NÁVODY PRO CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE. Studijní text Fakulty životního prostředí UJEP

NÁVODY PRO CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE Studijní text Fakulty životního prostředí UJEP Kolektiv autorů FŽP UJEP, 2011

1 Úvod... 3 1.1 Organizace laboratorních cvičení... 3 1.1.1 Protokoly... 3 2 Bezpečnost a hygiena práce v mikrobiologické laboratoři... 5 2.1 Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři... 5 2.2 Další zásady práce v mikrobiologické laboratoři... 6 2.3 První pomoc při mimořádnostech a úrazech... 6 3 Principy sterilní práce... 7 3.1 Sterilační metody... 7 3.1.1 Sterilace povrchů... 8 3.1.2 Sterilace médií a laboratorního nádobí... 8 4 Kultivační techniky... 9 4.1 Média... 9 4.2 Kultivace mikroorganismů... 10 4.3 Příprava agarových misek... 10 4.4 Očkování na pevné půdy... 11 5 Jednotlivé laboratorní úlohy... 12 5.1 1. cvičení příprava... 12 5.1.1 Měření spadu mikroorganismů ze vzduchu... 13 6 Použitá média a roztoky... 14 6.1 Kultivační média... 14 6.1.1 LB (Luria Broth)... 14 6.1.2 Plate count agar (PCA)... 14 6.1.3 Malt extract... 14 6.1.4 Škrobový agar... 14 6.1.5 Médium pro kultivaci sladkovodních řas... 14 6.2 Roztoky... 15 6.2.1 Fyziologický roztok... 15 6.2.2 fosfátový pufr 0,066 M ph 7... 16 6.3 Barviva... 16 6.3.1 Krystalová violeť... 16 6.3.2 Safranin... 16 6.3.3 Methylenová modř... 16 6.3.4 Lugolův roztok... 16 7 Přílohy... 17 2

1 ÚVOD Tento text slouží pro potřeby výuky cvičení z mikrobiologie na Fakultě životního prostředí Univerzity Jana Evangelisty Purkyně v Ústí nad Labem. Studenti by si ho měly prostudovat před začátkem cvičení, aby byli teoreticky seznámeni s tím, co je čeká při praktické výuce. Každá kapitola se zabývá nějakým vyučovaným postupem, podobné práce jsou sdruženy. V každé kapitole naleznete teoretický úvod do problému, principy práce, vlastní postup práce a závěrečné zhodnocení výsledků. 1.1 ORGANIZACE LABORATORNÍCH CVIČENÍ Praktická laboratorní cvičení jsou podmínkou pro udělení zápočtu u studentů denního studia a účast na nich je povinná. Je možné uznat jednu absenci, ale jen v odůvodněných případech a po řádné omluvě. Pokud student vynechá cvičení, může si ho nahradit s jinou skupinou (umožní-li to kapacita a je-li daná práce ještě v programu). V posledním týdnu semestru (datum bude upřesněno) budou probíhat náhradní cvičení pro studenty se dvěma absencemi. Na tato cvičení je třeba se přihlásit emailem (josef.trogl@ujep.cz). Studenti s více absencemi (až na oprávněné výjimky) nedostanou zápočet a budou nuceni znovu si zapsat předmět 1MIKR v následujícím roce. Cvičení sestávají z pěti praktických laboratorních prací v rozsahu dvě vyučovací hodiny. K některým cvičením je nutný samostatný odběr přírodního vzorku, u některých cvičení je třeba mimo pravidelnou dobu cvičení přijít odečíst výsledky (např. počty narostlých kolonií apod.). Z každé práce musí studenti sepsat a odevzdat protokol. Na laboratorní cvičení je třeba mít s sebou plášť a dodržovat bezpečnostní předpisy (ignorování bezpečnosti práce může být důvodem k vyloučení studenta z laboratoří). Každý student by měl mít laboratorní deník (sešit), do kterého si bude dělat poznámky. Na každé laboratorní cvičení je k dispozici návod, který by si měl student před cvičením přečíst a pochopit principy práce. Student, který bude působit nepřipraveným dojmem, může být z laboratoří vyloučen. 1.1.1 PROTOKOLY Smyslem protokolu je zdokumentovat provedenou práci tak, aby bylo možné ji později reprodukovat, odhalit případné experimentální chyby či identifikovat faktor, který způsobuje neočekávané výsledky. Protokol by měl být stručný a výstižný a měl by obsahovat všechny důležité údaje (navážky, inkubační časy, primární i přepočítané výsledky apod.). Zejména je třeba zdůraznit a zdůvodnit případné odchylky od standardního postupu. Pokud zpracováváte nějaká statistická data (např. máte průměr z deseti měření), je třeba je doplnit alespoň základní statistickou charakteristikou (průměr ± směrodatná odchylka) apod. Protokol by měl proto obsahovat tyto prvky: jména studentů, identifikaci skupiny ("lichý čtvrtek od 8,00" apod.), datum práce stručný princip práce (několik vět) stručnou metodiku (není třeba opisovat postup z návodu, ale je třeba vypsat údaje potřebné pro další vyhodnocování, např. navážky, objemy či teploty) 3

