VYUŽITÍ NANOČÁSTIC VE FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPII A RAMANOVĚ SPEKTROMETRII Jan PŘIKRYL, Ivona SVOBODOVÁ, Věra HEZINOVÁ, Marcela LIŠKOVÁ, Denisa MADĚRÁNKOVÁ, Karel KLEPÁRNÍK, František FORET Ústav analytické chemie AV ČR, v.v.i., Veveří 97, 602 00 Brno, ČR, prikryl@iach.cz Abstrakt Nanočástice jsou částice, jejichž velikost alespoň v jednom rozměru dosahuje hodnot v rozmezí 1 nm až 100 nm. Materiál složený z nanočástic se vyznačuje velice zajímavými vlastnostmi, které jsou využívány např. v oblasti přírodních a lékařských věd či průmyslových odvětvích. Tento příspěvek je věnován využití polovodičových nanokrystalů v optické fluorescenční mikroskopii pro studium buněk a dále se zaměřuje na spektrometrii povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). Kvantové tečky jsou polovodičové nanokrystaly vykazující fotoluminiscenční vlastnosti. Jsou tvořeny atomy prvků 12. a 16. skupiny periodické tabulky prvků (např. Zn, Cd, S, Se, Te). Jejich výhodou oproti konvenčním fluoroforům je zejména jejich fotostabilita, relativně vysoký kvantový výtěžek, široké excitační pásy, úzké emisní pásy a snadná laditelnost emisního maxima během přípravy. V tomto příspěvku bude prezentována instrumentace pro excitaci luminiscenčně značených buněk pomocí evanescentní vlny vznikající při totálním interním odrazu (TIR). Tento typ excitace poskytuje velmi nízké hodnoty pozadí, a je tak podobně jako konfokální mikroskopie jednou z metod umožňujících získat vysoce kontrastní snímky preparátu s limitem detekce na úrovni jednotlivých luminoforem značených molekul. Tato metoda bude srovnána s epifokální fluorescenční mikroskopií. Povrchem zesílená Ramanova spektrometrie umožňuje identifikovat a vysoce citlivě stanovit širokou škálu sloučenin. Za optimálních podmínek dochází k zesílení jak dopadajícího tak emitovaného záření na povrchu nanočástic, které jsou tvořeny nejčastěji ušlechtilými kovy (např. Au, Ag, Pd, Pt). V tomto příspěvku budou demonstrována SERS spektra modelových sloučenin za použití kovových nanočástic připravených různými syntetickými metodami. 1. ÚVOD Nanočástice jsou entity, jejichž alespoň jeden rozměr je menší než 100 nm, vyznačující se zajímavými vlastnostmi. Tento příspěvek je věnován využití polovodičových nanočástic, známých také jako kvantové tečky (QD), v optické fluorescenční mikroskopii a dále využití kovových nanočástic k zesílení Ramanova rozptylu v metodě známé jako povrchem zesílená Ramanova spektrometrie (SERS). 2. QD VE FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPII Polovodičové nanokrystaly, známé též jako kvantové tečky, jsou anorganické nanočástice používané jako perspektivní fotoluminiscenční značky. Ve srovnání s konvenčními fluorofory se vyznačují zejména vysokým kvantovým výtěžkem luminiscence, širokým excitačním pásem, úzkým symetrickým emisním pásem s možností ladit jeho vlnovou délku během přípravy a vysokou fotostabilitou. [1, 2] Díky těmto vlastnostem je možné provádět značení kvantovými tečkami různých barev současně za použití jediného excitačního zdroje a značený preparát pozorovat dlouhou dobu [3].
