LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Transkript

1 LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ STANOVENÍ SACHARIDŮ METODOU VYSOKOÚČINNÉ CHROMATOGRAFIE VE SPOJENÍ S DETEKTOREM EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING (HPLC-ELSD) 1

2 Základní požadované znalosti pro vstupní test: Garant úlohy: Ing. Aleš Krmela Základní informace o sacharidech a cukerných alkoholech Princip a využití kapalinové chromatografie Princip a využití evaporative light scattering detektoru (ELSD) Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři a protipožární ochrany Náplň úlohy: Příprava vzorků pro HPLC-ELSD Seznámení s HPLC-ELSD instrumentací, měření kalibrace a extraktů vzorků Interpretace naměřených dat Časový snímek cvičení 30 minut Kontrola požadovaných znalostí, diskuse: způsob přípravy vzorků, měření a vyhodnocování naměřených dat 50 minut Příprava jednotlivých vzorků a standardů 120 minut Měření vzorků 30 minut v rámci Seznámení s HPLC-ELSD instrumentací měření vzorků 30 minut Vyhodnocení naměřených dat a diskuse výsledků 10 minut Ukončení úlohy + úklid 2

3 Teoretický úvod Sacharidy Jako sacharidy jsou označovány polyhydroxyaldehydy a polyhydroxyketony, obsahující v molekule tři alifaticky vázané uhlíkové atomy, a sloučeniny tvořící se z nich vzájemnou kondenzací za vzniku acetalových vazeb, tedy látky ze kterých vznikají sacharidy hydrolýzou. Řadíme sem i látky vznikající ze sacharidů chemickými reakcemi, jak je například oxidace či redukce. Rozdělení sacharidů Dle počtu atomů uhlíku v molekule lze sacharidy dělit na: Triosy Tetrosy Hexosy Atd. Sloučeniny obsažené funkční skupiny lze pak dělit sacharidy na aldosy a ketosy. Dle počtu vázaných cukerných jednotek pak lze sacharidy ředit na: Monosacharidy 1 jednotka Oligosacharidy 2-10 jednotek Polysacharidy (glykany) 11 a více jednotek Složené sacharidy (též komplexní neboli konjugované) obsahují i jiné sloučeniny než sacharidy, např. peptidy či lipidy Význam sacharidů Sacharidy slouží především jako zdroj energie pro organismus, spolu s proteiny a lipidy se proto řadí k hlavním živinám. Dále jde o důležitou stavební jednotku buněk, mohou chránit buňku před nepříznivými vnějšími vlivy. Také se jedná o biologicky aktivní látky či strukturní složku řady další biologicky aktivních látek jako jsou glykoproteiny, některé hormony či vitamíny. Cukerné alkoholy Jedná se o alifatické polyhydroxyderiváty vznikající redukcí karbonylové skupiny. Cukerné alkoholy se uplatňují kupříkladu v prevenci různých stresových faktorů a peroxidace lipidů v rostlinných buňkách. Ze zástupců lze jmenovat například D-sorbitol (D-glucitol). Legislativa Obsah a zastoupení sacharidů v potravině může být důležitým ukazatelem její kvality a autenticity. Mezi hodnotící kritéria zakotvená v normě ČSN , která slouží jako referenční příručka pro hodnocení kvality, identity a autenticity jablečných šťáv patří obsah glukosy, fruktosy, jejich poměr, obsah sacharosy a sorbitolu. 3

4 Tabulka I: přehled analytů sledovaných v rámci úlohy HPLC-ELSD Analyt Sumární vzorec Struktura D-Glukosa C6H12O6 D-Fruktosa C6H12O6 Sacharosa C12H22O11 D-Sorbitol C6H14O6 4