primární nezpracované výsledky v podobě tabulek či grafů (např. počty mikroorganismů v jednotlivých polích počítací komůrky, počty narostlých kolonií apod.) přepočty primárních výsledků na porovnatelné rozumné veličiny (např. roztěry ze vzorku vody v počtech CFU/ml apod.). Je vhodné nepsat jen vzorce, ale i číselné dosazení, pak je možné lépe odhalit chybu stručný slovní závěr ( V testované vodě jsme zjistili XX±YY CFU, Neznámý mikroorganismus byl určen jako gramnegativní apod.) Vzorový protokol je v příloze Dále platí následující pravidla: Protokoly odevzdávejte v písemné podobě na příštích laboratorních cvičeních. Doporučuji zpracování na počítači a tisk, nejlépe oboustranný. V případě malých nedostatků budou tyto prokonzultovány a protokol uznán, v případě závažných nedostatků bude protokol vrácen k přepracování. Některé práce budou probíhat ve skupinách 2-4 studentů, v takovém případě odevzdávejte pouze jeden protokol za celou skupinu. Stejně jako skupinová práce je dílem všech, je i protokol dílem všech a všichni by se měli podílet na jeho sepsání. Udělá-li protokol jen jeden člen skupiny, měli by si ho ostatní alespoň přečíst. Případné vrácení pak padá na celou skupinu. Oblíbené výmluvy to psal kolega a já ani nevím, jak to spočítal ) nebudou pochopitelně uznány. Kdo bude mít omluvenou a uznanou absenci, měl by se seznámit s protokoly ostatních (praktické otázky z cvičení mohou být v testu). Při sepisování protokolů se snažte používat zdravý selský rozum. Občas se v protokolech objeví zjevně zcela nesmyslné výsledky, např. "v jednom ml vody jsme zjistily 1,3.10 9 gramů mikroorganismů" (tj. 1300 tun, nákladní vlak plně naložený bakteriemi ). 4

2 BEZPEČNOST A HYGIENA PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI Každá laboratorní práce představuje potenciální riziko. Nesprávným postupem práce je možné ohrozit vlastní bezpečnost, bezpečnost ostatních, stejně jako způsobit materiální škody. Proto je bezpodmínečně nutné se seznámit se zásadami bezpečné laboratorní práce a tyto dodržovat. Na prvním cvičení stvrdí studenti svým podpisem, že byli se zásadami bezpečné práce seznámeni a že se zavazují je dodržovat. Kromě běžných laboratorních rizik s sebou nese mikrobiologická práce i zvýšené zdravotní riziko vyplývající z práce z živými mikroorganismy, které mohou být potenciálně patogenní. I když v rámci výuky nebudou studenti pracovat přímo se známými patogeny, některé práce zahrnují kultivace nedefinované kultury (např. ze vzorků vody) a riziko infekce je proto vždy nenulové. 2.1 ZÁSADY BEZPEČNÉ PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI 1. V laboratoři je dovoleno pracovat jen pod dohledem pedagogického pracovníka, provádět jen ty úkony, které povolí, a je nutné dodržovat jeho pokyny a nařízení. 2. Při práci je třeba se chránit přiměřenými ochrannými pomůckami. Každý musí mít oblečen ochranný plášť, v případě těsnějšího kontaktu s potenciálně nebezpečným materiálem je třeba používat gumové rukavice. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 4. Je třeba dbát zvýšené hygieny. Při každém odchodu z laboratoře je třeba si důkladně umýt ruce mýdlem, v případě potřeby i desinfekčním činidlem. 5. Dojde-li ke kontaminaci předmětu (např. oděvu, tašky apod.) mikrobiální kulturou, je třeba vždy provést desinfekci, např. otření desinfekčním roztokem. 6. V laboratoři nesmí pracovat lidé, kteří by tím byli vystaveni výrazně zvýšenému zdravotnímu riziku. Jedná se např. o alergiky na některý mikroorganismus či látku, se kterou se pracuje, osoby s oslabeným imunitním systémem a těhotné ženy. Studenti stvrdí svým podpisem na prvních cvičeních, že jim jejich zdravotní stav absolvování cvičení umožňuje. 7. Každý úraz, byť i jen oděrku, je třeba hlásit pedagogickému pracovníkovi, kvůli zvýšenému riziku infekce rány. V laboratoři je k dispozici lékárnička pro základní ošetření úrazů a dezinfekci ran. 8. Rozbité laboratorní sklo je třeba odkládat do zvláštní k tomu určené nádoby. Je-li kontaminováno mikrobiologickou kulturou, musí se před vyhozením desinfikovat. Rozbité sklo se nesmí sbírat rukou, ale vždy jen zametat. 9. Každý laboratorní postup je třeba si promyslet, aby nedocházelo k závažným chybám a ohrožení zdraví či majetku. 10. Potenciálně nebezpečné operace je třeba dělat vždy jen předepsaným způsobem na určeném místě a s ohledem na bezpečnost svou i ostatních. 11. Při práci v blízkosti kahanu dbejte zvýšené opatrnosti, aby nedošlo k zahoření např. oděvu či vlasů. 12. Ke každé mikrobiální kultuře je třeba chovat se tak, jako by byla patogenní. Ke každé chemikálii je třeba se chovat tak, jako by byla prudce jedovatá. 13. Suspenze mikroorganismů je zakázáno pipetovat ústy, vždy je potřeba použít balónek nebo pipetovací nástavec. 5