QD tedy splňují požadavky na kvalitní luminofor použitelný ve fluorescenční mikroskopii a ve spojení s metodami snižujícími vliv pozadí, jako je např. konfokální fluorescenční mikroskopie nebo fluorescenční mikroskopie s využitím totálního interního odrazu (TIRFM), umožňují dosahovat velmi nízkých detekčních limitů. 2.1 Fluorescenční mikroskopie s využitím totálního vnitřního odrazu TIRFM využívá k excitaci preparátu jev zvaný totální vnitřní odraz, který nastává při průchodu světla prostředími o různém indexu lomu (např. sklo-voda, sklo-vzduch). Na rozhraní těchto dvou prostředí dochází k úplnému odrazu světla a vzniku velmi tenkého elektromagnetického pole (obvykle hloubky v řádu stovek nanometrů), které se nazývá evanescentní vlna. Toto pole o stejné frekvenci jako dopadající záření je tedy možné využít k excitaci tenké vrstvy preparátu těsně přiléhající k rozhraní sklo-preparát a odstranit tak rušivý vliv ostatních vrstev preparátu, a tím zvýšit kontrast získaných snímků. 2.2 TIRFM instrumentace Instrumentace pro excitaci evanescentní vlnou byla sestavena s využitím komerčního invertovaného mikroskopu vybaveného imerzním objektivem (100x, NA = 1,25; glycerol). Pevnolátkovými lasery emitované záření vlnových délek 532 nm (P max = 30 mw) nebo 473 nm (P max = 10 mw) bylo zaostřeno pomocí dvou cylindrických čoček na půlkulovou čočku (n = 1,517), na které byla pomocí imerzní kapaliny (n = 1,515 1,517) umístěna dvě krycí skla (n = 1,517), mezi kterými se nacházel preparát (n ~ 1,3). Laserové záření tedy procházelo půlkulovou čočkou, vrstvou imerzní kapaliny, krycím sklem a na rozhraní skla a preparátu nastal totální odraz a vznikla evanescentní vlna. Pro srovnání byla k excitaci preparátu používána i rtuťová výbojka v epifokálním uspořádání. Emitovaná luminiscence byla po průchodu imerzním objektivem, dichroickým zrcadlem a BP filtry detekována CCD kamerou (monochromatická 14-bitová termoelektricky chlazená EMCCD kamera Luca, Andor, United Kingdom; nebo RGB termoelektricky chlazená CCD kamera Moticam 5000C, Motic, China). 2.3 Ověření hloubky evanescentní vlny Hloubka evanescentní vlny je závislá na několika parametrech, jako jsou vlnová délka záření, indexy lomu obou prostředí tvořících rozhraní a úhel dopadu záření na toto rozhraní. Kromě těchto parametrů je také ale šíření záření kolem rozhraní výrazně ovlivněno kvalitou rozhraní, zejména jeho rovinností. Nerovnost povrchu může způsobit např. rozptyl záření, které se potom šíří všemi směry, a excitovalo by, podobně jako v epifokálním uspořádání, i od rozhraní vzdálenější části preparátu. Proto byl pro ověření hloubky excitované části preparátu proveden experiment zahrnující dva různě umístěné vzorky, a to QD v pevném stavu nanesené buď na krycí sklo, na kterém dochází k totálnímu odrazu nebo nanesené na vzdálenější krycí sklo, které slouží jako oddělovač od glycerolové imerze. (Obr. 1) K excitaci obou vzorků byly použity jak excitace evanescentní vlnou, tak epifokální excitace rtuťovou výbojkou. Jak je vidět na Obr. 1, vzorek nanesený na rozhraní, kde dochází k úplnému odrazu, byl excitován evanescentní vlnou (Obr. 2A) i rtuťovou výbojkou (Obr. 2B), ovšem v případě TIRFM bylo dosaženo vyššího kontrastu. V případě, kdy byly QD naneseny na krycí sklo stýkající se s glycerolovou imerzí mikroskopového objektivu, při epifokální excitaci byl zaznamenán snímek podobný předchozímu vzorku (Obr. 2D), zatímco v případě TIRFM byl signál
20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika nedetekovatelný (Obr. 2C), a lze tedy říct, že vrstva preparátu excitovaná evanescentní vlnou je tenší než celková tloušťka preparátu. Obr. 1. Schéma experimentálního uspořádání při ověření hloubky evanescentní vlny A C B D Obr. 2. QD v pevném stavu nanesené na krycím skle, kde nastává TIR, excitované pomocí evanescentní vlny (A) a excitované v epifokálním uspořádání (B). QD nanesené na krycí sklo oddělující glycerolovou imerzi mikroskopového objektivu excitované pomocí evanescentní vlny (C) a excitované v epifokálním uspořádání (D).
