Buněčné kultury a produkce rekombinantních proteinů. Ing. Marta Greplová, Ph.D.

Transkript

1 Buněčné kultury a produkce rekombinantních proteinů Ing. Marta Greplová, Ph.D.

2 Buněčné kultury - definice Procesy in vitro za účelem udržení životaschopnosti, rozšíření a využití buněk živých organismů. Mohou to být kultury prokaryotické (bakterie, mykoplasmy) a také eukaryotické (kvasinky, prvoci, rostlinné a živočišné buňky). Pojem buněčná kultura je v úzké souvislosti s výrazy tkáňová kultura nebo orgánová kultura, za které bývá často zaměňován. Přestože myšlenka kultivovat buňky in vitro pochází již z 19. století, rutinně se kultivace používají od 50. let 20. století.

3 Alexis Carrel ( ) Dokázal, že orgány či tkáně je možné dlouhodobě udržet na živu i po vyjmutí z organismu. V roce 1912 vložil do živného roztoku kus kuřecího srdce, jehož buňky vydržely v kultivační nádobě 27 let. Tento pokus způsobil průlom v rané historii biologie a měl význam pro rozvinutí metod genetických, mikrobiologických a farmaceutických. Od osmdesátých let se tak tkáňové kultury staly běžným nástrojem nejen pro výzkum, ale začaly se používat i v průmyslu.

4 Buněčné kultury - význam ve virologii - diagnostika virových onemocnění, kultivace a izolace viru, výroba virových vektorů pro genovou terapii či výroba vakcín proti virům (dětská obrna, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice) výroba enzymů, hormonů, monoklonálních protilátek, interleukinů a dalších proteinů pro léčebné, diagnostické či vědecké účely využití sek. metabolitu jako příchutí, parfémů, insekticidů, sladidel testování látek, léčiv a jejich toxicity či teratogenity výzkum rakoviny a vývoj protinádorových léčiv studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk klinická genetika - prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky choriových klků), postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve), chromozomové vyšetření nádorových buněk tkáňové inženýrství produkce transgenních plodin

5 Buněčné kultury - typy 1. Primární buněčné kultury - připravují se z různých orgánů nebo jejich částí. Nejvhodnější jsou embrya nebo mladí jedinci. Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky, které jsou lépe přizpůsobeny daným podmínkám. Možnosti dalšího pasážování v subkulturách jsou omezené - existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily, převést do nového média. Primární kultury mají diploidní sadu chromozómů a zpravidla jde o směs různých typů buněk původní tkáně (epiteloidní, fibroblasty).

6 Buněčné kultury - typy 2. Sekundární (diploidní) kultury vycházejí z primárních kultur a vznikají z buněk, které se v podmínkách in vitro začaly rozmnožovat. Mají rovněž diploidní chromozomovou výbavu, ale oproti primárním kulturám obsahují pouze jeden vyselektovaný typ buněk. Biologické vlastnosti těchto buněk jsou podobné jako v podmínkách in vivo, mohou se pasážovat až 50 x zhruba po dobu 1 roku (zkracování telomer).

7 Buněčné kultury - typy 3. Buňečné linie (heteroploidní) - získávají se cílenou selekcí z primárních kultur pomocí fyzikálních či chemických mutagenů nebo přímo z nádorových buněk (HeLa). Jsou plně adaptovány na podmínky in vitro a mohou být pasážovány neomezeně dlouhou dobu. Jejich charakter se však mění během pasážování a buňky v kultuře se často liší velmi výrazně od buněk tkání, ze kterých byly získány. Jejich charakteristickým znakem je heteroploidní počet chromozómů.

8 Základní principy buněčných kultur Izolace buněk Buněčná kultura se zakládá izolací určitého typu buněk ze zvířete, člověka či rostliny. K izolaci se používají nejrůznější techniky založené na mechanické disociaci tkáně a trávení pomocí proteolytických enzymů (trypsin, kolagenáza) v přítomnosti EDTA (váže Ca 2+ ). Separace buněk ze suspenze probíhá na základě rozdílných fyzických vlastnosti (různé velikosti a hustota centrifugace) nebo tendenci určitých typů buněk silně se lepit na sklo či plast (oddělení od buněk, které se lepí méně).