2.2 DALŠÍ ZÁSADY PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI 1. V laboratoři je třeba udržovat pořádek. Úspěšnost většiny prací závisí na čistotě prostředí. 2. Po každé práci je třeba uklidit po sobě, zejména uvolnit své pracovní místo, umýt použité nádobí, očistit objektiv mikroskopu apod. 3. Použité mikrobiální kultury se musí po ukončení práce likvidovat, např. autoklávováním či roztokem desinfekčního činidla. 4. Snažte se pracovat tiše, aby i ostatní měli klid na vlastní práci. 2.3 PRVNÍ POMOC PŘI MIMOŘÁDNOSTECH A ÚRAZECH Stane-li se Vám úraz či jiná mimořádnost, zanechte práce (vyjma odvrácení bezprostředního ohrožení dalších lidí) a zavolejte pedagogický dozor, který poskytne první pomoc. 1. Dostane-li se mikrobiální kultura do úst, je třeba ústa vypláchnout a vykloktat desinfekčním roztokem, např. 1% KMnO 4 či zředěným Lugolovým roztokem 2. Kontaminovanou pokožku je třeba otřít desinfekčním činidlem, např. 0,1% Ajatinem. 3. Při zasažení oka mikrobiologickým materiálem je třeba vypláchnout oko borovou vodou. V případě zasažení chemikálií, je třeba oko důkladně vypláchnout proudem vody a poté borovou vodou. 4. Každou otevřenou ránu je třeba vydesinfikovat. 6

3 PRINCIPY STERILNÍ PRÁCE Sterilní prostředí je základem úspěšné mikrobiologické práce. Mikroorganismy jsou všude okolo nás (ve vzduchu, ve vodě, na kůži ) a pro úspěch experimentu je třeba je usmrtit nebo alespoň silně omezit. Dodržujte tyto pokyny: Pracujte v čistém prostředí, kde se nepráší, nevíří prach apod. S tím souvisí např. i zavřená okna. Pracovní plochu si vždy vysterilujte, např. ajatinem nebo ethanolem. Pokud není k dispozici laminární box, pracujte v okolí zapáleného kahanu. Ruce si před prací umyjte řádně mýdlem, popř. i desinfekčním činidlem. Pracujte rychle, ale pochopitelně bezpečně. Nikdy se nedotýkejte sterilních částí misek, baněk apod. (tj. obvykle těch vnitřních) rukou. Používejte pouze sterilní pomůcky. Ty pomůcky, které už přišly do styku s mikrobní kulturou, znovu nepoužívejte. Nepokládejte sterilní pomůcky (pinzety, kličky, zátky apod.) na pracovní plochu. Otevíráte-li sterilní nádobu, dělejte to vždy co nejblíže u kahanu a jen po nezbytně nutnou dobu. Je-li to možné, sterilujte zátku i hrdlo baňky lehkým ožehnutím v plameni (pozor na zahoření!) 3.1 STERILAČNÍ METODY V laboratoři se používají nejčastěji tyto sterilační metody: Vlhké teplo je účinnější než suché a ještě vyšší účinnosti se dosahuje za vyššího tlaku. Zařízení pro sterilaci mokrým teplem pod tlakem se nazývá autokláv. V autoklávu je možné sterilovat vše, co není citlivé na teplo, vlhko a tlak, např. média, nástroje, nádobí atd. Suché teplo nemá takovou sterilační účinnost a proto musí působit delší dobu (typicky 2 hodiny). Používá se hlavně pro sterilaci čistého nádobí, které je potřeba mít suché. Filtrace přes filtr s menšími póry než je velikost bakteriálních buněk se používá pro tekutiny (kapaliny a plyny) citlivé na teplo. Zařízení, ve kterém je možné pracovat sterilně v proudu filtrovaného vzduchu se nazývá laminární box nebo též flow-box. Chemické látky se používají ke sterilaci tam, kde není možné použít předchozí techniky a kde aplikace chemikálií nevadí. Příkladem je sterilace povrchů ethanolem. Chemikálie mohou být jak mikrobicidní (zabíjejí mikroorganismy), tak pouze mikrobistatické (brání rozmnožování). Spektrum mikrobicidních látek je veliké, např. oxidační činidla (peroxid vodíku, chlór apod.), kationaktivní detergenty (ajatin), alkoholy (ethanol) apod. Z mikrobistatických látek se nejčastěji používají antibiotika. Záření s dostatečnou energií (UV, gama) se nejčastěji používá pro sterilaci nepravidelných povrchů a vzduchu a pro speciální aplikace. Tzv. germicidní lampa emituje UV záření o vlnové délce 260-270 nm, které má nejvyšší mikrobicidní účinky. Ozařování gama zářením se někdy používá pro speciální sterilace, např. půdy. Plamen je velice účinný sterilační prostředek, ale dost nebezpečný. Používá se pro sterilaci kovových nástrojů (kličky, pinzety) a též pro sterilaci okolního vzduchu, neníli k dispozici flow-box. 7

