Buněčné kultury a produkce rekombinantních proteinů. Ing. Mgr. Marta Greplová, Ph.D.

Transkript

1 Buněčné kultury a produkce rekombinantních proteinů Ing. Mgr. Marta Greplová, Ph.D.

2 Buněčné kultury - definice Procesy in vitro za účelem udržení životaschopnosti, rozšíření a využití buněk živých organismů. Mohou to být kultury prokaryotické (bakterie, mykoplasmy) a také eukaryotické (kvasinky, prvoci, rostlinné a živočišné buňky). Pojem buněčná kultura je v úzké souvislosti s výrazy tkáňová kultura nebo orgánová kultura, za které bývá často zaměňován. Přestože myšlenka kultivovat buňky in vitro pochází již z 19. století, rutinně se kultivace používají od 50. let 20. století.

3 Alexis Carrel ( ) Dokázal, že orgány či tkáně je možné dlouhodobě udržet na živu i po vyjmutí z organismu. V roce 1912 vložil do živného roztoku kus kuřecího srdce, jehož buňky vydržely v kultivační nádobě 27 let. Tento pokus způsobil průlom v rané historii biologie a měl význam pro rozvinutí metod genetických, mikrobiologických a farmaceutických. Od osmdesátých let se tak tkáňové kultury staly běžným nástrojem nejen pro výzkum, ale začaly se používat i v průmyslu.

4 Buněčné kultury - význam ve virologii - diagnostika virových onemocnění, kultivace a izolace viru, výroba virových vektorů pro genovou terapii či výroba vakcín proti virům (dětská obrna, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice) výroba enzymů, hormonů, monoklonálních protilátek, interleukinů a dalších proteinů pro léčebné, diagnostické či vědecké účely využití sek. metabolitu jako příchutí, parfémů, insekticidů, sladidel testování látek, léčiv a jejich toxicity či teratogenity výzkum rakoviny a vývoj protinádorových léčiv studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk klinická genetika - prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky choriových klků), postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve), chromozomové vyšetření nádorových buněk tkáňové inženýrství produkce transgenních plodin

5 Buněčné kultury - typy 1. Primární buněčné kultury - připravují se z různých orgánů nebo jejich částí. Nejvhodnější jsou embrya nebo mladí jedinci. Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky, které jsou lépe přizpůsobeny daným podmínkám. Možnosti dalšího pasážování v subkulturách jsou omezené - existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily, převést do nového média. Primární kultury mají diploidní sadu chromozómů a zpravidla jde o směs různých typů buněk původní tkáně (epiteloidní, fibroblasty).

6 Buněčné kultury - typy 2. Sekundární (diploidní) kultury vycházejí z primárních kultur a vznikají z buněk, které se v podmínkách in vitro začaly rozmnožovat. Mají rovněž diploidní chromozomovou výbavu, ale oproti primárním kulturám obsahují pouze jeden vyselektovaný typ buněk. Biologické vlastnosti těchto buněk jsou podobné jako v podmínkách in vivo, mohou se pasážovat až 50 x zhruba po dobu 1 roku (zkracování telomer).

7 Buněčné kultury - typy 3. Buňečné linie (heteroploidní) - získávají se cílenou selekcí z primárních kultur pomocí fyzikálních či chemických mutagenů nebo přímo z nádorových buněk (HeLa). Jsou plně adaptovány na podmínky in vitro a mohou být pasážovány neomezeně dlouhou dobu. Jejich charakter se však mění během pasážování a buňky v kultuře se často liší velmi výrazně od buněk tkání, ze kterých byly získány. Jejich charakteristickým znakem je heteroploidní počet chromozómů.

8 Základní principy buněčných kultur Izolace buněk Buněčná kultura se zakládá izolací určitého typu buněk ze zvířete, člověka či rostliny. K izolaci se používají nejrůznější techniky založené na mechanické disociaci tkáně a trávení pomocí proteolytických enzymů (trypsin, kolagenáza) v přítomnosti EDTA (váže Ca 2+ ). Separace buněk ze suspenze probíhá na základě rozdílných fyzických vlastnosti (různé velikosti a hustota centrifugace) nebo tendenci určitých typů buněk silně se lepit na sklo či plast (oddělení od buněk, které se lepí méně).

