Vliv chemických desinfekčních metod na bakteriální biofilm

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Vliv chemických desinfekčních metod na bakteriální biofilm Bakalářská práce Markéta Dopitová VEDOUCÍ PRÁCE: doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D. BRNO

2 Bibliografický záznam Autor: Markéta Dopitová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Vliv chemických desinfekčních metod na bakteriální biofilm Studijní program: Biologie Studijní obor: Obecná biologie, zaměření Mikrobiologie Vedoucí práce: doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran 57 Klíčová slova biofilm, dezinfekce, rezistence, metody, antimikrobiální látky 2

3 Bibliografický záznam Author: Markéta Dopitová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Effect of disinfectants on bacterial biofilm Degree Programme: Biology Field of Study: General Biology, specialization Microbiology Supervisor: doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D. Academic Year: 2011/2012 Number of Pages: 57 Keywords: biofilm, disinfection, resistance, methods, antimicrobials 3

4 Abstrakt Tato bakalářské práce se zaměřuje na problematiku rezistence bakterií v biofilmu vůči dezinfekčním látkám. Tvorba biofilmu je přirozeným způsobem života bakterií. Mikrobiální buňky vyskytující se v biofilmu vykazují vlastnosti odlišné od buněk planktonických. Jednou z nejpodstatnějších vlastností je zvýšená rezistence vůči antimikrobním látkám, která je důsledkem kombinace několika mechanismů. Vzhledem k tomu, že dezinfekční postupy hrají důležitou roli v mnoha oblastech lidské činnosti, je třeba jejich účinnost opakovaně ověřovat. Pro hodnocení účinnosti antimikrobních látek na mikroby v biofilmu je však třeba využít jiných metod, než jsou dosud používány v běžné praxi. Abstract This theses aims at problems of bacterial biofilm resistace to disinfectants. Biofilm is natural way of life for bacteria. Biofilm bacterial cell`s characteristics are different from planktonic cells. Higher resistance to antimicrobials is one of the most important characteristics. This resistance is caused by combination of several mechanisms. Due to importance of disinfection procedures is necessary to control the efficacy of disinfectants. But different methods have to be used for disinfection efficacy testing against biofilm bacteria than the commonly used suspension methods. 4

5 5

6 6

7 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu bakalářské práce doc. MUDr. Filipu Růžičkovi, Ph.D. za cenné rady, připomínky a věnovaný čas. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány Brno 14.května jméno a příjmení 7

8 1. Úvod a cíle práce Biofilm Bakteriální biofilm Struktura biofilmu Quorum sensing (QS) Formování biofilmu Dezinfekce Přehled dezinfekčních látek používaných ve zdravotnictví Testování citlivosti mikrobů k antimikrobním látkám zejména v rutinní praxi a související legislativa Kvalitativní standardní suspenzní metoda Kvantitativní suspezní metoda Suspenzní mikrometoda Metoda stanovení (přetrvávajícího) bakteriostatického působení chemických látek Stanovení bakteriostatického účinku látek na mikroby fixované na nosičích Rezistence bakteriálních buněk v biofilmu k antimikrobním látkám Příčiny a mechanismy rezistence mikrobů v biofilmu Vliv extracelulární matrix Fenotypové adaptace buněk Přenos genů a mutace Ochrana ve vícedruhovém biofilmu Metody studia účinnosti antimikrobních látek na buňky v biofilmu Kultivace biofilmu in vitro Statické metody kultivace Kultivace ve zkumavkách Kultivace v mikrotitračních destičkách Kultivace na membránovém filtru Dynamické metody kultivace Kultivace na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky Kultivace v průtokové komůrce Kapkový reaktor ( drip flow reactor ) Rotační diskový reaktor Rotační válcový reaktor ( rotating annular reactor ) CDC reaktor Hodnocení citlivosti biofilmu k dezinfekčním látkám Kultivační plotnová metoda stanovení počtu životaschopných buněk Metody využívající barvení Optické metody detekce metabolicky aktivních buněk Měření vodivosti živného média Kalorimetrie Kvantitativní PCR Účinnost dezinfekčních látek na bakteriální buňky v biofilmu a porovnání s planktonickými buňkami Látky působící v závislosti na ph - alkálie a kyseliny Kyseliny Zásady Látky se silnými oxidačními účinky