9 Buněčný separátor aktivovaný fluorescencí Technika využívá protilátku spojenou s fluorescenčním barvivém pro označení určitých buněk. Buňky jsou pomocí mírného proudu vpraveny do kapiláry, kde se mohou pohybovat pouze jedna za druhou a pomocí laseru je fluorescenční značka aktivována a měřena fluorescence každé jednotlivé buňky. Na výstupní trysce se pomocí vibrací vytvářejí miniaturní kapky, každá obsahující většinou jen jednu buňku. Kapky se automaticky nabijí buď pozitivně nebo negativně. V silném elektrostatickém poli jsou potom kapky odchýleny podle svého náboje a tím nasměrovány do patřičného sběrného kontejneru. Fluorescence activated cell sorter Přístroj je schopen přesně vybrat 1 fluorescenční buňku z 1000 neoznačených a vytřídit několik tisíc buněk každou vteřinu.

10 Základní principy buněčných kultur Podmínky kultivace Práce s buněčnými kulturami vyžaduje vhodně vybavenou laboratoř, vyškolené pracovníky a zvláštní spotřební materiál. Jedním z hlavních požadavků je udržení sterility a zabránění kontaminacím. Je vhodné pracovat ve vyhrazené čisté laboratoři podléhající speciálnímu režimu. Mezi základní pomůcky patří laminární box, inkubátor s řízenou atmosférou a inverzní mikroskop vybavený fázovým kontrastem. Používá se sterilní jednorázový plast, kultivační nádoby s upraveným povrchem a chemikálie určené pro práci s buněčnými kulturami.

11 Většina buněk může žít, množit se a exprimovat diferenciační charakteristiky in vitro v kultivačních nádobách. Pro růst buněk je důležitá optimální teplota (37 C), přístup kyslíku (filtry) a CO 2 (udržení ph medií; zvýšený parciální tlak, 5-7.5%), a také vysoká relativní vlhkost. Buňky mohou být kontinuálně pozorovány pod mikroskopem anebo biochemický analyzovány. Tak je možné studovat vliv buď přidání nebo odebrání specifické molekuly (hormony, růstové faktory) a také interakce mezi různými buněčnými typy. Většina buněk získaných z tkání vyžaduje pro svůj růst pevný povrch na který se uchytí. Dno plastové misky modifikované chemicky nebo gama zářením takový povrch poskytuje. Často musí být miska pokrytá nějakou z komponent extracelulární matrix (kolagen, laminin, fibronektin) aby buňky přežívaly a dělily se.

12 Kultivační media hlavní anorganické ionty (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl - ) stopové prvky zdroj energie (glukóza) aminokyseliny pufrující složku (CO 2-3 /HCO 3-, HPO 2-4 /H 2 PO 4- ) vitamíny a jiné složky různých enzymů mastné kyseliny a lipidy specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové faktory) sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) acidobazický indikátor (fenolová červeň)

13 Růstová křivka buněčné kultury vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase růst buněčné kultury prochází několika fázemi: Lag-fáze počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení. Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření. Stacionární fáze (plató) rychlost růstu populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média. Fáze úbytku buněk dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením ph (následkem zvýšení koncentrace CO 2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.

14 Růstová křivka buněčné kultury Log 10 (h)

15 Různé buněčné linie se při nízkých hustotách chovají různě. Stejně tak se různé linie liší i svým chováním před dosažením plató. Většina buněčných kultur časem dosáhne konfluence na kultivačním povrchu se vytvoří hustá, prakticky souvislá vrstva buněk, které se vzájemně dotýkají. Konfluentní kultura je přitom uspořádána do jediné vrstvy (monolayer), pak se další množení buněk zastaví. Některé buněčné linie ovšem konfluence nikdy nedosáhnou (např. endotelie), dělení buněk se zastaví dříve například jakmile se jednotlivé buňky začnou dotýkat třeba jen svými výběžky. Naproti tomu například některé nádorové buňky kontaktní inhibici postrádají, takže rostou i po vytvoření jednoduché konfluentní vrstvy.