9 Buněčný separátor aktivovaný fluorescencí Technika využívá protilátku spojenou s fluorescenčním barvivém pro označení určitých buněk. Buňky jsou pomocí mírného proudu vpraveny do kapiláry, kde se mohou pohybovat pouze jedna za druhou a pomocí laseru je fluorescenční značka aktivována a měřena fluorescence každé jednotlivé buňky. Na výstupní trysce se pomocí vibrací vytvářejí miniaturní kapky, každá obsahující většinou jen jednu buňku. Kapky se automaticky nabijí buď pozitivně nebo negativně. V silném elektrostatickém poli jsou potom kapky odchýleny podle svého náboje a tím nasměrovány do patřičného sběrného kontejneru. Fluorescence activated cell sorter Přístroj je schopen přesně vybrat 1 fluorescenční buňku z 1000 neoznačených a vytřídit několik tisíc buněk každou vteřinu.

10 Základní principy buněčných kultur Podmínky kultivace Práce s buněčnými kulturami vyžaduje vhodně vybavenou laboratoř, vyškolené pracovníky a zvláštní spotřební materiál. Jedním z hlavních požadavků je udržení sterility a zabránění kontaminacím. Je vhodné pracovat ve vyhrazené čisté laboratoři podléhající speciálnímu režimu. Mezi základní pomůcky patří laminární box, inkubátor s řízenou atmosférou a inverzní mikroskop vybavený fázovým kontrastem. Používá se sterilní jednorázový plast, kultivační nádoby s upraveným povrchem a chemikálie určené pro práci s buněčnými kulturami.

11 Většina buněk může žít, množit se a exprimovat diferenciační charakteristiky in vitro v kultivačních nádobách. Pro růst buněk je důležitá optimální teplota (37 C), přístup kyslíku (filtry) a CO 2 (udržení ph medií; zvýšený parciální tlak, 5-7.5%), a také vysoká relativní vlhkost. Buňky mohou být kontinuálně pozorovány pod mikroskopem anebo biochemický analyzovány. Tak je možné studovat vliv buď přidání nebo odebrání specifické molekuly (hormony, růstové faktory) a také interakce mezi různými buněčnými typy. Většina buněk získaných z tkání vyžaduje pro svůj růst pevný povrch na který se uchytí. Dno plastové misky modifikované chemicky nebo gama zářením takový povrch poskytuje. Často musí být miska pokrytá nějakou z komponent extracelulární matrix (kolagen, laminin, fibronektin) aby buňky přežívaly a dělily se. Některé buňky jsou schopné proliferovat v suspenzi bez nutnosti adheze.

12 Kultivační media hlavní anorganické ionty (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl - ) stopové prvky zdroj energie (glukóza) aminokyseliny pufrující složku (CO 2-3 /HCO 3-, HPO 2-4 /H 2 PO 4- ) vitamíny a jiné složky různých enzymů mastné kyseliny a lipidy specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové faktory) antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) acidobazický indikátor (fenolová červeň) sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)

13 Růstová křivka buněčné kultury vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase růst buněčné kultury prochází několika fázemi: Lag-fáze počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení. Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření. Stacionární fáze (plató) rychlost růstu populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média. Fáze úbytku buněk dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením ph (následkem zvýšení koncentrace CO 2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.

14 Růstová křivka buněčné kultury Log 10 (h)

15 Různé buněčné linie se při nízkých hustotách chovají různě. Stejně tak se různé linie liší i svým chováním před dosažením plató. Většina buněčných kultur časem dosáhne konfluence na kultivačním povrchu se vytvoří hustá, prakticky souvislá vrstva buněk, které se vzájemně dotýkají. Konfluentní kultura je přitom uspořádána do jediné vrstvy (monolayer), pak se další množení buněk zastaví. Některé buněčné linie ovšem konfluence nikdy nedosáhnou (např. endotelie), dělení buněk se zastaví dříve například jakmile se jednotlivé buňky začnou dotýkat třeba jen svými výběžky. Naproti tomu například některé nádorové buňky kontaktní inhibici postrádají, takže rostou i po vytvoření jednoduché konfluentní vrstvy.

