Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie. Pavel Matějka

Transkript

1 Optická konfokální mikroskopie a Pavel Matějka

2 1. Konfokální mikroskopie 1. Princip metody - konfokalita 2. Instrumentace metody zobrazování 3. Analýza obrazu 2. Konfokální 1. Luminiscenční 2. Ramanova 3. Instrumentace mikrospektroskopické mapování 4. Základy interpretace spektrálních map

3 Difrakce d = 1.22 l NA obj. + NA cond. Pro cm -1, ( cm -1 = 500 nm = 0.5 μm ) 1.22 (0.5 µm) d = = 0.47 µm

4 Difrakce, laterální rozlišení, velikost objektu Velké vzorky (>10 μm) Nepatrná difrakce Malé vzorky (<10 μm) Výrazný vliv difrakce Obrazové pole Plocha vzorku Difraktované záření

5 Difrakce, laterální rozlišení, velikost objektu Rozlišovací schopnost mikroskopu minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se zobrazí navzájem odděleně Obrazem bodu Airyho kroužek difrakční obrazec ohyb záření na čočkách objektivu překryv kroužků Tloušťka vzorku a hloubka ostrosti Omezení záření z mimoohniskových rovin konfokální mikroskopie Marvin Minsky patent 1957 Petráň, Hadravský - konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče - Tandem Scanning Confocal Microscope

6 Konfokální mikroskopie

7 Konfokální clonka ( pinhole ) Vymezuje záření pocházející ze zaostřené plochy pod mikroskopem Sekundární záření odrazové, luminiscenční, rozptylové

8 Možnost hloubkového proostřování Sekundární záření vždy jen z ohniskové plochy Kompromis průměru pinhole - menší průměr lepší hloubkové rozlišení, nižší signál na detektoru - větší průměr horší hloubkové rozlišení, vyšší signál na detektoru V kombinaci s laterálním rozlišením (zobrazováním či mapováním) možnost konstrukce 3D obrazu

9 Laserový rastrovací konfokální mikroskop (Laser Scanning Confocal Microscope) Bodový osvit fokusovaným laserovým paprskem (na úrovni difrakční meze) Stejný objektiv sběr odraženého, rozptýleného, fluorescenčního záření Rastrování objektu bod po bodu

10 Rastrování objektu bod po bodu Rozmítání laserového paprsku Posouvání vzorku se softwarově ovládaným stolkem Posouvání objektivu nad vzorkem Z hlediska rozlišení - výhodnější krátkovlnné lasery 488 nm, 532 nm Postupné snímání, obrazový šum Fotochemické reakce a fotofyzikální jevy

11

12 Záznam sekvence 2D obrazů tomografie vzorku Rekonstrukce 3D obrazu stereoskopické páry plastické obrazy

13 V kombinaci s laterálním rozlišením (zobrazováním či mapováním) možnost konstrukce 3D obrazu 2D obrazy jednotlivých vrstev Vertikální řezy

14 Fluorescenční obrazy při různých excitačních a emisních vlnových délkách Využití vlastní fluorescence / fotoluminiscence materiálu či využití fluorescenčních sond DAPI interkaluje do struktury DNA a RNA (modře) GFP zelený fluorescenční protein FITC fluorescein isothiokyanát (oblíbený fluorofor, snadno kovalentně modifikující např. protilátky) Fluorescein vyzařuje zelené světlo, když je osvícen modrým Cy3, Cy5 a Alexa 568 fluorofory vyvinuté specielně pro fluorescenční mikroskopii, vysoce fotostabilní a s vysokou účinností fluorescence

15

16 Image

17 Konfokální Ramanova

18 Konfokální Ramanova

19 Konfokální Ramanova

20 Schéma konfokálního Ramanova mikroskopu

21 Konfokální Ramanova

22 Konfokální Ramanova