Obsah přednášky 1) Exprese v Escherichia coli 2) Exprese v Saccharomyces cerevisiae 3) Exprese v Pichia pastoris 4) Exprese v hmyzích buňkách
Exprese v Escherichia coli proteiny větší než malé proteiny menší než velké nesmí být příliš hydrofobní nesmí obsahovat mnoho cysteinů
Ideální situace pro expresi v E. coli Protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem Není nutná glykosylace Velikost proteinu je < 50kDa Protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci Protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností opětovného sbalení (refolding)
E.coli expresní systém teplotní indukce pl promotor + gen E.coli B represor ci857 30 C Met 42 C Produkt exprese
E.coli expresní systém IPTG indukce lac/tac promotor + gen E.coli XL1-Blue E.coli JM101 E.coli TOP10 E. coli BL21/λDE3 represor laci q 30 C/37 C IPTG 30 C/37 C Met Produkt exprese
E.coli expresní systém T7 RNA pol. systém T7 promotor + gen 30 C/37 C Met E.coli BL21 lamdade3 IPTG 30 C/37 C Produkt exprese
Kam lze exprimovat v E. coli sekrece do periplasmatického prostoru přímá intracelulární exprese fůzní proteiny přímá extracelulární exprese
Přímá intracelulární exprese Met produkt translace intracelulární exprese intracelulárních proteinů intracelulární exprese secernovaných proteinů
Extracelulární exprese Met signální peptid produkt translace signální peptid = signál pro sekreci
Výhody exprese v Escherichia coli vysoké výtěžky produktu purifikovatelné produkty vhodné pro další analýzu levná produkce redukující prostředí S S
Inkluzní tělíska Nechtěný produkt rekombinantních technologií nerozpustné nefunkční komplexy ALE rezistentní k proteázám snadno purifikovatelné ALE refolding
Ovlivnění rozpustnosti proteinů Nízká teplota Intracelulární fúze Fúzní/purifikační kotva (MalE, His, GST) * Periplasmatická exprese (S-S můstky) * Fúzní značky mnohdy zvyšují výtěžek
Test rozpustnosti Biomasa Dezitegrace buněk (French press, ultrazvuk, lysozym) Centrifugace 30min, 15 000xg Supernatant Rozpustné proteiny Buněčný extrakt Sediment Inkluzní tělíska Denaturační činidla Denaturované proteiny
Postup při izolaci rozpustných proteinů Supernatant Centrifugace 90min, 60 000g Rozpustné proteiny Sediment Membránové vezikly, ribosomy supernatant Cytoplasmatické a periplasmatické proteiny Materiál pro purifikaci v nativních podmínkách DNázy, RNázy, proteasové inhibitory
Purifikace rozpustných proteinů Materiál pro purifikaci v nativních podmínkách 1A. Krok zahřátí nebo diferenciální srážení (NH 4 ) 2 SO 4 1B. Krok iontovyměnná chromatografie 2. Krok afinitní chromatografie/ hydrofóbní chromatografie 3. Krok zakoncentrování/ Gelová filtrace/ dialýza Čistý protein 4. Krok sterilizace filtrováním
Purifikace secernovaných proteinů Biomasa kultivačním médiem Centrifugace 30min, 10 000g Buněčný sediment Supernatant obohacené o secernovaný protein Srážecí metody (síran amonný, aceton, atd.)