16 Pasážování buněk Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru. Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky. Dlouhodobé kultivace buněk lze dosáhnout pasážováním, kdy se buňky přesadí do nové kultivační nádobky, jakmile pokryjí její dno ze 70%. Subkultura

17

18 Rostlinné buněčné kultury Tabák BY-2

19 Produkce rekombinantních proteinů 1982 produkce lidského insulinu v E. coli 1986 uvedení na trh prvního proteinu vyprodukovaného v savčích buňkách V první řadě je nutné zvážit, jaký expresní systém bude vhodný pro produkci rekombinantního proteinu a tomu přizpůsobit následující klonovací postup: izolace cdna kódující daný protein navrhnout, sestavit, izolovat a namnožit expresní plasmid vnesení plasmidu do vhodného hostitele Volba expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinantního proteinu, potřebou zachovat nezbytné posttranslační modifikace, rozpustnosti proteinu a jeho požadovaným množství.

20 Co zaručuje funkčnost proteinu? 1. správná konformace (folding) 2. asociace všech podjednotek (kvartérní struktura) 3. správná lokalizace v buňce (sorting) 4. posttranslační modifikace (irreverzibilní) 5. vazba kofaktorů (koenzymy) 6. regulace aktivity (reverzibilní modifikace)

21 Posttranslační modifikace 1) Proteolytický sestřih (štěpení) 2) Tvorba disulfidických (cysteinových) můstků vazba S-S cysteinů na různých místech řetězce bakterie - periplazmatický prostor, DsbA a DsbB eukaryota - pouze v ER (vhodné redoxní prostředí), PDI (protein disulfid izomeráza) - tvorba a korekce S-S můstků redukční prostředí - rozpad S-S Proinzulin

22 Posttranslační modifikace 3) Chemické modifikace (připojování skupin) Glykosylace (N-glykosylace na Asn, O-glykosylace na Thr, Ser) Acetylace (N konec) Metylace (Arg, Lys) Fosforylace (Tyr, Ser, Thr, His, Asp) Karboxylace (Glu, Asp) Hydroxylace (Pro, Lys) Alkylace 4) Membránové kotvy GPI kotva (C konec) glykofosfatidylinositol kovalentně spojuje protein s fosfolipidem na buněční membráně farnesylace myristylace palmitylace

23 Fúzní proteiny usnadnění izolace rekombinantního proteinu, detekce translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a: a) krátký peptid [ (His) n, (Asp) n, (Arg) n...] chelatační afinitní chromatografie (IMAC) b) přirozený oligopeptid [MBP, CBD, GST, Trx, SUMO, intein...] pozitivní změny kvality a kvantity exprese (často zvýšení solubility rekombinantního proteinu, ochrana před proteolýzou, stabilizace proteinů) uniformita purifikace fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit (faktor Xa, thrombin, enterokinasa, SUMO proteáza, DTT)

24 Expresní systémy Živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek, především proteinů. Bakteriální systémy Escherichia coli, Bacillus subtilis Kvasinkové systémy Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Hmyzí systémy bakulovirus v buňkách Spodoptera frugiperda (vojnice) nebo Trichoplusia ni (Kovolesklec cizokrajný) Savčí buňky CHO (Chinesse hamster ovary), HEK (293T) (human embryonic kidney), HeLa, 3T3 (Swiss mouse embryonic fibroblast cells)

25 Expresní systém vs. velikost proteinu <8kDa Fúzní proteiny >8kDa Intracelulární proteiny 8-50kDa Sekretované proteiny >50kDa Sekretované a povrchové proteiny E.coli +++ Kvasinky Savčí buňky Hmyzí buňky

26 Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi Protein [g/l biomasy] E. coli P.pastoris Kvasinky S.cerevisiae Savčí buňky Hmyzí buňky Sekretovaný <0,5 0,2 4 0,25 0,001 0,1 0,001 0,5 Intracelulární rozpustný Intracelulární inkluze 0,5 5 0, ,001 0,

27 Charakteristika E.coli Kvasinky Savčí buňky Hmyzí buňky Buněčný růst rapidní (30min) rapidní (90min) pomalý (24h) pomalý (18-24h) Požadavky na růstové medium minimální minimální komplexní medium komplexní medium Cena růstového media nízká nízká vysoká vysoká Množství proteinu velké malé až velké malé nebo střední malé až velké Extracelulární exprese sekrece do inkluzních tělisek sekrece do media sekrece do media sekrece do media Extracelulární exprese Skládání proteinů obvykle nutné dodatečné složení v některých případech nutné dodatečné složení řádně složené proteiny řádně složené proteiny N-glykosylace - vysoký obsah manosy komplexní jednoduchá, bez sialové kyseliny O-glykosylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace

28 Transformace bakterii a kvasinek buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá kompetentní přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenze, Streptococcus pneumoniae všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: Chemická transformace Buňky se ošetří roztokem CaCl 2 /RbCl na ledě, který způsobí větší permeabilitu membrány. DNA se smísí s těmito buňkami a po krátké inkubací (adheze DNA na povrch buněk) se provede tzv. heat shock (30-60s 42 C). Elektroporace Vystavení buněk elektrickému šoku (10-20 kv/cm), což vede ke krátkodobé depolarizaci buněčné membrány a to umožní vniknutí cizorodé DNA do buněk.