2.4 Neselektivní značení lidských lymfocytů a Saccharomyces Cerivisiae kvantovými tečkami Nezbytnými předpoklady pro selektivní značení buněk je konjugace komponenty zajišťující selektivitu (protilátky) s luminiscenční značkou a možnost pronikání tohoto konjugátu do buněk. V tomto příspěvku byla studována možnost pronikání QD do buněk, resp. byla měřena doba pronikání QD do buněk lidských lymfocytů a kvasinek Saccharomyces Cerivisiae, které byly vybrány jako modelové buňky. Preparát obsahující lidské lymfocyty byl smíchán s roztokem obsahujícím kvantové tečky (λ em = 610 nm), jejichž povrch by pokryt molekulami kyseliny 3-merkaptopropionové (MPA). Detekovatelný průnik QD do buněk lymfocytů nastal po 30 minutách (Obr. 3). Preparát obsahující kvasinky Saccharomyces Cerivisiae byl smíchán Obr. 3. TIRF mirkofotografie lidského lymfocytu neselektivně značeného pomocí QD s roztokem obsahujícím QD (λ em = 522 nm zelená luminiscence) s MPA na povrchu a QD (λ em = 610 nm červená luminiscence) s 2-merkaptoethylaminem na povrchu. Po přibližně 60 minutách byla pomocí TIRFM a jednoho excitačního zdroje zaznamenána mikrofotografie na Obr. 4 demonstrující průnik QD do buněk. A B Obr. 4. TIRF mirkofotografie Saccharomyces Cerivisiae neselektivně značených pomocí QD emitujících světlo různých vlnových délek (A luminiscence, B - světlé pole) 3. POVRCHEM ZESÍLENÁ RAMANOVA SPEKTROMETRIE (SERS) Neelasticky rozptýlené záření, zvané Ramanův rozptyl, je možné zesílit použitím nanomateriálů vyrobených z ušlechtilých kovů (Ag, Au, Cu). Na povrchu těchto kovových nanomateriálů dochází po dopadu viditelného záření k rezonanci lokalizovaných povrchových plasmonů, a tím ke vzniku silného elektromagnetického pole. Pokud je analyt emitující Ramanovo rozptýlené záření v dosahu tohoto elektromagnetického pole, zvýší se indukovaný dipól analytu o několik řádů, a tím i intenzita jím emitovaného rozptýleného záření. SERS je tedy metoda umožňující použití Ramanovy spektrometrie v rozsahu nízkých koncentrací analytů a dokonce i při detekci jediné molekuly [4-8]. Nezbytnou podmínkou zesílení je ovšem příprava vhodného nanomateriálu a umístění analytu do jeho těsné blízkosti [9, 10]. Jako biologicky významná látka byl pro další měření vybrán β-karoten pro jeho jednoduché Ramanovo spektrum a výskyt rezonance při použití excitačního záření o vlnové délce 488 nm.
3.1 Příprava stříbrných nanočástic Stříbrné nanočástice byly připraveny dle postupu Lee a Meisela [11], kdy 250 ml 0,25 mm dusičnanu stříbrného bylo přivedeno k varu a za stálého míchání bylo po kapkách přidáno 5 ml 1% citronanu sodného a vařeno dalších 50 minut. 3.2 Instrumentace Měřicí sestava se skládala z kapiláry se vzorkem, do které byl pomocí BCX čočky zaostřen paprsek argonového laseru (λ em = 488 nm, P max = 200 mw). Emitované záření bylo sbíráno pod úhlem 90 mikroskopovým objektivem (40x, NA = 0,65) a poté zaostřeno na štěrbinu spektrometru Czerny-Turner a poté detekováno intenzifikovanou CCD kamerou (InstaSpec V, ORIEL, Germany). Před štěrbinou byl umístěn notch filtr pro odstranění záření o λ = 488 nm, tj. Rayleighova rozptylu. CCD detektor byl chlazen v prvním okruhu ethanolem o teplotě 10 C, v druhém okruhu byl chlazen termoelektricky na teplotu až o 25 C nižší. 3.3 Měření SERS speker Před měřením SERS spekter byl 1 ml částic odstředěn při 14 000 rpm po 5 min a dekantován. 20 l částic bylo rozmícháno v 1 ml ethanolu s 4 l nasyceného roztoku NaCl, pro vytvoření klastrů nanočástic. Ke klastrům nanočástic byl přidán roztok β-karotenu v chloroformu tak, že výsledné koncentrace β-karotenu byly 2,5.10-3, 2,5.10-4, 2,5.10-5 a 2,5.10-6 M. Takto připravené vzorky byly umístěny do kapiláry a bylo změřeno jejich SERS spektrum (Obr. 5). Klasické Ramanovo spektrum nebylo možno změřit, i když byla použita vysoká koncentrace β-karotenu. Naměřená SERS spektra odpovídala svými píky spektrům uvedeným v literatuře. Obr. 5. Srovnání SERS spekter β-karotenu naměřených s použitím Ag nanočástic