3.1.1 STERILACE POVRCHŮ Ke sterilaci povrchů (pracovního stolu apod.) používáme v našich laboratořích buď 50% roztok etanolu nebo 0,1% roztok ajatinu. Oba roztoky jsou k dispozici u výlevky ve střičkách. Stříkněte přiměřenou dávku na sterilovaný povrch a rozetřete buničinou nebo papírem. Jinou možností je použití germicidní lampy, tyto operace ale provádí vyučující obvykle mezi cvičeními, např. přes noc. 3.1.2 STERILACE MÉDIÍ A LABORATORNÍHO NÁDOBÍ Všechna média používaná v rámci cvičení z mikrobiologie jsou sterilovatelná autoklávováním (120 C, 0,1 MPa, 15 min). Podobně je možné sterilovat většinu skleněného, porcelánového i kovového nádobí a též plastové výrobky, které tyto podmínky vydrží (např. polypropylenové kádinky). Autokláv je vysokotlaké zařízení, které smí obsluhovat jen řádně proškolená osoba. Obsluha autoklávu bude proto pouze předvedena a všechny sterilní pomůcky budete dostávat už připravené. 8

4 KULTIVAČNÍ TECHNIKY Kultivace (pěstování) mikroorganismů představuje základ mikrobiologické práce. Má ale svá specifika: Mikroorganismy obvykle rostou rychle. Protože jsou všude kolem nás, je třeba při práci dbát na sterilitu prostředí, nástrojů i kultivačních médií. Různé mikroorganismy mají rozdílné nároky na svou výživu i podmínky kultivace. Proto je třeba vždy pečlivě zvážit složení kultivačního média, teplotu kultivace, aeraci a další faktory. Kultivace trvá v závislosti na organismu několik dní až několik týdnů. 4.1 MÉDIA Správná volba kultivačního média je základem úspěšné kultivace. Používaná média je možné rozdělit podle několika hledisek: Podle původu lze rozdělit média na přirozená (mléko, krev, listí apod.), syntetická (jejichž složení je přesně definováno a jsou připravena z čistých chemikálií) a polosyntetická (obsahující některé živiny přesně definované a jiné směsné). Podle skupenství dělíme média na kapalná a ztužená. Podle obsahu živin dělíme média na bohatá (všechny živiny jsou v nadbytku) a limitovaná (jedna živina nebo několik živin je nedostatku). Podle selektivity dělíme média na obecná (na nichž roste mnoho skupin mikroorganismů) a selektivní (na kterých roste jen několik skupin mikroorganismů). I když je složení kultivačních médií různé, má každé médium toto obecné složení: Zdroj uhlíku. Nejčastěji se používají sacharidy (glukóza), aminokyseliny, peptidy a lipidy, ale lze použít např. i uhlovodíky a jejich deriváty. Autotrofní mikroorganismy vyžadují zdroj CO 2, pak je obvykle třeba dobrá aerace. Zdroj dusíku. Dusík je základem mnoha nezbytných komponent organismů. Nejobecnější jsou organické zdroje dusíku (např. aminokyseliny), ale většina mikroorganismů je schopná využít i amonné ionty, dusičnany a dusitany. Některé skupiny mikroorganismů jsou schopné fixovat i vzdušný dusík, ty vyžadují dobré provzdušnění. Zdroje dalších minerálních látek. Zejména se jedná o zdroj fosforu (nejčastěji fosforečnany), síry (nejčastěji sírany), biogenních kovů (železa, mědi, zinku atd., obvykle v podobě iontů) a solí (zejména chloridy sodný a draselný). Selektivní činidla, způsobující omezení růstu některých skupin mikroorganismů. Jedná se např. o antibiotika. Speciální látky pro auxotrofy. Některé mikroorganismy ztratily schopnost syntetizovat si všechny své organické látky a ty je jim třeba přidávat do prostředí (tzv. auxotrofové). Nejčastěji se jedná o některé aminokyseliny či vitamíny. Voda. Látky upravující ph, např. pufry. Ztužovadlo u ztužených médií (agar, želatina). Ztužování médií se provádí nejčastěji agarem. Agar je polysacharid (polygalaktóza) izolovaný z mořských řas. Většina mikroorganismů ho neumí rozložit a využít jako živinu. Agar taje při 96 C a tuhne při 40 C, čehož se využívá při ztužování médií, které je možné po sterilaci za tepla rozlít a po vychladnutí ztuhnou. 9