16 Pasážování buněk Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru. Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky. Dlouhodobé kultivace buněk lze dosáhnout pasážováním, kdy se buňky přesadí do nové kultivační nádobky, jakmile pokryjí její dno ze 70%. Subkultura

17

18 Rostlinné buněčné kultury Tabák BY-2

19 Produkce rekombinantních proteinů Velikost rekombinovaného proteinu, posttranslační modifikace, rozpustnost, množství Expresní systém Izolace cdna kódující daný protein Navrhnout, sestavit, izolovat a namnožit expresní plasmid Vnesení plasmidu do vhodného hostitele

20 Expresní systémy Živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek, především proteinů. Bakteriální systémy Escherichia coli, Bacillus subtilis Kvasinkové systémy Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Hmyzí systémy bakulovirus v buňkách Spodoptera frugiperda (vojnice) nebo Trichoplusia ni (Kovolesklec cizokrajný) Savčí buňky CHO (Chinesse hamster ovary), HEK (293T) (human embryonal kidney)

21 Expresní systém vs. velikost proteinu E.coli Kvasinky Savčí buňky Hmyzí buňky <8kDa Fúzní proteiny +++ >8kDa Intracelulární proteiny kDa Sekretované proteiny >50kDa Sekretované a povrchové proteiny +++

22 Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi Protein [g/l biomasy] E. coli P.pastoris Kvasinky S.cerevisiae Savčí buňky Hmyzí buňky Sekretovaný <0,5 0,2 4 0,25 0,001 0,1 0,001 0,5 Intracelulární rozpustný 0,5 5 0, ,001 Intracelulární inkluze 0,

23 Charakteristika E.coli Kvasinky Savčí buňky Hmyzí buňky Buněčný růst rapidní (30min) rapidní (90min) pomalý (24h) pomalý (18-24h) Požadavky na růstové medium minimální minimální komplexní medium komplexní medium Cena růstového media nízká nízká vysoká vysoká Množství proteinu velké malé až velké malé nebo střední malé až velké Extracelulární exprese sekrece do inkluzních tělisek sekrece do media sekrece do media sekrece do media Extracelulární exprese Skládání proteinů obvykle nutné dodatečné složení v některých případech nutné dodatečné složení řádně složené proteiny řádně složené proteiny N-glykosylace - vysoký obsah manosy komplexní jednoduchá, bez sialové kyseliny O-glykosylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace

24 Fúzní proteiny usnadnění izolace rekombinantního proteinu, detekce translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a: a) krátký peptid [ (His) n, (Asp) n, (Arg) n... ] chelatační afinitní chromatografie (IMAC) b) přirozený oligopeptid [MBP, CBD, GST, thioredoxin, intein ] pozitivní změny kvality a kvantity exprese (často zvýšení solubility rekombinantního proteinu); uniformita purifikace fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit (faktor Xa, thrombin, enterokinasa, DTT)

25 Transformace bakterii a kvasinek buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá kompetentní přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenze, Streptococcus pneumoniae všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: Chemická transformace Buňky se ošetří roztokem CaCl 2 na ledě, který způsobí větší permeabilitu membrány. DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. heat shock (1 min. 42 C). Elektroporace Vystavení buněk elektrickému šoku (10-20 kv/cm), což vede ke krátkodobé depolarizaci buněčné membrány a to umožní vniknutí cizorodé DNA do buněk.

26 Bakteriální expresní systémy Výhody: Escherichia coli - organizmus s dobře charakterizovaným genomem a proteomem - design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů - rychlý růst a nadprodukce rekombinantních proteinů - levné a jednoduché na manipulaci - vhodné linie E.coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy i obří bacmidy (>100kb) Nevýhody: - absence eukaryotních posttranslačních systémů - tvorba inkluzních tělísek (0,2 0,6 m) - preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota - kontaminace proteinů lipopolysacharidem (endotoxin)

27 Bakteriální plasmidové vektory Vektory pro amplifikaci DNA Vektory pro expresi genů plasmidy, kosmidy a bakteriofágy extrachromosomální elementy s autonomní replikací malá velikost vysoká účinnost transformace, klonování velkých DNA fragmentů důležité sekvence a) počátek replikace b) selekční marker c) klonovací místo důležité sekvence d) promotor e) ribosom-vazebné místo f) enhancer translace mrna (např. v T7 systému) e) fúzní značka

28 Vektory pro klonování DNA E. coli TOP10F`- indukce IPTG pro blu/white screening Buňky transformované prazdným vektorem budou exprimovat LacZ -peptid modré kolonie na X-gal/IPTG agaru. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-[beta]-D-galactopyranoside) IPTG (isopropyl-[beta]-d-thiogalactopyranoside)

29 Vektory pro expresi genů Klonovací místo (MCS) Selekční gen pro rezistenci k antibiotiku Operátor vazebné místo pro represor promotor Enhancer translace Ribozom - vazebné místo Fúzní značka (His tag)

30 Regulace exprese pod T7 promotorem exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein. před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein. T7 RNA polymerasa pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi.