Izolace proteinů z inkluzních tělísek biomasa Buněčný extrakt Centrifugace 30min, 10 000g Sediment Inkluzní tělíska 6-8M Gu.HCl + DTT 8M urea +DTT Denaturační činidla Denaturované proteiny Monomerní a redukované proteiny Membránová frakce Re-foldovaný protein Celé buňky Denaturované proteiny Purifikované proteiny Inkluzní tělíska
Expresní systémy kvasinkové Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris
Typy vektorů u kvasinek 1) Replikativní 2) Integrativní
Replikativní vektory 1) Transformace probíhá snadno s vysokou frekvencí 2) Vnesená molekula se liší od přirozených chromozómů, plasmid je kružnicový a malý, chromozóm lineární a velký 3) Molekuly bez centromér jsou v průběhu mitózy a meiózy nestabilní a vyskytují se v dceřinných buňkách v různém počtu kopií
Integrativní vektory linearizovaný plasmid chromozóm P.pastoris plasmid v chromozómu
Požadavky na kvasinkové vektory počátek replikace, selekční znak a klonovací místo "shuttle" vektory, neboli pendlující či binární = schopny replikace jak v eukaryotických buňkách, tak v E. coli
Vlastnosti binárních vektorů dva počátky replikace prokaryotický a eukaryotický není zapotřebí u integrativních vektorů dva typy selekčních znaků prokaryotický = rezistence k antibiotiku eukaryotický = komplementace výživové deficience, ura3 ura3 -
Typy kvasinkových vektorů YIp, YRp, YCp, YEp a YLp s výjimkou YLp jsou binární
Promotory kvasinkových vektorů GAL 1 promotor, indukovatelný galaktózou konstitutivní promotory fosfoglycerát kinázy (pgk), glyceraldehyd 3 fosfát dehydrogenázy (GPD), alkohol dehydrogenázy (ADH1) ADH2 je glukózou reprimovatelný promotor (podobně jako GAL 1, ale není indukovatelný galaktózou), zajišťuje silnou transkripci v přítomnosti nefermentovatelných zdrojů uhlíku CUP 1 promotor metalothioneinového genu, indukovatelný měďnatými nebo ionty stříbra, přítomen až v 8 kopiích PHO5 je indukovatelný promotor genu kódujícího secernovanou kyselou fosfatázu
Plasmidy YIp obsahuje selektovatelné kvasinkové geny ztratil sekvence umožňující autonomní replikaci v kvasinkách začleňují se do chromozómu rekombinací mezi kvasinkovými sekvencemi nesenými na plasmidu a homologickými sekvencemi v genomu kvasinky reverze v nízké frekvenci 0,1-1,0% na generaci frekvence transformace jen 1-10 transformantů/μg DNA může být zvýšena 10-10 3 x po linearizaci plasmidu v místě integrace
Plasmidy YRp obsahuje selektovatelné kvasinkové geny obsahují ARS = schopnost autonomní replikace v kvasinkách plasmidy jsou v buňce přítomny až ve více než 100 kopiích, průměrný počet kopií je ale 1-10/buňku. frekvence transformace vysoká (10 3 až 10 4 tr./μg DNA nestabilní transformanti po mitóze 5 až 10 % buněk jednostranná segregace
Plasmidy YEp kružnicové molekuly obsahují sekvence divokého kvasinkového plasmidu 2μm sekvence plasmidu 2μm zajišťují udržování v extrachromozomálním stavu a vysokou frekvenci transformace (10 4 až 10 5 transformantů/μg) velmi stabilní, výskyt 20 až 50 molekul/buňku často místně specifické rekombinace díky přítomnosti obrácených repeticí dlouhých 599 bp, které pocházejí z plasmidu 2μm často také tvoří multimerní jednotky
Plasmidy YCp vznikají začleněním segmentů centromer z kvasinkových chromozómů (tzv. CEN elementů) do plasmidů YRp Extrémně stabilní, mezi buňkou mateřskou a dceřinnou distribuovány rovnoměrně ztráta při mitóze s četností 1% na generaci v buňkách přítomny v počtu 1-2 kopie během meiózy se chovají jako chromozómy segregují však v poměru 2+ : 2-, tzn., že dvě spóry je obsahují a dvě nikoli
Plasmidy YLp na koncích nesou teloméry replikace v lineárním stavu z telomery z tandemových repeticí sekvence 5 (dg 1-3 dt)3 velmi krátké plasmidy YLp o velikosti 10-15 kbp jsou nestabilní a vyskytují se ve velkém počtu kopií zvýšením velikosti plasmidu na 50-100 kbp vznikají YLp, které se při mitóze rozcházejí způsobem připomínajícím segregaci chromozómů výskyt v počtu 1ks/genom ztráta s četností 10-2 až 10-3 /generaci, tzn. že jsou stále ještě 100x méně stabilní než přirozené chromozómy kvasinek
