnoţství dalších faktorů. Protoţe je ekotoxikologie velmi mladou disciplínou, stále pracuje na tvorbě jednotné metodiky zkoumání a na jednotných přístupech k vlastní práci. Proto je velmi důleţitý přístup k odběru vzorku. Při vzorkování např. bodovým odběrem musíme zahrnout do výsledku periodickou kontaminaci či sezónní změny. Chemická analýza bodového odběru nám pouze podá informaci o okamţité koncentraci látky. Těţko z takového výsledku můţeme odhadnout, jak látka doopravdy působí na dané lokalitě na organismy. Podstatná je i kvalitní předúprava vzorků a správná volba testovacích organismů. 2.1.3. Přehled ekotoxikologických testů 2.1.3.1. Rozdělení ekotoxikologických testů V mezinárodních monografiích zabývajících se touto problematikou najdeme nejrůznější způsoby dělení ekotoxikologických testů. Mezi základní způsoby dělení patří nejčastěji následující (Hoffman et al., 2003) : 1. Dělení podle doby expozice. Ekotoxikologické testy akutní, semiakutní (semichronické) a chronické. 2. Dělení podle pokročilosti testovacího systému (3 generace testů). První generace jsou klasické (standardní) testy, druhá generace jsou mikrobiotesty a třetí generace jsou 14
biosenzory, biosondy a biomarkery. 3. Dělení podle trofické úrovně testovacích organismů. Dělíme na producenty, konzumenty a destruenty. 4. Dělení podle testované matrice: voda, půda, vzduch, sediment, odpad, chemická látka aj. 5. Dělení podle spektra testovacích organismů: jednodruhové, vícedruhové jak přírodní populace, tak i laboratorní směsi kultur. 6. Dělení podle typu testovaného vzorku: čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé), směs látek (známých i neznámých), přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné aj.). 7. Podle způsobu přípravy vzorku: definované koncentrace chemických látek, testování výluhů přírodních vzorků (extrakce organickými rozpouštědly, vodou, různé ph, teplota aj.). 8. Podle stupně komplexnosti detekčního systému. Od nejjednodušších k nejsloţitějším - enzymy, biosondy, buněčné a tkáňové kultury, ţivý organismus, populace, mikrokosmos a mezokosmos, terénní experimenty. 9. Podle způsobu vyhodnocování: letální efekty (mortalita, imobilizace), subletální efekty (chování organismů - např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické aktivity (fotosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, hodnocení přírůstků - délka kořene, počet buněk v populaci, hmotnost organismu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod.), reprodukční aktivita, malformace a teratogenita atd. 10. Speciální testy pro hodnocení rizik v životním prostředí - pouţíváme v případech, kdy je pro konkrétní interpretaci nutno stanovit jiné neţ běţné efekty na testovací organismus. Máme k dispozici řadu speciálních biotestů pro stanovení parametrů jako např.: trofie, mutagenita, genotoxicita bakterií, genotoxicita na rostlinách, volně ţijících zvířatech a rybách, teratogenita, například na obojţivelnících (Xenopus laevis), embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojţivelnících, ptácích aj. 2.1.3.2. Ekotoxikologické testy ve světových normách a metodikách Agentury vyspělých států, které vydávají a aktualizují normy a metodiky v oblasti ekotoxikologických testů, jsou např. v USA (U.S. EPA a ASTM), v Kanadě (Environment 15
Canada), ve Francii (AFNOR), v Německu (DIN) apod. Česká republika patří mezi státy, které jsou v této oblasti velmi pokročilé. V současné době jsou v platnosti ČSN (Česká státní norma), ale současně jsou platné nové normy, které přijímáme v procesu harmonizace předpisů s EU, které jsou pro ČR také závazné. Další u nás platné normy jsou ty, které jsme přejali jako členové OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development) a ISO (International Standardization Organisation) Dále se u nás můţeme běţně setkat s normou, která má označení EN ISO. Jde o nové normy přejímané z ISO a platné pro EU. Poslední