31 kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacz promotorem. Tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG). někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice. T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

32 E.coli BL21(DE3)LysS

33 Ideální situace pro expresi v E. coli Protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem Velikost proteinu je < 50kDa Není nutná glykosylace (prokaryotycké geny buď eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím; většiná cytosolarních proteinů) Geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) Protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci Protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností re-foldingu Všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

34 Lokalizace rekombinantních proteinů Periplasmatické funkční proteiny Sekretované proteiny PROTEIN translace Inkluzní tělíska RNA transkripce Rozpustné proteiny CYTOSOL DNA periplasma Extracelulární prostor

35 Ovlivnění rozpustnosti proteinů snížení teploty kultivace (18-25 C) použití slabšího promotoru fúzní značka snížení koncentrace induktoru exprese (IPTG) periplasmatická exprese (disulfid-isomerasy a foldasy) Rovnice Wilkinsona- Harrisona pro určov ování rozpustnosti proteinů CV N G P S n R K D E 1 2 n 0,03 Rozpustnost proteinu zaleží na parametru CV-CV. CV-CV <0 rozpustný protein CV-CV >0 nerozpustný protein n = počet aminokyselin N,G,P,S = počet Asn, Gly, Pro a Ser R,K,D,E = počet Arg, Lys, Asp a Glu λ 1, λ 2 = koeficienty (15,43 a -29,56) CV = 1,71

36 Postup při izolaci proteinů z inkluzních tělísek Biomasa Buněčný extrakt French press, soninikace, lysozym Centrifugace 30min, 10000xg Sediment Inkluzní tělíska 6-8M Gu.HCl + DTT 8M urea + DTT Denaturační činidla Denaturované proteiny Monomerní a redukované proteiny Membránová frakce Celé buňky Inkluzní tělíska Re-foldovaný protein Denaturované proteiny Purifikované proteiny

37 Přístupy pro re-folding proteinů Kontrolovaná re-naturace s minimáln lním m vznikem agregátů Dialýza Ředění Neionogenní detergenty Lipidy Glycerol, sacharóza, EDTA Chromatografie (LC, GPC) In vivo folding enzymy (disulfid isomerasa, chaperony) Monitorování % re-foldingu Enzymatická či biologická aktivita Protilátky proti nativní konformaci proteinu Spektroskopické metody fluorescence, CD spektra

38 Výhody: Bakterialní expresní systémy Bacillus subtilis - není lidský patogen (má status GRAS generally regarded as safe ) - neprodukuje žádné endotoxiny - má vyvinutý výkonný sekreční systém (jednodušší zpracování proteinů) - nemá podstatné odchylky v genetickém kódu (codon usage bias) - rychlý růst v levných mediích do vysokých koncentrací kultury - jednoduchá transformace díky přirozené kompetenci - standardizované kultivační techniky (fermentace) - vysoká kvalita proteinů (buněčný systém kontroly kvality) Nevýhody: - malá stabilita plasmidů - malé výtěžky rekombinantních proteinů (omezené využití) - extracelularní proteasy degradující heterologní proteiny

39 Laboratorní a průmyslově využívané kmeny B.subtilis mají tyto mutace: delece genu produkujícího tenzidy (sfrc) delece genu produkujícího červený pigment delece genu pro extracelularní proteasy (neutral proteases, subtilisin, metalloprotease, bacillopeptidase F) Využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (farmakologie)

40 B. subtilis expresní vektory ITPG-inducible (MoBiTech) xylose-inducible cold-inducible

41 Kvasinkové expresní systémy eukaryontní systémy, které obecně mnohem vhodněji posttranslačně modifikují rekombinantní proteiny eukaryontního původu sekrece proteinů je dobře realizovatelná připojením sekrečních signálů jednoduchá genetická manipulace příprava expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a charakterizovat několik expresních klonů, neboť obvykle se intenzita tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu (multicopy insertions) růst v levných mediích do vysokých koncentrací buněčné suspenze dosažitelná sekrece rekombinantního proteinu a podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou je 1% pro S. cerevisiae a 10% pro P.pastoris