29 Bakteriální expresní systémy Escherichia coli Výhody: - organizmus s dobře charakterizovaným genomem a proteomem - design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů - rychlý růst a nadprodukce rekombinantních proteinů - levné a jednoduché na manipulaci - vhodné linie E.coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy i obří bacmidy (>100kb) Nevýhody: - absence eukaryotních posttranslačních systémů - tvorba inkluzních tělísek (0,2 0,6mm) - preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota - kontaminace proteinů lipopolysacharidem (endotoxin)

30 Bakteriální plasmidové vektory plasmidy, kosmidy a bakteriofágy extrachromosomální elementy s autonomní replikací malá velikost vysoká účinnost transformace, klonování velkých DNA fragmentů Klonovací vektory umožňují snadné vložení libovolné sekvence DNA; musí obsahovat počátek replikace, selekční marker a klonovací místo (polylinker/mcs) Expresní obsahují silné promotory a umožňují efektivní přepis vložené sekvence DNA do mrna a následnou produkci proteinů v hostitelské buňce Shuttle (podvojné, kyvadlové, binární, pendlující) mohou se množit ve více organismech; musí obsahovat dva počátky replikace

31 Vektory pro klonování DNA E. coli TOP10F`- indukce IPTG pro blu/white screening Buňky transformované prazdným vektorem budou exprimovat LacZ a-peptid modré kolonie na X-gal/IPTG agaru. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-[beta]-D-galactopyranoside) IPTG (isopropyl-[beta]-d-thiogalactopyranoside)

32 Vektory pro expresi genů Klonovací místo (MCS) Selekční gen pro rezistenci k antibiotiku Operátor vazebné místo pro represor promotor Enhancer translace Ribozom - vazebné místo Fúzní značka (His tag)

33 Regulace exprese pod T7 promotorem exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein. před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein. T7 RNA polymerasa

34 Regulace exprese pod T7 promotorem pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacz promotorem. Tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG).

35 někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice. T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu. BL21(DE3)LysS

36 Ideální situace pro expresi v E. coli Protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem Velikost proteinu je < 50kDa Není nutná glykosylace (prokaryotycké geny buď eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím; většiná cytosolarních proteinů) Geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) Protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci Protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností refoldingu Všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

37 Lokalizace rekombinantních proteinů

38 Lokalizace rekombinantních proteinů

39 Ovlivnění rozpustnosti proteinů snížení teploty kultivace (18-25 C) použití slabšího promotoru fúzní značka snížení koncentrace induktoru exprese (IPTG) periplasmatická exprese (disulfid-isomerasy a foldasy) Rovnice Wilkinsona- Harrisona pro určování rozpustnosti proteinů CV N G P S n R K D E 1 2 n 0,03 Rozpustnost proteinu zaleží na parametru CV-CV. CV-CV <0 rozpustný protein CV-CV >0 nerozpustný protein n = počet aminokyselin N,G,P,S = počet Asn, Gly, Pro a Ser R,K,D,E = počet Arg, Lys, Asp a Glu λ 1, λ 2 = koeficienty (15,43 a -29,56) CV = 1,71

40 Postup při izolaci proteinů z inkluzních tělísek Biomasa Buněčný extrakt Dezintegrace buněk (French press, soninikace, lysozym) Centrifugace 30min, 10000xg Sediment Inkluzní tělíska 6-8M Gu-HCl + DTT 8M urea + DTT Denaturační činidla Denaturované proteiny Monomerní a redukované proteiny Membránová frakce Celé buňky Inkluzní tělíska Refoldovaný protein Denaturované proteiny Purifikované proteiny