skupinou norem pouţívaných v ČR jsou tzv. oborové normy pro jednotlivé rezorty, či odvětví. Příkladem mohou být oborové normy pro vodní hospodářství, které mají označení TNV. Kromě ekotoxikologických biotestů, které jsou běţné v ČR (dafnie, řasy, klíčení semen, ryby) jsou například u OECD jiţ od roku 1984 platné normy pro stanovení toxicity pro včely, ţíţaly, volně ţijící ptáky apod. Tyto testy se v ČR také pouţívají, povědomí odborné veřejnosti o těchto testech však není takové, jako je tomu u testů pro testování vodních ekosystémů. ISO nabízí standardizované metodiky a normy pro nejrůznější činnosti spojené s ekotoxikologickými biotesty (od vzorkování, přepravy, konzervace a uchovávání vzorků, přes metody extrakce a přípravy aţ po zpracování biotestů pro vodní ekosystémy, půdu, odpady apod.). 2.1.3.3. Ekotoxikologické testy v normách ČR Situace v oblasti norem a metodik pro ekotoxikologické biotesty se v současné době v ČR intenzivně vyvíjí, takţe následující přehled nelze brát jako definitivní a konečný. Informace o platných aktuálních ČSN normách lze získat např. od Českého normalizačního institutu nebo na Ministerstvu ţivotního prostředí. Některé normy byly vydány jako technické, soubor technických norem v oboru vodního hospodářství spravuje Ministerstvo zemědělství. V příloze 9.2. této práce jsou uvedeny vybrané normy, týkající se ekotoxikologického testování. Jsou vydány nejčastěji jako převzaté evropské normy s označením ČSN EN nebo jako převzaté ISO normy (někdy totoţné s evropskými.) Ty jsou označeny jako ČSN ISO resp. ČSN EN ISO. 16
2.1.4. Výpovědní hodnota ekotoxikologických testů Hlavním zaměřením ekotoxikologických testů je stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti environmentálního problému. Testy mohou být pouţity jednak jako základní zkouška, která stanoví potenciální zdroje znečištění (bodové i nebodové, voda, půda, sedimenty aj.), nebo mohou následovat za chemickými analýzami, aby determinovaly vysoké hladiny, nebo dostupnost kontaminantů. Informace o ekotoxicitě potom slouţí jako signál k provedení podrobnějších fyzikálně-chemických analýz. Indikace toxicity však nemusí vţdy korelovat s chemickými a fyzikálními rozbory sledovaného materiálu. Biotesty mohou signalizovat nebezpečí, aniţ fyzikálně-chemické analýzy detekují zvýšené hladiny nebezpečných látek ve vzorku, a naopak i přes indikaci toxicity z fyzikálně-chemických rozborů reagují testované organismy negativně. Organismus totiţ vypovídá o testovaném materiálu komplexně, záleţí např. na biodosaţitelnosti toxických sloţek nebo se mohou projevit interakce mezi přítomnými polutanty, které z chemických rozborů nevyplývají (Chapman, 1999). Laboratorní data vnášejí určité nejistoty do interpretace měření ve spojení se sledováním efektů kontaminantu in situ. Z těchto metod je dobré zmínit například metody sledující struktury společenstev ryb, rostlin, řas, zooplanktonu, zoobentosu apod. Avšak v případě, ţe je testována nejhorší varianta moţné kontaminace, fungují biotesty jako včasné varování před potenciálními problémy, které by se mohly stát kritickými. To platí především v případech, kdy přírodní populace díky působení mnoha dalších environmentálních faktorů mohou detekovat negativní efekt teprve tehdy, kdyţ se jiţ stává nebezpečným. Hlavní rozdíl mezi ekotoxikologickými biotesty a in situ metodami je, ţe biotesty zahrnují experimentální expozice v laboratorním uspořádání, kde jsou všechny proměnné kontrolovány nebo známy a toxický faktor je manipulován. Studie přírodních populací jsou však ovlivněny mnoha variabilními fyzikálními, chemickými a biologickými faktory, které se navíc ve svých účincích na populace různě kombinují, a proto nelze jednoduše oddělit tuto variabilitu od vlivu toxických látek. Nejlepší podmínky pro ověření skutečného nebezpečí toxického efektu nastanou, kdyţ můţe být aplikace příslušného zásahu náhodně opakována, coţ zaručuje, ţe pozorovaný negativní efekt byl s největší pravděpodobností důsledkem tohoto zásahu, a ne důsledkem velké variability prostředí. Laboratorní verze zákroku je opakovatelná, verze z reálného prostředí však většinou není (Chapman, 1997). 17