5 Návod laboratorní práce Předmětem této úlohy je analýza obsahu monosacharidů glukosy a fruktosy, disacharidu sacharosy a cukerného alkoholu sorbitolu ve vzorcích nápojů (jablečná šťáva či jiný vzorek) a pochutin a srovnání naměřených výsledků s normou ČSN v případě jablečných šťáv či jiným legislativním dokumentem v závislosti na typu vzorku. Princip metody: Vlastní stanovení sacharidů v kapalných vzorcích a extraktech pevných vzorků se provádí s využitím techniky chromatografie s detektorem typu evaporative light scattering (HPLC- ELSD). ELSD je detektor vhodný pro netěkavé látky neobsahující ve své molekule chromofor ani fluorofor. Tento detektor měří intenzitu rozptylu světla ze zdroje na částečkách analytů unášených nosným plynem. Odezva je přímo úměrná množství analytu v nosném plynu. Úkoly: 1. Příprava testovaných vzorků k analýze, příprava mobilní fáze 2. Měření vzorků metodou HPLC-ELSD 3. Vyhodnocení naměřených dat Chemikálie a standardy: - Fruktosa, > 99% (Sigma-Aldrich, Německo) - Glukosa, > 99% (Sigma-Aldrich, Německo) - Sacharosa, > 99% (Sigma-Aldrich, Německo) - Acetonitril (Sigma-Aldrich, USA) - Dimethylamin (DMA), čistota > 99,5% (Sigma-Aldrich, USA) - Deionizovaná voda (Millipore, Německo) Použité přístroje: - Kapalinový chromatograf Waters Acquity UPLC, Waters (USA) - Evaporative light scattering detektor, Waters (USA) Tabulka II: Parametry metody kapalinové chromatografie (UPLC ELSD) Přístroj Kolona Mobilní fáze Gradientová eluce analytů ACQUITY UPLC, Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (100 x 2,1 mm; 1,7 µm), Waters A 80% acetonitril s 0,2 % DMA B 30% acetonitril s 0,2 % DMA Čas (min) Průtok (ml/min) A (%) B (%) Křivka 0 0, ,

6 5,01 0, , Doba analýzy 1 vzorku 10 min Objem nástřiku 2 µl Teplota kolony 40 C Teplota autosampleru 10 C Tabulka III: Parametry metody hmotnostní spektrometrie (UPLC ELSD) Přístroj Teplota driftovací trubice 50 C Nastavení nebulizeru Tlak dusíku Evaporative Light Scattering Detector, Waters Cooling (12 C) 40 psi Gain 500 Pracovní postup: Příprava kalibračních standardů Nejprve je nutné připravit zásobní roztoky fruktosy, glukosy, sacharosy a sorbitolu, každý o koncentraci 10 mg/ml v deionizované vodě v 10 ml odměrných baňkách. Z těchto zásobních roztoků se nejdříve připraví samostatné roztoky každého analytu o koncentraci 0,5 mg.ml -1 pro pozdější identifikaci analytů na základě retenčního času. Ze zásobních roztoků bude následně připraven směsný standard o koncentraci 1 mg/ml do 10 ml odměrné baňky. Zde je již třeba korigovat obsah vody a organického rozpouštědla. Z důvodu lepšího tvaru a intenzity píků při analýze pomocí HPLC-ELSD, je třeba analyzovat roztoky o výsledném složení acetonitril/voda 1:1 (v/v). Z tohoto důvodu je třeba při přípravě směsného standardu nejprve k pipetovanému množství standardů v deionizované vodě přidat ekvivalentní množství čistého acetonitrilu a následně doplnit 50% acetonitrilem po rysku. Z připraveného směsného standardu o koncentraci 1 mg/ml bude dále připravena řada kalibračních bodů o koncentracích: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mg.ml -1 dle Tabulky IV či dle pokynů asistenta. Tabulka IV: Příprava kalibračních standardů Pipetované množství Přídavek 50% Kalibrační bod Objem směsného standardu acetonitrilu (mg.l -1 ) (ml) (ml) (ml) 0,6 1 0,6 0,4 0,5 1 0,5 0,5 0,4 1 0,4 0,6 0,3 1 0,3 0,7 0,2 1 0,2 0,8 0,1 1 0,1 0,9 0,05 1 0,05 0,95 6