41 Přístupy pro refolding proteinů Kontrolovaná renaturace s minimálním vznikem agregátů Dialýza Ředění Chromatografie (LC, GPC), zeolit Fosfolipidy Detergenty a povrchově aktivní látky (Tween, TritonX-100, PEG, SDS) Alkohole s krátkými řetězci (n-pentanol, n-hexanol, cykloheksanol) Sacharidy (glycerol, sacharosa, glukosa, N-acetyl glukosamin) In vivo folding enzymy (disulfid isomerasa, chaperony) Monitorování % refoldingu Enzymatická či biologická aktivita Protilátky proti nativní konformaci proteinu Spektroskopické metody fluorescence, CD spektra

42 Chaperony Napomáhají při stabilizaci nesbalených nebo částečně sbalených proteinů pomocí tvorby nekovalentních interakcí, a proto usnadňují jejich sbalování do správné konformace. Skupina I v bakteriích a také v chloroplastech a mitochondriích ATP-ázy nejsou specifické ke svým ligandům dříve označovaný jako heat shock proteins (Hsp) nejlepé charakterizovaný je komplex GroEL/GroES v E.coli (Hsp60) Skupina II Archaea a v cytosolu eukaryot CCT chaperony (chaperonin containing TCP-1 Ring Complex) nepoužívají kofaktor

43 GroEL/GroES GroEL double-ring 14mer GroES single-ring heptamer Aktivní komplex obsahuje 14 kopií GroEL a 7 kopií GroES Tvorba komplexu GroEL/GroES vyžaduje velikou konformační změnu cis GroEL prstenu, která mění vnitřek komplexu z hydrofobního na hydrofilní a ruší symetrií obou prstenů GroEL. Energie pro konformační změnu komplexu je získána diky navázání ATP a jeho odbourání do ADP+P.

44

45 U prokaryot je sbalování individuálních domén proteinů přesunuto až do úplného polypeptidového řetězce, který je skládán pomocí riobosomu. Naopak domény proteinů eukaryot jsou sbalovaný postupně a na sobě nezávislé. Při heterologní expresi velkých multidoméních proteinů v E.coli může proto dojit k agregaci a také tvorbě inkluzívních tělisek. Bylo prokázáno, že jejich tvorba může být potlačena diky společné expresi proteinů s chaperoniny GroEL/GroES.

46 Bakterialní expresní systémy Bacillus subtilis Výhody: - není lidský patogen (má status GRAS generally regarded as safe ) - neprodukuje žádné endotoxiny - má vyvinutý výkonný sekreční systém (jednodušší zpracování proteinů) - nemá podstatné odchylky v genetickém kódu (codon usage bias) - rychlý růst v levných mediích do vysokých koncentrací kultury - jednoduchá transformace díky přirozené kompetenci - standardizované kultivační techniky (fermentace) - vysoká kvalita proteinů (buněčný systém kontroly kvality) Nevýhody: - malá stabilita plasmidů - malé výtěžky rekombinantních proteinů (omezené využití) - extracelularní proteasy degradující heterologní proteiny

47 Laboratorní a průmyslově využívané kmeny Bacillus subtilis mají tyto mutace: delece genu produkujícího tenzidy (surfactin - srfc) delece genu produkujícího červený pigment (cypx nebo yvmc) delece genu pro extracelularní proteasy (neutral proteases, subtilisin, metalloprotease, bacillopeptidase F, wall-bound protease) delece genu pro intracelularní proteasu WB800 (npre apre epr bpr mpr::ble nprb::bsr Δvpr wpra::hyg cm::neo) kmen Bacillus subtillis deficientní na osm proteas, využívaný na produkci heterologních proteinu, které jsou vylučovaný do média Využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (farmakologie)

48 B. subtilis expresní vektory ITPG-inducible (MoBiTech) xylose-inducible cold-inducible

49 Kvasinkové expresní systémy eukaryontní systémy, které obecně mnohem vhodněji posttranslačně modifikují rekombinantní proteiny eukaryontního původu sekrece proteinů je dobře realizovatelná připojením sekrečních signálů jednoduchá genetická manipulace příprava expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a charakterizovat několik expresních klonů, neboť obvykle se intenzita tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu (multicopy insertions) růst v levných mediích do vysokých koncentrací buněčné suspenze dosažitelná sekrece rekombinantního proteinu a podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou je 1% pro S. cerevisiae a 10% pro P.pastoris