Nezbytnost redukovat přírodní prostředí na mnohem jednodušší laboratorní úrovni můţe vést k podhodnocení nebo nadhodnocení efektů toxické látky v přírodě. To však neznamená, ţe laboratorní výsledky jsou neplatné, protoţe laboratorní testy jsou o mnoho jednodušší a neduplikují studie in situ. Na druhé straně in situ metody jsou příliš komplexní a nedovolují oddělení efektů kontaminantů od přírodních změn (Chapman, 1995). Interaktivní přístup ke znečištění ţivotního prostředí vyţaduje jak experimentální laboratorní studie, tak pozorování přímo in situ, jelikoţ oba přístupy se doplňují a myšlenka, ţe laboratorní studie vyţadují ověření in situ se postupně stává jiţ dogmatem. Stejně tak výsledek samotného biotestu nebo skupiny biotestů nám sice můţe indikovat nebezpečí pro ekosystém, ale bez podrobných fyzikálně-chemických analýz většinou nelze příčinu tohoto nebezpečí identifikovat (Cairns a Niederlehner, 1995). 2.1.5. Sloţení a tvorba sad ekotoxikologických testů Odpověď jednotlivých organismů na přítomnost toxických látek není jednotná, ovlivňuje ji mnoho faktorů jako biologická dosaţitelnost toxické látky, způsob jejího přijímání organismem, bioakumulace nebo schopnost škodlivou látku odbourávat. Kaţdý organismus reaguje na přítomnost toxického materiálu jiným způsobem, proto je nezbytné k získání co nejkomplexnější informace o jeho toxickém působení na ţivé organismy pouţít k testování vţdy více druhů a vţdy zástupce všech trofických úrovní. Zapojením většího počtu testovacích organismů roste informace o zkoumaném vzorku a zvyšuje se tak výpovědní hodnota celé metody. Do sady jsou vybírány individuální testy tak, aby byla schopna detekovat co nejvíce skupin toxických látek s vysokou spolehlivostí. (Zwart, 1995). Pro výběr sad testů pro ekotoxikologické testování existují různá pravidla, podle kterých se jednotlivé biotesty do baterií začleňují. V některých zákonech je definováno povinné sloţení sady testů, např. v České republice v Zákoně o odpadech a v Zákoně o chemických látkách. Některé vědecké týmy zdůrazňují ekonomičnost celé sady a pracují jen s akutními testy (Thomas et al., 1986), další aplikují ve svých studiích společně s mikrobiotesty i standardní testy toxicity doporučované mezinárodními organizacemi jako ISO, EPA, OECD aj. (Costan et al., 1993). Také je moţné kombinovat testy toxicity podle typu testovaných vzorků (Harkey et al., 1994, Keddy et al., 1995 aj.). Do výběru biotestů pro ekotoxikologické sady se samozřejmě výrazně odráţí i soudobý výzkum a vědecké zaměření ekotoxikologických pracovišť (Dutka et al., 1996). 18
2.1.5.1. Základní sady ekotoxikologických testů Schopnost sestavit takovou baterii ekotoxikologických biotestů, která bude mít co nejreálnější vypovídací hodnotu a jejíţ interpretace bude přesně odpovídat problematice studované lokality, patří k důleţitým znalostem kaţdého ekotoxikologa. K tomu je samozřejmě důleţité mít přehled o moţnostech normovaných testů i jejich alternativních metodik. Při hodnocení ekologických rizik (např. ve smyslu zákona o chemických látkách) je nutné pouţít testy toxicity na organismech minimálně tří trofických úrovní producent, konzument a destruent. Do sady analýz je také nutné vybírat testy, které jsou schopny testovat jak kapalné, tak i pevné vzorky (sedimenty, půda). Následující sady testů obsahují popis častých typů: - Microtox-test. Test na inhibici bioluminiscence mořské bakterie Photobacterium phosphoreum. Podstatou testu je měření intenzity bioluminiscence a jejího vyhasínání při kontaktu s určitou koncentrací toxické látky (DIN 38 412 part 34/1991). - Turbidimetrický test. Test měří růstovou rychlost bakteriálních buněk