42 Kvasinkové expresní systémy Sacharomyces cerevisiae S. cerevisiae strain phenotype: His-, Leu-, Trp-, Ura- Promotory: Silné: alcohol oxidase (AOX1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP), phosphoglycerate kinase (PGK) Přesněji regulované: galactose (GAL1), acid phosphatase (PHO5), copper-binding metallothionein (CUP1) Selekční markéry: Komplementace auxotrofních mutaci (Leu, Ura, Trp) Resistence vůči antibiotikům (Geneticin, Blasticidin)

43 Zpracování sekretovaných proteinů -MF prepro peptide ( -factor) 1. Protein je exprimován v jádře spolu se signálním peptidem. -MF vede protein do ER, kde signalní peptid je částečně odstraněn signální peptidasou. 3. Dále protein pokračuje do Golgi a Kex proteáza odstraňuje -MF. 4. Protein je sekretovaný do media.

44 Kvasinkové expresní systémy Biosyntetické markéry (geny P. pastoris: ADE1 (PR-amidoimidazolesuccinocarboxamide synthase), HIS4 (histidinoldehydrogenase), ARG4 (arginosuccinate lyase), URA3 (orotidine- 5 -phosphate decarboxylase), URA5 (orotatephosphoribosyltransferase)) Resistence vůči antibiotikům (Zeocin, Geneticin, Blasticidin) Pichia pastoris Promotory: alcohol oxidase (AOX1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) formaldehyde dehydrogenase (FLD1) Selekční markéry: Resistence na formaldehyd (FLD1)

45 Kvasinkové expresní systémy Pichia pastoris

46 Exprese rekombinantních proteinů v Pichii Klonováni genu do vektoru pgapzα/ppic Linearizace konstruktu Transformace kompetentních buněk Pichia pastoris Homologní rekombinace Selekce transformantů Exprese rekombinantního proteinu

47 Exprese proteinů ve velkém měřítku

48 Fermentor přesné dávkování regulovaná teplota (30 C) ph (KOH) obsah kyslíku (případně jiných plynů) míchaní antifoam dokrmování (50% glukóza)/indukce (MeOH) 25 Fed-batch start Harvest Dissolved oxygen [%] OD Cultivation time [h]

49 Odlišnost glykosylace proteinů v Pichii vysoký obsah manosy je immunogenní pro člověka produkce terapeutických proteinů v P. pastoris je možná díky zavedení lidského systému glykosylace (GlycoFi) dodatečné enzymy: manosidasa I a II, transferázy galaktozy, N-acetylglucosaminy a kyseliny sialové

50 Kvasinkové expresní systémy Kluyveromyces lactis intra- a extracelularní exprese silný LAC4 promotor selekce bez antibiotiků, acetamidáza (amds) umožňuje využití acetamidu jako jediného zdroje dusíku v mediu mnohočetné integrace expresního plasmidu vyšší výtěžek proteinů průmyslova produkce chymosinu (výroba sýrů)

51 Savčí expresní systémy Výhody: - produkují proteiny správně posttranslačně modifikované i správně sbalené - možnost kultivaci ve fermentoru - rekombinantní proteiny produkované v savčích buňkách se používají ve farmacii a pro další preklinické studie Nevýhody: - rostou pomalu a výtěžek je relativně nízký - jejich kultivace je finančně náročná - různé klony CHO buněk mají odlišné vyživovací požadavky náročná optimalizace media

52 Savčí expresní systémy Nejvyšší výtěžnost dosahují linie lidských embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO). Pro dosažení vysokého výtěžku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii buněk, což znamená, že vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí integrovat do genomu buněk a potom se množí společně s množícími se buňkami. Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo dominantní selekce.

53 Savčí expresní systémy Dominantní selekce znamená použití chemikálie normálně toxické pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenž se produkuje z genu lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Nejdříve tedy v plasmidu, který vneseme do buňky, a posléze v genomu, kam se plasmid integroval. Selekce stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyžaduje průběžné monitorování míry exprese proteinu, neboť se může stát, že jinak dojde k selektování klonu rezistentního na selekční markér, ale neprodukujícího dostatečné množství rekombinantního proteinu.