Selektivity médií je možné dosáhnout v zásadě dvěma způsoby. Negativní selektivity se dosahuje přídavkem látek, které inhibují růst některých skupin mikroorganismů (jsou pro ně toxické) a jiných ne. Nejčastěji se používají antibiotika a některá barviva (např. bengálská červeň pro inhibici růstu bakterií). Pozitivní selektivity se dosahuje použitím některé méně obvyklé živiny, kterou umí využít jen omezená skupina mikroorganismů (např. mikroorganismy schopné odbourávat aromatické uhlovodíky je možné odlišit od ostatních kultivací na toluenu jako jediném zdroji uhlíku a energie). 4.2 KULTIVACE MIKROORGANISMŮ Mikroorganismy rostou obvykle několik dní a vyžadují vhodnou teplotu a aeraci (tj. přístup vzduchu; anaerobní mikroorganismy by naopak mít přístup vzduchu neměly). Ztužená média se obvykle kultivují v termostatu s výměnou vzduchu. Misky se kultivují v tzv. zavěšené poloze, tj. agarem nahoru. Důvodem je kondenzace vody, která takto kape pouze na víčko, zatímco v opačném případě by kapala na agar a rozmývala rostoucí kulturu. Kapalná média se obvykle kultivují v termostatované třepačce (vodní nebo vzduchové). Kapalné médium se nejčastěji umisťuje do kónické Erlenmayerovy baňky, popř. do kultivační láhve. Třepání zajišťuje dostatečnou aeraci kultury. Pozor ale na průchodnost zátky. Zátka nesmí být přikryta alobalem (kterým se kryje proti zvlhnutí v průběhu sterilace) a nesmí být ani mokrá, protože přes kapalinu prochází vzduch daleko hůř. 4.3 PŘÍPRAVA AGAROVÝCH MISEK Média se nejčastěji ztužují agarem, obvykle v koncentraci 1-2%. Ztužené médium se nejčastěji připravuje do zkumavek (tzv. šikmý agar) a na misky. Médium se rozlévá do sterilních misek po autoklávování za přiměřené teploty (cca 50-70 C) ve sterilním prostředí (v okolí kahanu nebo v laminárním boxu). Plastové misky (obvykle polystyrénové) jsou dodávány už od výrobce sterilní, skleněné je třeba před tím vysterilovat v autoklávu. Po zatuhnutí se nechají misky kultivovat, aby se odhalily případné kontaminace. Postup: 1. Připravte požadované kapalné kultivační médium a nalijte ho do sterilační láhve ( pyrexky ). 2. Přidejte cca 1-2% agaru, agar se při nízké teplotě nerozpustí ani při intenzivním míchání, nechte ho proto usadit na dně. 3. Sterilujte médium v autoklávu. 4. Po skončení sterilace nechte médiu zchladnout na teplotu cca 70 C. 5. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 6. Připravte si na stůl sterilní misky. 7. Sterilační láhev držte v pravé ruce (vzhledem k teplotě v izolační rukavici), levou rukou lehce odklopte víčko misky a nalijte do misky přiměřenou dávku média tak, aby vznikla vrstva cca 0,5 cm tlustá. Misku poté ihned přiklopte. 8. Po skončení rozlévání lehce ožehněte hrdlo lahve i špunt v plameni (opravdu jen lehce, aby plastové části nechytily nebo se nedeformovaly) a zavřete. 9. Počkejte až agar v miskách zatuhne a dejte je inkubovat do inkubátoru v zavěšené poloze (tj. agarem nahoru). Stejným způsobem můžete rozlévat i médium se zaočkovaným mikroorganismem. Pak bude zajištěn homogenní nárůst v celém objemu misky. Je ale třeba dbát na to, aby agar byl 10

