VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE MONOSACHARIDŮ A OLIGOSACHARIDŮ. dělení borátových komplexů cukrů na měničích aniontů

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE MONOSACHARIDŮ A OLIGOSACHARIDŮ. dělení borátových komplexů cukrů na měničích aniontů"

Tereza Šimková
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 VYSKÚČIÁ KAPALIVÁ CHRMATGRAFIE MSACHARIDŮ A LIGSACHARIDŮ Separační systémy dělení borátových komplexů cukrů na měničích aniontů ligandová interakce cukrů s kovovým iontem fixovaným na iontoměniči (chromatografie na měničích kationtů) rozdělovací chromatografie na stacionárních fázích s vázanými aminoskupinami chromatografie cukrů na měničích aniontů (HPAEC) použití pulsní amperometrické detekce (PAD) chromatografie v systému obrácených fází (RP-HPLC) vyžaduje předkolonovou derivatizaci Možnosti detekce refraktometrická detekce (RID) evaporative light scattering detector (ELSD) spektrofotometrická detekce při λ=190 nm spektrofotometrická detekce ve viditelné oblasti po reakci s orcinolem... (pokolonová derivatizace) spektrofotometrická nebo fluorimetrická detekce derivátů sacharidů (např. dansylhydrazony) elektrochemická (pulsní amperometrická) detekce (hmotnostně spektrometrická detekce) 20

2 Chromatografie borátových komplexů cukrů na měničích aniontů jde o nejstarší metodu v kapalinové kolonové chromatografii cukrů. Komplexy s kys. boritou jsou silnějšími kyselinami, než výchozí cukry. Komplexy vznikají v borátovém pufru, který slouží jako mobilní fáze. Zpravidla se používá stupňovitá eluce několika pufry o rostoucí hodnotě ph (7-9). Detekce : reakce s orcinolem a H 2 S 4, měření A při 420 nm Dělení borátových komplexů cukrů na DEAE Spheronu rozměry kolony 49 0,6 cm, průtok 50 ml/h, teplota 60 C, A 0,03 M boritan, ph 7,5 B 0,1 M boritan ph 8,5 C 0,25M boritan, ph 8,88 21

3 Chromatografie cukrů na měničích kationtů stac. fáze nejčastěji silně kyselý katex v a +, Ag +, Ca 2+, Pb 2+ cyklu (Ag +, Ca 2+ resp. Pb 2+ kolony vyžadují odstranění iontů ze vzorku zařazení předkolon s katexem a anexem) mobilní fáze: voda detekce: RID (mez detekce cca 0,5 µg), UV ( nm) Voltage [mv] Stachyosa Rafinosa Sacharosa Glukosa Galaktosa 20 Fruktosa Time [min.] Separace mono- a oligosacharidů na katexu v sodném cyklu kolona 8x250 mm stion LG KS 0800 a + (10 µm), teplota kolony 80 C mobilní fáze: voda, průtok 0,4 ml/min, nástřik 20 µl, konc. sacharidů 500 µg/ml detekce RID Retenční časy na katexech v různém cyklu Látka Retenční čas (min) a + H + Ca 2+ Pb 2+ stachyosa 8,2 9,1 10,5 13,0 rafinosa 8,8 9,8 10,9 13,8 maltotriosa 9,1 9,3 11,0 14,7 sacharosa 10,0 hydrolýza 11,7 14,7 maltosa 10,2 10,0 11,9 15,5 glukosa 12,8 11,9 13,8 17,3 galaktosa 13,8 12,5 15,4 19,9 fruktosa 14,2 12,7 18,1 24,7 ethanol 18,2 26,2 21,2 21,9 22

4 Chromatografie cukrů na stacionárních fázích s vázanými aminoskupinami stac. fáze nejčastěji silikagel s aminopropylovými skupinami mobilní fáze acetonitril voda detekce RID, mez detekce 5 µg Voltage [mv] Fruktosa 10 Glukosa 5 Maltosa Laktosa Time [min.] Voltage [mv] Fruktosa Glukosa Maltosa Laktosa 5 0 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 Time [min.] Voltage [mv] 1,75 1,50 1,25 Sacharosa 1,00 Stachyosa Rafinosa Verbaskosa 0,75 0, Time [min.] Chromatografie cukrů na aminofázi kolona 250x4 mm Separon SGX H 2, 5µm mobilní fáze CH 3 C-H 2 (poměr 1-80:20, 2-70:30, 3-65:35), 1,0 ml/min nástřik 100 µl, detekce RID 23