4. ZÁVĚR Byly syntetizovány polovodičové (CdTe) a kovové nanočástice (Ag). CdTe nanočástice byly použity k neselektivnímu značení buněk (Obr. 3 a 4). Pro účely studia buněk pomocí luminiscenčních značek bylo s využitím komerčního mikroskopu sestaveno zařízení umožňující excitaci evanescentní vlnou. Správná funkce této sestavy byla ověřena experimentem, který dokazuje, že preparát byl skutečně excitován evanescentní vlnou, nikoli zářením rozptýleným na nerovném rozhraní (Obr. 1 a 2). Touto metodou získané mikrofotografie buněk se vyznačují velmi nízkým pozadím, resp. vysokým kontrastem, oproti snímkům získaným v epifokálním uspořádání, a TIRFM lze tedy považovat za perspektivní metodu fluorescenční mikroskopie použitelnou pro studium buněk. Stříbrné nanočástice byly použity k zesílení Ramanova rozptylu β-karotenu, přičemž byla zaznamenána spektra β-karotenu s Ramanovským píkem, jehož intenzita byla závislá na koncentraci β-karotenu v rozsahu 2,5.10-3 až 2,5.10-4 M (Obr. 5). Povrchem zesílená Ramanova spektrometrie je tedy velmi citlivou metodou umožňující kvantitativní i kvalitativní analýzu. 5. PODĚKOVÁNÍ Tato práce byla podporována Grantovou agenturou Akademie věd České republiky (KAN400310651 a KJB400310709), Grantovou agenturou České republiky (GA203/08/1680, GA301/07/0490), Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (LC06023, MEB060821) a výzkumným záměrem Ústavu analytické chemie AV ČR, v.v.i. (AV0Z40310501). LITERATURA [1] Yu, W. W., aj. Water-soluble quantum dots for biomedical applications. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, č. 348, s. 781-786. [2] Chan, W. C. W.; Nie, S. M. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science, 1998, č. 281, s. 2016-2018. [3] Dong, W., aj. CdTe QDs-based prostate-specific antigen probe for human prostate cancer cell imaging. Journal of Luminescence, 2009, č. 129, s. 926-930. [4] Zhang, Z. L., aj. Single molecule detection of 4-dimethylaminoazobenzene by surface-enhanced Raman spectroscopy. Journal of Molecular Structure, 2009, č. 920, s. 297-300. [5] Delfino, I., aj. Time-dependent study of single-molecule SERS signal from yeast cytochrome c. Chemical Physics, 2006, č. 326, s. 356-362. [6] Wang, Z. J., aj. The structural basis for giant enhancement enabling single-molecule Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, č. 100, s. 8638-8643. [7] Jiang, J., aj. Single molecule Raman spectroscopy at the junctions of large Ag nanocrystals. Journal of Physical Chemistry B, 2003, č. 107, s. 9964-9972. [8] Nie, S. M.; Emery, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science, 1997, č. 275, s. 1102-1106.
[9] Sackmann, M.; Materny, A. Surface enhanced Raman scattering (SERS) - a quantitative analytical tool? Journal of Raman Spectroscopy, 2006, č. 37, s. 305-310. [10] Tian, Z. Q. Surface-enhanced Raman spectroscopy: advancements and applications. Journal of Raman Spectroscopy, 2005, č. 36, s. 466-470. [11] Lee, P. C.; Meisel, D. Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and Gold Sols. Journal of Physical Chemistry, 1982, č. 86, s. 3391-3395.