50 Kvasinkové expresní systémy Sacharomyces cerevisiae Promotory: Silné: alcohol dehydrogenase (ADH1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP), phosphoglycerate kinase (PGK) Přesněji regulované: galactose (GAL1), copper-binding metallothionein (CUP1), acid phosphatase (PHO5) S. cerevisiae strain phenotype: His-, Leu-, Trp-, Ura- Selekční markéry: Komplementace auxotrofních mutaci (Leu, Ura, Trp) Resistence vůči antibiotikům (Geneticin, Blasticidin)

51 Zpracování sekretovaných proteinů a-mf prepro peptide (a-factor) 1. Protein je exprimován v jádře spolu se signálním peptidem. 2. a-mf vede protein do ER, kde signalní peptid je částečně odstraněn signální peptidasou. 3. Dále protein pokračuje do Golgi a Kex proteáza odstraňuje a-mf. 4. Protein je sekretovaný do media.

52 Kvasinkové expresní systémy Pichia pastoris Promotory: alcohol oxidase (AOX1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) formaldehyde dehydrogenase (FLD1) Selekční markéry: Biosyntetické markéry (geny P. pastoris: ADE1 (PR-amidoimidazolesuccinocarboxamide synthase), HIS4 (histidinoldehydrogenase), ARG4 (arginosuccinate lyase), URA3 (orotidine- 5 -phosphate decarboxylase), URA5 (orotatephosphoribosyltransferase)) Resistence vůči antibiotikům (Zeocin, Geneticin, Blasticidin) Resistence na formaldehyd (FLD1)

53 Kvasinkové expresní systémy Pichia pastoris

54 Exprese rekombinantních proteinů v Pichii Klonováni genu do vektoru pgapzα/ppic Linearizace konstruktu Transformace kompetentních buněk Pichia pastoris Homologní rekombinace Selekce transformantů Exprese rekombinantního proteinu

55 Exprese proteinů ve velkém měřítku

56 Typy fermentačních procesu Vsádkový (batch) - všechny živiny jsou vloženy do procesu již na počátku, metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu Přítokovaný (fed-batch) k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s novými živinami, metabolity se opět hromadí Kontinuální existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadržováni, nebo odtékají

57 Fermentor přesné dávkování regulovaná teplota (30 C) ph (KOH) obsah kyslíku (případně jiných plynů) míchaní antifoam dokrmování (50% glukóza)/indukce (MeOH) 25 Fed-batch start Harvest Dissolved oxygen [%] OD Cultivation time [h]

58 Odlišnost glykosylace proteinů v Pichii vysoký obsah manosy je immunogenní pro člověka produkce terapeutických proteinů v P. pastoris je možná díky zavedení lidského systému glykosylace (GlycoFi) dodatečné enzymy: manosidasa I a II, transferázy galaktozy, N-acetylglucosaminy a kyseliny sialové

59 Kvasinkové expresní systémy Kluyveromyces lactis intra- a extracelularní exprese silný LAC4 promotor selekce bez antibiotiků, acetamidáza (amds) umožňuje využití acetamidu jako jediného zdroje dusíku v mediu mnohočetné integrace expresního plasmidu vyšší výtěžek proteinů průmyslova produkce chymosinu (výroba sýrů)

60 Savčí expresní systémy Výhody: - produkují proteiny správně posttranslačně modifikované i správně sbalené - možnost kultivaci ve fermentoru - rekombinantní proteiny produkované v savčích buňkách se používají ve farmacii a pro další preklinické studie Nevýhody: - rostou pomalu a výtěžek je relativně nízký - jejich kultivace je finančně náročná - různé klony CHO buněk mají odlišné vyživovací požadavky náročná optimalizace media

61 Savčí expresní systémy Nejvyšší výtěžnost dosahují linie lidských embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO). Pro dosažení vysokého výtěžku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii buněk, což znamená, že vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí integrovat do genomu buněk a potom se množí společně s množícími se buňkami. Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo dominantní selekce.

62 Savčí expresní systémy - selekce Dominantní selekce znamená použití chemikálie normálně toxické pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenž se produkuje z genu lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Selekce stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyžaduje průběžné monitorování míry exprese proteinu, neboť se může stát, že jinak dojde k selektování klonu rezistentního na selekční markér, ale neprodukujícího dostatečné množství rekombinantního proteinu.