5 Chromatografie monosacharidů, disacharidů a trisacharidů kolona LiChroCART 250 4,6 mm, stac. fáze LiChrosorb H 2, 5µm předkolona 4 4 mm, stejná náplň mobilní fáze CH 3 C-H 2 (75:25) detekce UV 190 nm pořadí eluovaných složek: rhamnosa (50 µg), xylosa (50 µg), fruktosa (25 µg), glukosa (100 µg), galaktosa (50 µg), sacharosa (100 µg), maltosa (100 µg), trehalosa (130 µg), laktosa (130 µg), melibiosa (130 µg), rafinosa (130 µg) 24

6 Chromatografie cukrů a alditolů na měničích aniontů v silně alkalickém prostředí stac.fáze: speciální iontoměniče (výrobce Dionex) mobilní fáze ah nebo KH (0,001-0,5 mol/l), případně s přídavkem octanu nebo kationtů kovů alk. zemin (Sr 2+, Ba 2+ ) Interakce se stacionární fází Cukry se chovají jako velmi slabé kyseliny, disociací protonu z hydroxylových skupin vznikají anionty, které jsou poutány kladně nabitými skupinami na povrchu ionexu. Z vazby na stacionární fázi cukry vymývá roztok hydroxidu. ejvětší aciditu vykazuje poloacetálový hydroxyl (hodnoty pk a cca 12-12,5), u glukosy klesá acidita dalších hydroxylů v řadě 2-H > 6-H > 3-H > 4-H Příklad: dělení monosacharidů Cukr pk a Galaktosa 12,39 Glukosa 12,35 Xylosa 12,29 Mannosa 12,08 ahoře: chromatogram cukrů CarboPac PA1 (250 4,6 mm) mobilní fáze 1 mm ah + 0,03mM aac Dole: vliv složení mobilní fáze retenční časy cukrů A: voda B: 50 mm ah + 1,5 mm aac 25

7 Detekce pulsní amperometrické měření (PAD) na Au elektrodě v cyklech o délce cca 1s: 1. krok: vzorkování proudu (měření), potenciál cca +50 mv, délka ms 2. krok: čištění elektrody, potenciál +600 až +800 mv, délka 200 ms 3. krok: čištění elektrody, potenciál, 150 až 300 mv, délka ms (4. krok: stabilizace elektrody při detekčním potenciálu, 200 ms) Mez detekce při použití PAD: cca 3-10 ng Separace alditolů, mono- a disacharidů metodou HPAEC-PAD Kolona CarboPac MA1 (250x4 mm), předkolona CarboPac MA1 (50x4 mm) Teplota kolony 29 C Mobilní fáze A: 1M ah, B: voda Gradient: start: 30 % A, 40. min: 45% A, 60. min: 45%A, 80. min: 80% A min: 30 % A Průtok 0,4 ml/min, nástřik 10 µl 26

8 Vliv přídavku Ba 2+ (Sr 2+ ) do mobilní fáze na separaci cukrů Cukr Kapacitní poměr 100 mm +1 mm k ah Ba 2+ L-rhamnosa 1,39 1,49 +0,1 D-arabinosa 1,87 2,04 +0,17 D-glukosa 2,52 2,75 +0,23 D-fruktosa 2,99 3,25 +0,26 D-ribosa 3,48 3,56 +0,08 D-allosa 3,61 3,54-0,07 D-talosa 5,51 5,4-0,11 Laktosa 5,19 5,85 +0,66 Cellobiosa 8,65 9,82 +1,17 Isokratická eluce, t M = 1,36 min Analýza dietního třešňového Analýza mandarinkové šťávy džemu ředění vzorku 1:1000 Kolona CarboPac MA1, 8,5 µm (250x4 mm) a předkolona (5x4 mm) Mobilní fáze 0,58M ah+2 mm Ba(CH 3 C) 2, průtok 0,4 ml/min ástřik 10µl G glukosa, F fruktosa, Su sacharosa, S sorbitol(glucitol), M mannitol, mi myo-inositol 27

9 Kapalinová chromatografie cukrů v systému obrácených fází stac. fáze: oktadecylovaný nebo oktylovaný silikagel mobilní fáze: acetonitril voda Podmínka použití RP-HPLC: předkolonová derivatizace cukrů zajistí částečně hydrofobní charakter derivátů umožní detekci derivátů jednotlivých cukrů na základě absorpce v UV/VIS resp. fluorescence Derivatizační reakce: např. zavedení dansylové nebo dabsylové skupiny do molekuly cukru reakcí s příslušným hydrazinem Reakce s dansylhydrazinem a dabsylhydrazinem: R H + H 2 H S (CH 3 ) 2 - H 2 R H H S (CH 3 ) 2 R H H S (CH 3 ) 2 dansylhydrazon R CH + (CH 3 ) 2 S 2 H H 2 - H 2 (CH 3 ) 2 S 2 H CH R dabsylhydrazon 28