7 Příprava vzorku I u přípravy vzorku je nezbytné korigovat obsah acetonitrilu pro výsledné složení acetonitril/voda 1/1 (v/v). V případě analýzy vzorků obsahujících kupříkladu zbytky dužniny, intenzivní zákal či jinou formu pevných částic, je třeba vzorky nejdříve odstředit na odstředivce při rpm po dobu 5 minut. V případě kapalného vzorku bez pevných částic či matrice je do 10 ml odměrné baňky odebráno 5 ml vzorku a obsah je doplněn po rysku čistým acetonitrilem. Výsledný roztok je třeba přefiltrovat přes 0,22 μm stříkačkový mikrofiltr. Takto upravený vzorek je za účelem získání roztoků s koncentrací analytů vhodnou pro kalibrační rozsah nadále ředěn směsí acetonitril/voda (1/1; v/v) dle pokynů asistenta do skleněných šroubovacích vialek. (V případě přípravy pevných vzorků se řiďte pro extrakci pokyny asistenta) Vlastní analýza, identifikace a kvantifikace analytů Za účelem zjištění retenčního času každého analytu jsou nejprve změřeny samostatné roztoky analytů o koncentraci 0,5 mg.ml -1. Následně jsou analyty ve směsných kalibračních standardech a vzorcích identifikovány právě na základě shody retenčních časů se zásobními roztoky. Pro kvantitativní analýzu je sestavena kalibrační závislost koncentrace na ploše píku pro každý analyt, vlastní kvantitativní vyhodnocení se pak provádí odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky a přepočtem na původní vzorek. Výpočet obsahu analytů ve vzorku a vyjádření výsledku Během zpracování dat (výpočtů) je kontrolována linearita kalibrační křivky a rozptyl pomocí regresního koeficientu (R 2 ). V případě nelineárního chování sledovaných analytů je nutno buď vybrat užší kalibrační rozsah, zvolit jiný typ spojnice trendu či provést log/log transformaci naměřených dat. Získané hodnoty koncentrací analytů musejí být přepočteny na původní vzorek dle ředění a postupu přípravy. Po vyhodnocení naměřených dat je třeba provést srovnání získaných výsledků s deklarací složení na obalu výrobku. Pro správné vyhodnocení naměřených výsledků je třeba srovnat výsledky nejprve se složením uvedeným na etiketě výrobku a spočítat procento odchylky. Následně je nezbytné srovnat výsledky s parametry obsahu fruktosy, glukosy, sacharosy, sorbitolu a poměru glukosa/fruktosa a normou ČSN Analýza celkového obsahu sacharidů pomocí přenosného refraktometru Přenosný refraktometr slouží k rychlé kontrole celkového obsahu sacharidů. Přístroj slouží k vyjádření cukernatosti v hodnotách Brix, které představují hmotnostní procenta. Stanovenou hodnotu celkového obsahu sacharidů je opět nutno srovnat s údaji na etiketě a spočíst procento odchylky. 7

8 Výstup práce Vyhodnocení naměřených dat Výpočet obsahu fruktosy, glukosy, sacharosy a sorbitolu Srovnání naměřených hodnot s normou ČSN Sepsání protokolu Zkušební otázky: 1. Co jsou to sacharidy? 2. Rozdělte sacharidy do skupin dle počtu cukerných jednotek a uveďte přibližný poet sacharidických jednotek 3. Popište princip kapalinové chromatografie 4. Jaký je rozdíl mezi gradientovou a isokratickou elucí? 5. Jak se liší chromatografie na normální fázi a na reverzní fázi? 6. Vysvětlete princip a využití evaporative light scattering detektoru 7. Co jsou to Brix, co vyjadřují? 8