54 Savčí expresní systémy Příkladem je selekce buněk metotrexátem, kdy dochází k amplifikaci genu kódujícího dihydrofolát reduktasu (DHFR), který byl vnesen prostřednictvím rekombinantního plasmidu do buňky s deleční mutací obou alel genu kódujícího DHFR. Pokud plasmid konstruujeme tak, že dhfr gen je umístěn za gen kódující rekombinantní protein a oddělen je místem umožňující nasedání ribozomu (IRES), transkribovaná mrna je bicistronická a oba proteiny jsou translatovány z jedné mrna molekuly.

55 Savčí expresní systémy Linie ovariáln lních buněk k křečka k ka čínského (CHO) Poprvé představeny v 60. létech 20. století, dnes nejčastěji používané savčí buňky pro produkci rekombinantních proteinů v průmyslovém měřítku. CHO buňky se často používají v cytogenetice, kvůli malému počtu chromosomů (2n=22). Poskytují modelový systémem ve výzkumu genetických změn v kulturách savčích buněk.

56 Savčí expresní systémy Linie lidských embryonáln lních ledvinných buněk HEK (293T) Tyto buňky byly poprvé připraveny roku 1970 v laboratoři Alexe Van der Eba v Leidenu v Holandsku. Byly získány ze zdravých potracených lidských plodů, poprvé kultivovány jako primární HEK (human embryonal kidney) buňky. Později byly upraveny transformací pomocí pěti adenovirových genů (Graham a kol., 1977). Buňky HEK 293 se používají pro produkci rekombinantních proteinů, relativně jednoduše se kultivují i transfekují. Protože se jedná o lidské buněčné linie, zajišťují tyto buňky naprosto všechny posttranslační modifikace, které jsou pro daný rekombinantní protein potřeba, používají se tedy pro produkci lidských terapeutik a pro klinický výzkum. Lze je také poměrně snadno převést do většího produkčního objemu, takže jsou zajímavé i pro průmyslovou produkci rekombinantních proteinů.

57 Přenos DNA do buněk 1. Virové vektory (Adenovirus) 2. Fyzikální metody: a) elektroporace b) mikroinjekce (původní jádro buňky se odsaje a nahradí se jádrem s rekombinantně upraveným genomem) 3. Chemické metody: a) CaPi precipitace (založeno na koprecipitaci DNA s fosforečnanem vápenatým, vytvořený komplex pak adheruje na povrchu buněk, 5 % CaPi/DNA precipitátu se dostává do buněk fagocytózou) b) lipofekce (pozitivně nabité lipidy tvoří elektrostatické interakce s negativní páteří DNA, vznikají kondenzované agregáty, kde kladný náboj a lipofilie pozitivně nabitých lipidů umožňuje interakci se zápornou a hydrofobní buněčnou membránou a následný vstup do cílové buňky) c) syntetické komplexy DNA-ligand (kondenzace DNA s polykationtem (PEI;DEAE-dextran), vhodná metoda pro transientní transfekce díky jednoduchosti a relativně nízké ceně)

58 Hmyzí expresní systémy Bakulovirus expression vector systém m (BEVS) Bakuloviry - obalené viry z čeledi Baculoviridae, s genetickou informací v dvouvláknité, kruhové DNA (134 kbp) bakuloviry jsou druhově specifické, infikují jen bezobratlý mezi nejčastější hostitele patří nedospělé larvální formy hmyzu, zejména řády Lepidoptera, Hymenoptera a Diptera a řád korýšů (Decapoda) k nejvíce prostudovaným a využivaným bakulovirům patří virus AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) virus AcMNPV byl původně izolován z hmyzích buněk housenek druhu Spodoptera frugiperda (vojnice)

59 Životní cyklus bakulovirů v infikovaných hmyzích buňkách. V hostitelské buňce jsou tvořeny dvě formy virových částic: viriony shromažděné do okluzí (ODV) v jádře a pučící viriony (BV) dozrávající při průchodu plazmatickou membránou. V přírodě mají okluze funkci ochrannou před působením vnějšího prostředí. Spolu s potravou se dostávají do těla larev hmyzu, kde jsou rozpuštěny ve střevě v alkalickém prostředí a dostávají se fúzí do epitelových buněk střeva. Cílem nukleokapsidu je jádro, kde probíhá replikace a transkripce nukleové kyseliny. Pučící virus podporuje sekundární infekci okolních buněk.

