ANALÝZA BUNĚK POMOCÍ RAMANOVY SPEKTROSKOPIE VLIV MATERIÁLU POUŽITÉHO SUBSTRÁTU

Transkript

1 ANALÝZA BUNĚK POMOCÍ RAMANOVY SPEKTROSKOPIE VLIV MATERIÁLU POUŽITÉHO SUBSTRÁTU Kateřina Štymplová Univerzita Palackého v Olomouci, Česká Republika Abstrakt: Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie má jedinečnou schopnost získat kvalitativní i kvantitativní vlastnosti analytu z velmi malých koncentrací. Je založena na měření neelasticky rozptýlených Stokesových (Ramanových) fotonů. Signál analytu lze zvýšit jeho umístěním na hrubý povrch ušlechtilého kovu např. zlato, stříbro. První spektrum naměřené povrchově zesílenou Ramanovou spektroskopií bylo spektrum pyridinu, adsorbovaného na stříbrné elektrodě, a naměřil ho v roce 1974 Fleischman. K získávání spekter z Ramanova spektrometru se využívá program Omnic, který lze využít i k úpravě získaných dat. Klíčová slova: Ramanova spektroskopie, rozptyl, spektroskopie, spektra, nanočástice, substrát, Stokesovy fotony, anti-stokesovy fotony, Reyleighův rozptyl, SERS Ramanova spektroskopie využívá k detekci látek, to znamená k detekci vibrací v molekulách, Ramanův rozptyl. Poskytuje informace o chemické struktuře a fyzikálních vlastnostech, které se využívají k identifikaci látek, které mají svoje specifická spektra. Dále se využívá ke kvantitativní analýze látek ve vzorku. Výhodou je, že vzorek lze měřit v různých fyzikálních stavech např. jako pevná látka, kapalina nebo pára, v horkém nebo studeném stavu atp. Problémem při měření vzorku může být jeho degradace nebo fluorescence. 1,15

2 Vzorky jsou v Ramanově spektrometru ozářeny monochromatickým světlem z laseru o frekvenci ν0 a energii, která je menší než rozdíl mezi energií základního a prvního excitovaného stavu látky. Většina fotonů projde beze změny vzorkem, ale malá část světla je rozptýlena do všech směrů. Měřené rozptýlené záření může mít buď stejnou frekvenci jako původní záření ν0 (Reyleighův rozptyl) a neponese žádnou analytickou informaci, nebo bude mít jinou frekvenci jako původní záření ν0 (Ramanův rozptyl) a ponese analytickou informaci. Fotony s nižší frekvencí než původní záření se nazývají Stokesovy (Ramanovy) fotony a fotony s vyšší frekvencí než původní záření se nazývají anti-stokesovy (Ramanovy) fotony. 2 Citlivost Ramanovy spektroskopie je ovlivněna malým množstvím neelasticky rozptýlených Ramanových fotonů. Citlivost lze zvýšit, pokud Ramanově aktivní molekuly vložíme do blízkosti, nebo na hrubý povrch ušlechtilého kovu. Existuje mnoho variant substrátů, které lze využít v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii (SERS). Využívají se např. koloidy ušlechtilých kovů a anizotropní kovové nanočástice. Substráty lze rozdělit do dvou tříd náhodné a zkonstruované. Náhodné substráty, jako např. aglomeráty nanočástic, podporují lokální dipólové momenty, což vede k vyššímu zesílení signálu, ale zesílení je těžké kontrolovat. Zkonstruované substráty mají charakteristické strukturální parametry, takže se dají kontrolovat lépe. 3 K zesílení signálu se využívají různé kovy jako např. zlato, stříbro, měď, lithium, sodík, rhodium, palladium, nikl, kobalt a železo. 6 Některé kovy sloužící k zesílení signálu jsou efektivnější než jiné. Má to několik důvodů. Prvním důvodem je, že povrchový plasmon vyžaduje, aby byl vytvořen excitačním zdrojem, který je obvykle ve viditelné nebo blízké infračervené části spektra. Rozsah frekvence, přes kterou je tohle možné, je vlastností elektronických struktur kovů a jejich povrchového zdrsnění. Druhým důvodem je, že k vytvoření intenzivního pole v blízkosti adsorbovaného analytu je nezbytné vytvořit správné povrchové zdrsnění. Třetím důvodem je, že povrch musí být relativně stabilní pro použité experimentální podmínky a musí efektivně adsorbovat analyt. 6 Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie má výhody oproti normální Ramanově spektroskopii v kratší době potřebné pro sběr dat a využívá nízkonákladový přenosný Ramanův spektroskop. Další výhodou SERS je, že lépe odstraňuje maskující fluorescenci a příspěvek rozptylu vody k vibračním Ramanovým spektrům. Na rozdíl od normální Ramanovy spektroskopie musí obsahovat kovové nanočástice. 4,9