63 Selekční markery Dominantní selekce může být použita pro každý typ buněk rezistence vůči určitým antibiotikům: G418 neomycin fosfotransferáza hygromycin hygromycin B fosfotransferáza puromycin puromycin acetyltransferáza biosyntetické markery transfekce dává buňce schopnost prototrofie tryptofan syntetáza histidinol dehydrogenáza

64 Selekční markery Recesivní selekce hostitelská buňka musí být deficientní v selekční vlastnosti enzymy purinové a pyrimidinové biosyntetické dráhy když je de novo syntéza purinů a pyrimidinů inhibována buňky využívají alternativní dráhy ke přeměně nukleotidových prekurzorů thymidin kináza hypoxantin-guanin fosforibosyltransferáza adenine fosforibosyltransferáza buňky deficientní v enzym alternativní dráhy hynou; selekce chybějící enzym je dodán společně s transgenem využitelné pro amplifikaci DNA transgenu dihydrofolát reduktáza + metotrexát (selekce po několik měsiců) ornitin dekarboxyláza + a-difluoromethylornitine

65 Savčí expresní systémy Linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO) Poprvé představeny v 60. létech 20. století, dnes nejčastěji používané savčí buňky pro produkci rekombinantních proteinů v průmyslovém měřítku. CHO buňky se často používají v cytogenetice, kvůli malému počtu chromosomů (2n=22). Poskytují modelový systémem ve výzkumu genetických změn v kulturách savčích buněk.

66 Savčí expresní systémy Linie lidských embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) Tyto buňky byly poprvé připraveny roku 1970 v laboratoři Alexe Van der Eba v Leidenu v Holandsku. Byly získány ze zdravého potraceného lidského plodu, poprvé kultivovány jako primární HEK (human embryonic kidney) buňky. Později byly upraveny transformací pomocí pěti adenovirových genů (Graham a kol., 1977). Buňky HEK 293 se používají pro produkci rekombinantních proteinů, relativně jednoduše se kultivují i transfekují. Protože se jedná o lidské buněčné linie, zajišťují tyto buňky naprosto všechny posttranslační modifikace, které jsou pro daný rekombinantní protein potřeba, používají se tedy pro produkci lidských terapeutik a pro klinický výzkum. Lze je také poměrně snadno převést do většího produkčního objemu, takže jsou zajímavé i pro průmyslovou produkci rekombinantních proteinů.

67 Přenos DNA do buněk 1. Virové vektory (SV40, retroviry, alfaviry, vakcinie, ss a ds adenoviry) 2. Fyzikální metody: a) elektroporace b) mikroinjekce (původní jádro buňky se odsaje a nahradí se jádrem s rekombinantně upraveným genomem) 3. Chemické metody: a) CaPi precipitace (založeno na koprecipitaci DNA s fosforečnanem vápenatým, vytvořený komplex pak adheruje na povrchu buněk, 5 % CaPi/DNA precipitátu se dostává do buněk fagocytózou) b) lipofekce (pozitivně nabité lipidy tvoří elektrostatické interakce s negativní páteří DNA, vznikají kondenzované agregáty, kde kladný náboj a lipofilie pozitivně nabitých lipidů umožňuje interakci se zápornou a hydrofobní buněčnou membránou a následný vstup do cílové buňky) c) syntetické komplexy DNA-ligand (kondenzace DNA s polykationtem (PEI;DEAE-dextran), vhodná metoda pro transientní transfekce díky jednoduchosti a relativně nízké ceně)

68 Hmyzí expresní systémy Bakulovirus expression vector systém (BEVS) Bakuloviry - obalené viry z čeledi Baculoviridae, s genetickou informací v dvouvláknité, kruhové DNA (134 kbp) bakuloviry jsou druhově specifické, infikují jen bezobratlý mezi nejčastější hostitele patří nedospělé larvální formy hmyzu, zejména řády Lepidoptera, Hymenoptera a Diptera a řád korýšů (Decapoda) k nejvíce prostudovaným a využivaným bakulovirům patří virus AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) virus AcMNPV byl původně izolován z hmyzích buněk housenek druhu Spodoptera frugiperda (vojnice) gen pro tvorbu proteinu je do produkčních buněk přechodně vnášen formou infekce bakulovirem a nedochází ke stabilní transfekci

69

70 Životní cyklus bakulovirů v infikovaných hmyzích buňkách. V hostitelské buňce jsou tvořeny dvě formy virových částic: viriony shromažděné do okluzí (ODV) v jádře a pučící viriony (BV) dozrávající při průchodu plazmatickou membránou. V přírodě mají okluze funkci ochrannou před působením vnějšího prostředí. Spolu s potravou se dostávají do těla larev hmyzu, kde jsou rozpuštěny ve střevě v alkalickém prostředí a dostávají se fúzí do epitelových buněk střeva. Cílem nukleokapsidu je jádro, kde probíhá replikace a transkripce nukleové kyseliny. Pučící virus podporuje sekundární infekci okolních buněk.