vytemperovaný na přijatelnou teplotu (obvykle 40 C, při nižších teplotách už agar tuhne, vyšší teploty naopak bývají inhibující pro životaschopnost mikroorganismů). 4.4 OČKOVÁNÍ NA PEVNÉ PŮDY K přeočkování mikroorganismu z kapalného nebo pevného média na agarové médium se obvykle používá klička sterilovaná plamenem. Pomůcky: kahan, očkovací klička Postup přeočkování z pevného média: 1. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 2. Připravte si na stůl misky s připraveným agarovým médiem a misky s přeočkovávaným mikroorganismem. 3. Sterilujte očkovací kličku v oxidační části plamene (tj. nad oranžovou redukční částí, cca uprostřed plamene). Klička by se měla viditelně rozpálit. 4. Otevřete původní misku a ochlaďte kličku buď o vnitřní stěnu či víčko (u skleněných misek) nebo o agar v oblasti, kde není viditelný nárůst mikroorganismů. 5. Naberte malé množství kultury na kličku. 6. Zavřete původní misku a otevřete novou. 7. Několika tahy rozetřete mikroorganismus po agaru. 8. Zavřete misku a vysterilujte znovu kličku. 9. Nechte novou misku inkubovat v inkubátoru v zavěšené poloze. Postup přeočkování z kapalného média: 1. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 2. Připravte si na stůl misky s připraveným agarovým médiem a původní kapalnou kulturu. 3. Sterilujte očkovací kličku v oxidační části plamene (tj. nad oranžovou redukční částí, cca uprostřed plamene). Klička by se měla viditelně rozpálit. 4. Levou rukou otevřete baňku s kapalnou kulturou, zátku nepokládejte, ale držte ji stále v ruce. 5. Namočte kličku do kultury, aby se ochladila (měla by slyšitelně zasyčet). 6. Po zchladnutí lehce zamíchejte kličkou v médiu a vytáhněte ji z baňky. 7. Otevřete misku a několika tahy rozetřete mikroorganismus po agaru. 8. Zavřete misku. 9. Zátku i hrdlo baňky lehce ožehněte plamenem (pozor, aby zátka nechytila!) a zavřete. 10. Nechte novou misku inkubovat v inkubátoru v zavěšené poloze. 11

5 JEDNOTLIVÉ LABORATORNÍ ÚLOHY V této kapitole jsou popsány jednotlivé laboratorní úlohy, které se provádí vždy na jednom dvouhodinovém cvičení. U každé úlohy je uvedena teorie a principy práce, potřebná příprava, pomůcky, detailní postup, způsob vyhodnocení výsledků a požadavky na protokoly. V programu je následujících 5 laboratorních cvičení s touto náplní: 1. Zásady BOZP, seznámení se zásadami sterilní práce v mikrobiologické laboratoři. Příprava ředicích fyziologických roztoků, příprava kultivačního média pro potřeby cvičení, příprava zásobních roztoků solí pro kultivaci řas (pro potřeby testů toxicity). 2. Práce s mikroskopem, příprava nativního preparátu (vzorek vody z reálného prostředí stojatá, tekoucí voda), metoda zahuštění vzorků centrifugace a převedení na podložní sklo, práce s počítací komůrkou. 3. Práce s mikroskopem, barvení preparátů Gramova reakce, fixace objektů methylénovou modří, počítání objektů (živé a mrtvé) na rastru počítací komůrky. 4. Kultivační metody na AKE či PCA, ředění reálného vzorku povrchové vody (4 po sobě jdoucí ředění). Aplikace jednotlivých ředění - objemu 1 ml na Petriho misku a zalití agarem, aplikace objemu 0,1 1 ml na vysušené agarové médium, membránová filtrace. Kultivace 2 dny, odečty. 5. Fyzikální a chemické faktory UV záření a jeho působení na misky s kulturou bakterií či kvasinek (různě zakryté, volba doby působené záření). Dichroman draselný působící na kulturu řas či kvasinek klasické testy toxicity, odečty na rastru počítací komůrky. 5.1 1. CVIČENÍ PŘÍPRAVA Cíle: První cvičení je úvodní a klade si následující cíle: Seznámit studenty s bezpečností práce v mikrobiologické laboratoři Seznámit studenty se specifiky mikrobiologické práce, zejména s principy sterilní práce. Příprava sterilních roztoků a médií pro následují laboratorní cvičení. Znalosti: Studenti by si měli přečíst kapitoly 1, 2, 3 a 4.3. Program cvičení: 1. Zásady bezpečnosti práce. Studentům budou vyložený zásady bezpečnosti práce v mikrobiologické laboratoři. Poté podepíší prohlášení, že byli řádně proškoleni a že jejich zdravotní stav nebrání absolvování laboratorních cvičení. 2. Principy sterilní práce. Studentům budou vyloženy a demonstrovány zásady sterilní práce tak, aby byli na následujících cvičeních schopni samostatné práce dle těchto zásad. 3. Zkouška sterility vzduchu. Studenti si stanoví spadovou technikou množství vzdušných mikroorganismů v laboratoři, v digestoři u kahanu a před laboratoří dle návodu uvedeného v kapitole 5.1.1. 4. Příprava živných médií a pufrů. Každý student (resp. skupinka studentů) připraví pro všechny ostatní vybrané médium dle instrukce vyučujících. Složení jednotlivých roztoků je uvedeno v kapitole 6. 12