3 Ramanovu spektroskopii vynalezl indický fyzik Candrasekhar V. Raman, který v roce 1928 popsal kombinovaný rozptyl záření na pevných vzorcích. Za tento objev získal v roce 1930 Nobelovu cenu. 7 Raman měl k měření pouze omezené přístrojové vybavení. Jako excitační zdroj použil pouze světelné záření. Postupem času se začali používat např. heliové nebo zinkové lampy, které ale měly velmi nízkou intenzitu. V roce 1930 se začala používat rtuťová výbojka a až v roce 1962 laser. K detekci používal Raman pouze svoje vlastní smysly. Později se začali používat fotocitlivé materiály, a teprve až po roce 1945 se začali využívat přístroje, jejichž základ tvoří fotoelektrický jev. Počátky povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie položil v roce 1974 Fleischman, který změřil Ramanovo spektrum monomolekulární vrstvy pyridinu, adsorbovaného na povrchu stříbrné elektrody. V roce 1977 Jeanmaire, Van Duyne, Albrecht a Creighton zjistili, že intenzita rozptýleného záření adsorbované látky je silnější než neadsorbované látky. 5,7 Obrázek č. 1 schéma Ramanova spektrometru 8 Povrchově zesílenou Ramanovu spektroskopii lze využít v medicíně k měření sekvence genů, bakteriální a virové DNA, hybridizací DNA sekvencí a buněčných organel. SERS lze využít i k měření proteinů, které můžou být jednoduché (obsahují pouze aminokyseliny) a konjugované (složeny z proteinu a prosthetické skupiny spojené kovalentní vazbou nebo z proteinu a apoproteinu, spojené slabou vazebnou interakcí). Výsledky měření stejných jednoduchých proteinů se mohou lišit, kvůli různému zesílení signálu nebo kvůli denaturaci proteinu v důsledku interakce s kovem. Také lze pomocí SERS měřit hemoproteiny, jako např. hemoglobin, myoglobin a cytochrom. 10,11,12

4 Software pro měření na Ramanově spektrometru se nazývá Omnic. Tento program dokáže měřit spektra a zpracovávat je. K získání co nejkvalitnějších spekter je nutné tyto spektra korigovat. Jedna ze základních korekcí je korekce základní čáry, což je taková část spektra, která není součástí píku. Lze korigovat její naklonění, zakřivení nebo posunutí, čímž dostaneme vertikální základní čáru, která je blízko nulové Ramanově intenzitě. Další korekcí je korekce bílého světla, která způsobí, že se ze spektra odstraní zakřivení způsobené zdrojem bílého světla. Korekce fluorescence způsobí, že se ze spektra odstraní zakřivení způsobené zdrojem fluorescence. Dále lze vyčistit část spektra vymazáním nežádoucích píků, které se ve spektru mohou objevit např. při nežádoucím ozáření vnějším světlem. Tyto nežádoucí píky lze i nahradit rovnou čarou. Pokud jsou spektra ovlivněna nežádoucím šumem, lze tento šum odstranit pomocí funkce vyhlazení spektra. Tato funkce přednostně vyhlazuje data s nejvyšší frekvencí. K vyhlazení se využívá Savitzky-Golay algoritmus. Další korekcí je změna rozložení dat. Frekvence, která se nachází mezi jednotlivými píky, udává rozložení dat. Tuto frekvenci lze zvýšit, nebo snížit. Úpravou rozložení dat získáme možnost lépe porovnávat data mezi sebou, protože data mohou být naměřena s různým rozložením dat. Závěr: Ramanova spektroskopie má velké pole využití. Konkrétně povrchově zesílená Ramanova spektroskopie má velký potenciál pro využití v medicínské diagnostice, např. nádorových buněk. Prozatím ale není tato technika natolik pokročilá, aby se dala využívat v medicínské praxi.

5 Literatura: (1) Smith, E.; Dent, G. Modern Raman Spectrocopy: A Practical Approach; John Wiley & Sons: Chichester, 2005; Vol (2) Collette, T. W.; Williams, T. L. The Role of Raman Spectroscopy in the Analytical Chemistry of Potable Water. J. Environ. Monit. 2002, 8, (3) Yan, B.; Thubagere, A.; Premasiri, W. R.; Ziegler, L. D.; Negro, L. D.; Reinhard, B. M. Engineered SERS Substrates with Multiscale Signal Enhancement: Nanoparticle Cluster Arrays. ACS Nano 2009, 13, (4) Premasiri, W. R.; Moir, D. T.; Klempner, M. S.; Krieger, N Jones, G Ziegler, L. D. Characterization of the Surface Enhanced Raman Scattering ( SERS ) of Bacteria. J. Phys. Chem. B 2005, 9, (5) Ferraro, R. J.; Nakamoto K.; Brown, W. C. Introductory Raman Spectroscopy; Elsevier: Rhode Island, 2003; Vol (6) Smith, W. E. Practical Understanding and Use of Surface Enhanced Raman Scattering/surface Enhanced Resonance Raman Scattering in Chemical and Biological Analysis. Chem. Soc. Rev. 2008, 10, (7) Rolečková, A. Ramanova a Povrchem Zesílená Ramanova Spektroskopie Při Excitaci 532 nm Měřena Na Dvou Odlišných Sestavách. Bakalářská práce, Univerzita Palackého v Olomouci, (8) Třeštíková, L. Ramanova Spektroskopie Biologicky Aktivních Látek a Protinádorových Léčiv. Diplomová práce, Vysoké učení technické v Brně, (9) Schlücker, S. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: Concepts and Chemical Applications. Angew. Chemie - Int. Ed. 2014, 40, (10) Vo-Dinh, T.; Yan, F.; Wabuyele, M. B. Surface-Enhanced Raman Scattering for Medical Diagnostics and Biological Imaging. J. Raman Spectrosc. 2005, 8, (11) Han, X. X.; Zhao, B.; Ozaki, Y. Surface-Enhanced Raman Scattering for Protein Detection. Anal. Bioanal. Chem. 2009, 9, (12) Kitahama, Y.; Ozaki, Y. Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering of Hemoproteins and Those in Complicated Biological Systems. Analyst 2016, 17, (13) Thermo Scientific. Omnic Help. Thermo Fisher Scientific Inc.: USA, (14) Chalmers, J. M.; Edwards, H. G. M.; Hargreaves, M. D. Infrared and Raman Spectroscopy in Forensic Science. John Wiley & Sons: Chichester, 2012; Vol (15) Holzbecher Z.; Churáček J. Analytická chemie. Nakladatelství technické literatury: Praha, 1987; Vol. 663.