60 Hmyzí expresní systémy Bakulovirový expresní systém využívá přítomnosti rekombinantího bakuloviru se začleněným heterologním genem, který je pod kontrolou silného polyhedrinového promotoru ppolh, a buněčných linií hmyzích buněk Sf-9, odvozených od ovárií druhu Spodoptera frugiperda kultivovaných in vitro. (DH10Bac) 1 den 2-3 den 5-7 den 4 den

61 Hmyzí expresní systémy pbluebac4.5/v5-his TOPO nese důležité sekvence nutné pro homologní rekombinaci a replikaci bakuloviru. Jedná se zejména o silný polyhedrinový promotor, DNA sekvence nutné pro kompletaci bakteriálního lacz genu, gen ORF1629 nutný pro propagaci bakuloviru v hostitelské buňce, polylinker pro vložení cizorodé DNA a signály pro ukončení transkripce a polyadenylaci. Schéma homologní rekombinace mezi transferovým vektorem pbluebac4.5/v5-his TOPO a linearizovaným bakulovirem Bac-N-Blue za vzniku rekombinantního bakuloviru Bac-N-Blue.

62 Hmyzí expresní systémy Výhody: - bakuloviry nejsou lidské nebo rostlinné patogeny, neprodukují endotoxiny - možnost produkci proteinů ve fermentoru (buněčné linie Sf-9 jsou vhodné pro kultivací v suspenzi) - vysoká exprese rekombinantních genů, většina proteinů je rozpustná a jednoduše se získává z infekovaných buněk - exprese v hmyzích buňkách umožňuje posttranslační modifikace proteinů Příprava, ověření a udržování dostatečného množství infekčních virových partikulí (viral stock) představuje nejnáročnější krok celé bakulovirové technologie. V současnosti jsou komerčně dostupné i vektory pro přípravu stabilně transfekovaných linií hmyzích buněk umožňující vynechat náročné udržování a kontrolu suspenze rek. virů.

63 Využit ití rekombinantních proteinů Základní výzkum: struktury modifikace funkce metabolických drah imunitních odpovědí Aplikovaný výzkum/ biotechnologický průmysl cytokiny (IL-2) hormony (inzulín, lidský růstový hormon, thyrogen) výroba terapeutických protilátek vakcíny (Hepatitis B) diagnostické a terapeutické soupravy potravinářství, textilní průmysl, papírnictví, čistící prostředky

64 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy Lidský inzulín inzulín hormon (51 aa) produkovány β buňkami Langerhansových ostrůvků slinivky břišní inzulín pro léčbu diabetiků byl extrahován z slinivky prasat a krav někteří diabetici však produkovali protilátky proti živočišnému insulinu lidský inzulín se začal syntetizovat uměle (drahé) 1982 poprvé připraven pomocí rdna technologie od devadesátých let se produkuje ve velkém a levně lidský insulin pomocí transgenních E.coli nebo kvasinek (např. Humulin )

65 Brand name Amylase AG XXL Maturex Dextrozyme Fungamyl Super MA Lecitase Novo Noopazyme NovoCarne Tender Novoshape NOVOZYM Novozym Viscoferm Spirizyme Bio feed Phytase Alcalase BioPrep Clear-Lens LIPO NovoBate 100 Novozym 539 HP F Novozym Suberase Type of enzymes Glucoamylase Alpha-acetodecarboxylase Pullulanase / Amyloglucosidase Alpha-amylase / Xylanase Lipase Lipase Protease Pectinesterase Xylanase Cellobiose oxidase Cellulase / Xylanase / Betaglucanase Glucoamylase Phytase Subtillisin Pectate lyase Lipase Trypsin Protease Laccase Laccase Main application Juice industry Brewing industry Starch industry Baking industry Oils and fats industry Pasta / Noodles Meat industry Fruit processing Protein Hydrolysis Dairy Industry Alcohol industry Ethanol industry Animal feed industry Detergent industry Textile industry Personal care industry Leather industry Biocatalysis Paper industry Corks