71 Hmyzí expresní systémy Bakulovirový expresní systém využívá přítomnosti rekombinantího bakuloviru se začleněným heterologním genem, který je pod kontrolou silného polyhedrinového promotoru ppolh, a buněčných linií hmyzích buněk Sf-9/Sf-21, odvozených od ovárií druhu Spodoptera frugiperda nebo HighFive TM - Trichoplusia ni kultivovaných in vitro.

72 Hmyzí expresní systémy polyhedrinový promotor umožňuje expresi polyhedrinu nebo rekombinantního proteinu - až 50% celkového proteinu na konci cyklu bakuloviru rekombinantní gen je vnášen do oblastí virového genomu, které nejsou nutné pro replikaci viru začlenění genu se děje homologickou rekombinací s využitím sekvencí vektoru - rekombinantní bakulovirus ztrácí jeden z postradatelných genů, který je nahrazen genem rekombinantním heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více expresními kazetami bacmid - binární vektor, který se může replikovat v E.coli a hmyzích buňkách, nese rezistenci na kanamycin a gen lacz

73 Příprava bakuloviru

74

75 Hmyzí expresní systémy Plaque assay stanovení titrů virů, nutný pro úspěšnou infekci Plaque-forming unit

76 Hmyzí expresní systémy Výhody: - bakuloviry nejsou lidské/rostlinné patogeny, neprodukují endotoxiny - možnost produkci proteinů ve fermentoru (buněčné linie Sf-9 jsou vhodné pro kultivací v suspenzi) - vysoká exprese rekombinantních genů, většina proteinů je rozpustná a jednoduše se získává z infekovaných buněk - posttranslační modifikace proteinů Nevýhody: - dlouhá, několikafázová příprava rekombinantního bakuloviru - nutnost titrovat rekombinantní bakulovirus plaque assay - náročné udržování a kontrola suspenze rekombinantních virů - kultivace hmyzích buněk vyžaduje pravidelnou péči - zavedení systému je pro experimentální laboratoř finančně náročné

77 Využití rekombinantních proteinů Základní výzkum: struktury modifikace funkce metabolických drah imunitních odpovědí Aplikovaný výzkum/ biotechnologický průmysl cytokiny (IL-2) hormony (inzulín, lidský růstový hormon, thyrogen) výroba terapeutických protilátek vakcíny (Hepatitis B) diagnostické a terapeutické soupravy potravinářství, textilní průmysl, papírnictví, čistící prostředky

78 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy Lidský inzulín inzulín hormon (51 aa) produkovány β buňkami Langerhansových ostrůvků slinivky břišní inzulín pro léčbu diabetiků byl extrahován z slinivky prasat a krav někteří diabetici však produkovali protilátky proti živočišnému insulinu lidský inzulín se začal syntetizovat uměle (drahé) 1982 poprvé připraven pomocí rdna technologie od devadesátých let se produkuje ve velkém a levně lidský insulin pomocí transgenních E.coli nebo kvasinek (např. Humulin )

79 HB vakcína hepatitis B je jednou s nejčastějších infekčních nemoci podle odhadu WHO 285 mln lidi je nositeli viru tradiční vakcína využívá buď atenuované nebo mrtvé viry, které díky antigenní podobnosti jsou schopny navodit protektivní imunitu v červnu 1986 Recombivax HB byl schválený jako preventivní vakcína proti hepatitis B rekombinantní vakcína využívá povrchní antigen viru, který stimuluje produkcí protilátek

80 Lidský růstový hormon (HGH) produkovaný hypofýzou je důležitý regulátor vývoje člověka nedostatkem růstového hormonu (GHD) trpí jen v USA děti pravidelné injekce hormonu mohou obnovit normální růst HGH se izoloval s hypofýz lidských a jehněčích mrtvol (velice drahé a velká spotřeba mrtvol) v 1985 Protropin byl schválený v 67 státech pro lečbu GHD u děti litr bakteriální kultury vyprodukuje 5mg hormonu za 15 hodin (dříve půl milionu jehněčích mozků)

81 Využití rekombinantních bakterií v potravinářství