Expresní systém Pichia pastoris metylotrofní kvasinka metanol jako jediný zdroj uhlíku je schopna produkovat rekombinantní proteiny jak intracelulárně, tak extracelulárně, a to ve vysokých koncentracích, které se často pohybují v řádech g/l posttranslační modifikace - N a O glykosylace, tvorba disulfidických můstků roste na levných médiích vhodná pro terapeutické proteiny
Metabolismus metanolu metanol peroxizóm H 2 O O 2 alkoholoxidáza kataláza formaldehyd H 2 O 2 dehydrogenázy HCOOH CO 2
Metabolismus metanolu metanol peroxizóm H 2 O O 2 alkoholoxidáza kataláza formaldehyd H 2 O 2 dehydrogenázy HCOOH CO 2
Alkoholoxidáza má silný indukovatelný promotor řídí expresi rekombinantních proteinů glukóza represor glycerol derepresor metanol - induktor promotor operátor AOX1 glukóza metanol Mut + glycerol promotor operátor AOX2 Mut S
Glykosylace u Pichia pastoris 8-14 zbytků manózy N - glykosylace u S. cerevisiae 50-150 zbytků, silně antigenní zanedbatelná O - glykosylace glykoproteiny se podobají glykoproteinům vyšších eukaryot rekombinantní proteiny z Pichia pastoris jsou vhodné pro terapeutické účely
připojení přes asparagin N-glykosylace začíná v drsném ER přidáním oligosacharidového prekurzoru procesy v ER shodné u rostlin, živočichů i jednobuněčných eukaryot po připojení k asparaginu přesun do GA, od tohoto okamžiku se úpravy liší V savčích buňkách málo zbytků manózy i jiné cukry u S. cerevisiae 50-150 zbytků manózy, silně antigenní U P. pastoris přidáno 8-14 zbytků manózy
Rozdíly v N-glykosylaci Mns = α-1,2-manosidáza MnsII = manosidáza II GnTI = β-1,2-n-acetylglukosaminyltransferáza I GnTI = β-1,2-n-acetylglukosaminyltransferáza II GalT = β-1,4-galaktosyltransferáza SiaT = α-2,6-sialyltransferáza MnT = manosyltransferáza
Expresní systémy hmyzích buněk Drosophilla melanogaster baculovirus
Baculoviry Velké tyčkovité dsdna viry infikující hmyz Nejběžnějším zástupcem je Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) parazitující na zástupcích řádu lepidoptera (Spodoptera frugiperda a Trichoplusia) Virové částice jsou obaleny ochrannou matrix sestávající z proteinu polyhedrinu umožňuje přežití ve vnějším prostředí a efektivní šíření mezi buňkami, v podmínkách in vitro není zapotřebí Promotor ppolh umožňuje expresi polyhedrinu nebo rekombinantního proteinu - až 50% celkového proteinu na konci cyklu bakuloviru
Základní vlastnosti I vhodný k produkci vysokých hladin rekombinantních proteinů (až 1 000mg/ml) správně posttranslačně modifikované (sbalení, tvorba S-S můstků, oligomerizace, glykosylace, acylace, proteolytické štěpení) rekombinantní proteiny biologicky aktivní a funkční rekombinantní gen je vnesen do oblastí virového genomu, které nejsou nutné pro replikaci viru
Základní vlastnosti II začlenění genu se děje homologickou rekombinací s využitím sekvencí vektoru rekombinantní bakulovirus ztrácí jeden z postradatelných genů (polh, v-cath, chia...), který je nahrazen genem rekombinantním rekombinantní protein je exprimován v kulturách hmyzích buněk nebo hmyzích larvách http://www.ent.iastate.edu/dept/faculty/bonningb/files/images/zebracaterpillar.jpg
Atraktivita systému Vysoké hladiny genové exprese, zvláště u intracelulárních proteinů Rekombinantní proteiny jsou většinou rozpustné, posttranslačně modifikované a snadno se izolují, obsah rodičovských proteinů je nízký, exprese probíhá v pozdních fázích infekce Hmyzí buňky se dobře kultivují v suspenzních kulturách snadný převod do biorektorů Heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více expresními kazetami Bakuloviry mají omezené spektrum hostitelů z řad bezobratlých bezpečná technologie
Základní schéma transponáza
Bacmid binární vektor, který se může replikovat v Escherichia coli a hmyzích buňkách nese rezistenci ke kanamycinu nese gen lacz, jím transformované kolonie tedy rostou modře, v přítomnosti IPTG rekombinantní gen je do něj vnášen transpozicí z jiného vektoru, transpozice směřuje do lacz, výsledné kolonie rostou bíle
Příklad klonování do baculoviru
Shrnutí přednášky 1) Exprese v Escherichia coli 2) Exprese v Saccharomyces cerevisiae 3) Exprese v Pichia pastoris 4) Exprese v hmyzích buňkách