5. Nalévání agarových misek. Každý student si vyzkouší přípravu sterilních misek ztužených agarem (viz kapitola 4.3). Médium dostanou studenti už připravené, sterilní a rozvařené. Požadavky na protokol: Do protokolu budou zpracovány výsledky stanovení vzdušných mikroorganismů spadovou technikou. 5.1.1 MĚŘENÍ SPADU MIKROORGANISMŮ ZE VZDUCHU K odhadu množství mikroorganismů ve vzduchu můžete použít spadovou metodu. Její princip je jednoduchý, v daném prostředí se nechá na jednom místě po definovaný čas ležet otevřená miska s vhodným kultivačním médiem a po kultivaci se spočítají kolonie. Metoda není nijak přesná, záleží hodně na proudění vzduchu, počasí, prašnosti a dalších faktorech, nicméně dává jistý obraz o možné mikrobiální kontaminaci ze vzduchu. Pomůcky: Miska s agarovým médiem, hodinky. Postup: 1. Vyberte si vhodné prostředí, ve kterém budete měřit spad mikroorganismů. 2. Umístěte na vhodné místo misku s agarem a odklopte ji. 3. Po uplynutí daného času (obvykle 30-60 minut) misku přiklopte a inkubujte v zavěšené poloze 48 hodin. 4. Zaznamenejte do laboratorního deníku místo a čas odběru. Poznámky: Čas můžete volit různě, od několika minut až po hodinu. V prašném prostředí stačí kratší čas, v klidném a čistém prostředí je potřeba delší. Vyhodnocení: Po kultivaci mikroorganismů spočítejte počet kolonií (CFU) na misce. Při znalosti plochy misky (obvykle průměr 9 cm), času expozice a počtu narostlých kolonií vypočítejte rychlost spadu v jednotkách CFU / hod / cm 2. 13

6 POUŽITÁ MÉDIA A ROZTOKY 6.1 KULTIVAČNÍ MÉDIA Všechna tekutá média je možné ztužit agarem o koncentraci 1-2%. 6.1.1 LB (LURIA BROTH) Bohaté médium pro kultivaci bakterií. Trypton Yeast extract NaCl 10 g/l 5 g/l 10 g/l ph se upravuje před autoklávováním na cca 7,2 ± 0,2. 6.1.2 PLATE COUNT AGAR (PCA) Bohaté médium využívané ve ztužené podobě při kultivačních stanoveních heterotrofních mikroorganismů. Trypton Yeast extract Glukóza 5 g/l 2,5 g/l 1 g/l ph se upravuje na 7,0 ± 0,2. 6.1.3 MALT EXTRACT Bohaté médium vhodné pro kultivaci mikroskopických hub. Malt extract 20 g/l ph se upravuje na 7,2 ± 0,2. 6.1.4 ŠKROBOVÝ AGAR Ve ztužené podobě (s přídavkem 10 g/l agaru) se používá pro kultivaci amylolytických bakterií, např. bacilů. Trypton Yeast extract Glukóza Škrob 5 g/l 2,5 g/l 1 g/l 10 g/l ph se upravuje na 7,0 ± 0,2. 6.1.5 MÉDIUM PRO KULTIVACI SLADKOVODNÍCH ŘAS Mírně upraveno podle ČSN EN ISO 8692 a podle chemikálií dostupných na FŽP 14