turbidimetricky. Změna intenzity zákalu oproti kontrole vypovídá o inhibičních účincích vzorku (ISO 10712/1995). - Sediment-chromotest (Toxichromopad) Test inhibice syntézy D-galaktozidázy pomocí bakterie E. coli. (Kwan 1993, Kwan 1995, Kwan a Dutka 1996, Day et al. 1995, Ramirez et al. 1996). - Růstově inhibiční test na řasách (Scenedesmus quadricauda, Scenedesmus subspicatus nebo Raphidocelis subcapitata). Test zaloţený na měření inhibice růstové rychlosti kultury testované řasy (v době exponenciálního růstu) po 72 hodinové expozici (OECD 201/1984, ISO 8692/1989). - Test klíčivosti a růstu kořenů vyšších rostlin. Test zaloţený na měření inhibice růstu kořene rostlin - řeřicha setá (Lepidium sativum), hořčice setá (Sinapis alba), salát hlávkový (Lactuca sativa). Časová expozice testu je 72 hodin (OECD 208/1984). - Imobilizační nebo reprodukční test na perloočkách (Daphnia magna). Test je zaloţen na měření úhynu a imobilizace dafnií vystavených různým koncentracím testovaných látek po dobu 24 a 48 hodin (OECD 202/1984, ISO 6341/1996). - Thamnotoxkit test. Testovací organismus Thamnocephalus platyurus je vylíhnut z klidových stádií během 20-24 hod, metoda pro stanovení akutní toxicity na korýši Thamnocephalus platyurus (TNV 757754). - Kontaktní test na filtračním papíře - Eisenia sp. Dospělé ţíţaly Eisenia sp. s dobře vyvinutým opaskem jsou 48 hodin exponovány na filtračním papíře navlhčeném roztokem testované látky. Stanovuje se mortalita, která je odečítána po 24 a 48 hodinách (OECD 207/1984). 19
2.1.5.2. Rozšířené sady ekotoxikologických testů Mezi rozšířené sady mohou patřit takové metody, jako např. test na inhibici spotřeby kyslíku aktivovaným kalem (ISO 8192/1986, OECD 209/1996), ATP - test vyuţívající měření bakteriální ATP jako indikátoru růstové inhibice, dále test enzymové inhibice D-galaktozidázy E. coli - citlivý na přítomnost jiţ malého mnoţství těţkých kovů. Z řasových testů je to Mikrometoda stanovení toxicity a trofického potenciálu řasovým testem (TNV 757741). Z testů na bezobratlých je to test akutní a chronické toxicity s nematody pomocí Panagrellus redivivus. Organismus je vyuţíván jako potenciální indikátor genotoxicity. Rotoxkit test vyuţívá vířníka Brachionus calyciflorus pro test akutní toxicity. 2.1.6. Bakteriální testy ekotoxicity Základní biotesty, které se v současné době nejvíce vyuţívají, mají některé nevýhody. Jejich hlavním nedostatkem je dlouhá doba potřebná pro získání výsledků analýz (desítky hodin aţ několik dnů). V případě ekologických havárií tak existuje nebezpečí rozšíření kontaminace na rozsáhlá území, coţ můţe mít za následek vznik velkých ekologických škod. Další nevýhodou je malá statistická spolehlivost vzhledem k omezenému počtu jedinců pouţívaných v testu a také to, ţe testy zaloţené na mortalitě neumoţňují sledovat slabé toxické účinky. Proto se novou variantou uvedených postupů osvědčila metoda alternativní, a to bakteriální bioluminiscenční test toxicity (Microtox test), který eliminuje některé uvedené nedostatky a který je moţné vyuţít pro stanovení akutní toxicity různých druhů xenobiotik. 2.1.6.1. Princip testů měření bioluminiscence Bakteriální test inhibice bioluminiscence se postupem času ukázal jako jeden z nejdůleţitějších zástupců testů toxicity na bakteriích. Vývoj tohoto testu systematicky začal v osmdesátých a devadesátých letech 19. stol. Fischer (Fischer, 1887), který popsal 9 druhů luminiscenčních bakterií a později byl po něm jeden druh pojmenován Photobacterium fischeri (dnes Vibrio fischeri). Test s názvem Microtox byl vyvinut v r. 1979 pro německou firmu Beckman Instrument a v průběhu dalších let vyuţíván řadou laboratoří a výzkumných pracovišť např. pro hodnocení akutní toxicity skládkových výluhů nebo vrtných výplachů, pro testy akutní toxicity odpadních vod. Studiu tohoto biotestu a jeho aplikacím v ekotoxikologickém monitoringu je věnována monografie (Richardson, 1993). 20