10 Detekce derivátů: dansylhydrazony měření absorbance při 254 nm (detekční limit 1-8 nmol) fluorescence λ ex = 240 nm, λ em = nm detekční limit 10 pmol ( 2 ng) dabsylhydrazony měření absorbance při 425 nm, detekční limit 10 pmol ( 2 ng) Příklad: HPLC dabsylderivátů monosacharidů Kolona ova-pak C 18 (150x3,9 mm) 4 µm Mobilní fáze A CH 3 C-H 2 (22:78), B CH 3 C, konkávní gradient 10-85% B do 45. min, průtok 1,2 ml/min 29

11 PLYVÁ CHRMATGRAFIE MSACHARIDŮ A LIGSACHARIDŮ Před stanovením plynovou chromatografií musí být cukry převedeny na těkavé deriváty. Možnosti derivatizace cukrů 1) přímá silylace sacharidů náhrada vodíků všech hydroxy-skupin trimethylsilylovými skupinami Si(CH 3. Reakce se uskuteční záhřevem suchého vzorku s hexamethyldisilazanem a trimethylchlorsilanem. Jednotlivé strukturní formy cukru (acyklická forma, anomery furanos a pyranos) poskytují různé deriváty jeden cukr pět různých derivátů nepřehledný chromatogram s množstvím částečně separovaných píků. 2) dvoustupňová derivatizace příprava oximů nebo methyloximů (jen redukující cukry): reakce s hydroxylamin hydrochloridem nebo methoxylamin hydrochloridem v pyridinu silylace nebo acylace oximů nebo methyloximů resp. původních neredukujících cukrů CH CH R CH R H 2 R (CH 3 SiHSi(CH 3 CHSi(CH 3 CHSi(CH 3 - H 2 (CH 3 SiCl CHSi(CH 3 CHSi(CH 3 H H Si(CH 3 30

12 Acylaci lze uskutečnit acetanhydridem nebo trifluoracetanhydridem (velmi těkavé a stabilní deriváty). Při acylaci oximů (nikoli methyloximů) aldos dochází účinkem anhydridu kyseliny k dehydrataci a oximová skupina se mění na nitrilovou (oximy ketos této reakci nepodléhají): CH CH H C H 2 H (CH 3 C) 2 CHAc CHAc - H 2 CHAc CHAc H H Ac Ac = C CH 3 3) dvoustupňová derivatizace redukce cukrů na alditoly tetrahydridoboritanem sodným acetylace alditolů acetanhydridem v pyridinu nebo směsí acetanhydridu a octanu sodného CH H Ac CHAc abh 4 (CH 3 C) 2 CHAc CHAc CHAc H H Ac evýhody: nelze stanovit cukry i alditoly současně, aldosy a ketosy současně; ketosy tvoří ekvimolární směs dvou alditolů (z fruktosy vzniká glucitol a mannitol produkty redukce glukosy a mannosy) 31

13 Podmínky GC stanovení cukrů kolony: většinou kapilární, polarita se řídí druhem dělených derivátů cukrů detektory: FID, MS Příklad: Analýza monosacharidů ve formě aldonitrilacetátů: kolona DB-Wax Carbowax 30 m teplotní program: 180 C až 210 C nárůst 2 C/min, prodleva při 210 C detekce FID E erythritol 1 rhamnosa 2 arabinosa 3 xylosa 4 mannosa 5 galaktosa 6 glukosa Srovnání vlastností HPLC a GC cukrů HPLC snadnější příprava vzorku rychlejší (kratší) analýza vhodná i pro vyšší oligosacharidy většinou lepší správnost GC nutná derivatizace vyšší separační účinnost (možné dělení anomerů) většinou stanovení mono- až trisacharidů vyšší citlivost 32

Podobné dokumenty

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení STANVENÍ AMINKYSELINVÉH SLŽENÍ BÍLKVIN Důvody pro stanovení AK složení určení nutriční hodnoty potraviny, suroviny (esenciální vs. neesenciální AK) charakterizace určité bílkovinné frakce nebo konkrétní