Roztok 1 Makrosložky živin Látka Koncentrace Navážka na 250 ml NH 4 Cl 1,5 g/l 0,375 g MgCl 2.6H 2 O 1,2 g/l 0,300 g CaCl 2 1,4 g/l 0,350 g MgSO 4.7H 2 O 1,5 g/l 0,375 g KH 2 PO 4 0,16 g/l 0,040 g Roztok 2 Fe-EDTA Látka Koncentrace Navážka na 250 ml FeCl 3.6H 2 O 64 mg/l 0,016 g Na 2 EDTA.2H 2 O 100 mg/l 0,025 g Roztok 3 stopové prvky Zde je odchylka od normy, z roztoku 3 jsou vyjmuty nejméně zastoupené stopové prvky a jsou vyčleněny do samostatného koncentrovanějšího roztoku 5 Látka Koncentrace Navážka na 250 ml H 3 BO 3 185 mg/l 0,0463 g MnCl 2.4H 2 O 415 mg/l 0,1038 g Roztok 4 hydrogenuhličitan Látka Umístění Koncentrace Navážka na 250 ml NaHCO 3 50 g/l 12,5 g Roztok 5 ostatní stopové prvky Odchylka proti normě místo ZnCl 2 je ZnSO 4 Látka Umístění Koncentrace Navážka na 250 ml ZnSO 4 355 mg/l 0,0888 g CoCl 2.6H 2 O 150 mg/l 0,0375 g CuCl 2 7,89 mg/l 0,0020 g Na 2 MoO 4.2H 2 O 700 mg/l 0,1750 g Roztoky by před použitím měly být vysterilizované, roztoky 1,2,3 a 5 je možné autoklávovat, roztok 4 se autoklávovat nesmí (hydrogenuhličitan se rozkládá) a je třeba ho pouze přefiltrovat přes antibakteriální filtr. Do výsledného média se dávkuje: 10 ml roztoku 1 1 ml roztoku 2 1 ml roztoku 3 1 ml roztoku 4 0,01 ml roztoku 5 a doplní se vodou do 1 litru. 6.2 ROZTOKY 6.2.1 FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Chlorid sodný 10 g/l 15

6.2.2 FOSFÁTOVÝ PUFR 0,066 M PH 7 Roztok A: Na 2 HPO 4.12H 2 O 23,637 g/l Roztok B: KH 2 PO 4 8,98 g/l Do 500 ml odměrné baňky se odměří 306 ml roztoku A a dolije se roztokem B po rysku. Jiným poměrem roztoků A a B lze dosáhnout jiného ph. 6.3 BARVIVA 6.3.1 KRYSTALOVÁ VIOLEŤ Roztok A: Krystalová violeť v 96% ethanolu 25 g/l Roztok B: Štavelan amonný ve vodě 10 g/l Smíchá se 20 ml roztoku A a 80 ml roztoku B, zfiltruje se. 6.3.2 SAFRANIN Safranin Po rozpuštění se roztok zfiltruje. 2,5 g/l 6.3.3 METHYLENOVÁ MODŘ Methylenová modř 0,3 g 96% etanol 30 ml Voda 100 ml Barvivo se rozpustí v etanolu, přidá se destilovaná voda a nakonec se zfiltruje. 6.3.4 LUGOLŮV ROZTOK Jód Jodid draselný Voda 1 g 2 g 300 ml 16

7 PŘÍLOHY Vzorový protokol Jméno: Dřevák Patlák Skupina: Ústí n.l. sudý čtvrtek 10:00 Datum práce: 1.11.2007 Cíl práce: Určení buněčné koncentrace kvasinek Saccharomyces cerevisiae, určení podílu živých buněk ve vzorku vitálním barvením. Princip práce: V počítací komůrce se v deseti komůrkách o definovaném objemu spočítá průměrný počet buněk a přepočítá na počet v 1 ml. Methylenová modř obarví jen mrtvé buňky, poměr mezi živými a mrtvými se pak spočítá v 10 vizuálních polích mikroskopu. Výsledky: 1. Počítání kvasinek v počítací komůrce zvětšení 10x10, čtverec 0,04 mm 2, hloubka 0,1 mm Čtverec Počet Počet na ml 1 46 1,2E+07 2 53 1,3E+07 3 72 1,8E+07 4 41 1,0E+07 5 58 1,5E+07 6 35 8,8E+06 7 62 1,6E+07 8 43 1,1E+07 9 42 1,1E+07 10 54 1,4E+07 Průměr. 50,6 1,3E+07 Sm.odchylka. 10,7 2,7E+06 Přepočet buněk ve čtverci na počet v ml probíhal následovně: Objem jedné komůrky je 0,04x0,1 = 0,004 mm 3. V 1 ml je 1000 / 0,004 = 250 000 komůrek. Touto hodnotou je třeba násobit množství buněk v komůrce na počet buněk v 1 ml. 2. Určení podílu mrtvých buněk ve vzorku zvětšení 10x40, obarveno methylenovou modří Zorné pole Živé (světlé) Mrtvé (modré) Podíl mrtvých 1 23 3 11,54% 2 41 5 10,87% 3 9 1 10,00% 4 16 2 11,11% 5 34 2 5,56% 6 27 1 3,57% 7 30 3 9,09% 8 22 1 4,35% 9 5 0 0,00% 10 9 1 10,00% Průměr. 7,6% Sm.odchylka. 3,8% Závěr: V testovaném vzorku bylo 1,3.10 7 ±0,3.10 7 buněk na ml, podíl mrtvých buněk činil 7,6±3,8%. 17