9 Peroxid vodíku Kyselina peroctová (PAA) Ozon Antimikrobní látky obsahující halogeny Chlornan sodný Monochloramin Jodovaný povidon Sloučeniny kovů Stříbro Měď Alkoholy Etanol Aldehydy Glutaraldehyd Cyklické dezinfekční sloučeniny Chlorhexidin Triclosan Kvartetní amoniové sloučeniny (QAC) Závěr Seznam literatury

10 1. Úvod a cíle práce Téma mikrobiálních biofilmů je v současné době stále velmi aktuální. Poznání, že existence ve společenství biofilmu je pro bakterie přirozeným způsobem života, vedlo vědce k přehodnocení přístupu používaného už od počátků mikrobiologie, kdy byly bakterie zkoumány v tekutých médiích, na pevných půdách, v podobě čistých kultur (Nikolaev a Plakunov, 2007). Tento tradiční přístup může být značně problematický, pokud se získané závěry aplikují do praxe Mikrobiální biofilmy ovlivňují lidskou společnost v mnoha ohledech. Jednak jsou přirozenou součástí ekosystému, tudíž hrají významnou roli v množství přírodních procesů. Na člověka mohou mít příznivý vliv v podobě bariér na povrchu těla a sliznicích, například kožní nebo střevní mikroflóra. Značný význam má také využití biofilmů při bioremediacích. Velká pozornost je však věnována negativním důsledkům přítomnosti mikrobů v podobě biofilmu. Problém představují pro některá průmyslová odvětví, kde mohou nárůsty biofilmu narušovat proudění kapalin, snižovat učinnost tepelného přenosu nebo působit korozi povrchů. Zvýšená rezistence mikrobů v biofilmu v porovnání s těmi v planktonické podobě zvyšuje riziko kontaminace, především v oblasti potravinářského nebo biotechnologického průmyslu a zdravotnictví, neboť běžně používané dezinfekční postupy nejsou dostatečně účinné. Infekce způsobené mikroby v podobě biofilmu jsou obvykle velmi obtížně léčitelné, prodlužuje se jak doba léčby tak náklady. S těmito infekcemi je spojená také zvýšená mortalita. S rozvojem možností medicíny souvisí zvyšování počtu pacientů se sníženými funkcemi imunitního systému, pro tyto osoby představují biofilmové infekce značné riziko. Objevují se také složitější lékařské nástroje, obsahující například optické součásti, jejichž dekontaminace je problematická (Števkovičová 2007). Se stále častějšími případy selhání antibiotické léčby a infekcí způsobených multirezistentními kmeny mikrobů, vzrůstá důležitost předcházení infekcím pomocí dezinfekčních. postupů (Assadian 2007). Cílem této práce je formou literární rešerše zpracovat přehled dezinfekčních látek využitelných při eradikaci bakteriálního biofilmu, porovnat účinnost těchto postupů na mikroorganizmy v biofilmu a v planktonické formě. Popsat mechanismy vedoucí ke zvýšené rezistenci mikrobů v biofilmu. Důraz je kladen rovněž na metody využitelné k hodnocení účinnosti dezinfekčních látek jednak vůči planktonickým formám mikroorganizmů, ale především vůči organismům v biofilmu. 10

11 2. Biofilm 2.1. Bakteriální biofilm Bakterie byly tradičně vnímány jako nezávislé jednobuněčné životní formy. V podobě čisté kultury planktonicky rostoucích buněk v tekutém médiu jsou také často studovány. Přestože je takový způsob života bakteriálních buněk možný, v přírodě je spíše vyjímečný (Davey a O`Toole 2000). Předpokládá se, že v přirozeném prostředí se % mikroorganismů vyskytuje ve formě biofilmu (Nikolaev a Plakunov, 2007). Biofilm je možné definovat jako seskupení buněk obklopených extracelulární matrix, vyskytující se na rozhraní prostředí, přisedlé k substrátu nebo k jiným buňkám. Buňky v biofilmu vykazují fenotyp odlišný od planktonických forem (Donlan a Costerton 2002, Davey a O`Toole 2000). Nejedná se pouze o slizovitou vrstvu, v níž jsou zachyceny buňky, ale o provázané, komunikující a spolupracující společenství, ať už jednodruhové nebo složené z více druhů mikroorganismů (Davey a O`Toole 2000) Struktura biofilmu Objem biofilmu je tvořen z přibližně 15 % buněk a 85 % extracelulární marix. Buňky vytváří mikrokolonie, obklopené extracelulární matrix a propojené sítí kanálků (Donlan a Costerton 2002). Proudění kapaliny uvnitř kanálků umožňuje efektivní cirkulaci živin, metabolitů a metabolickou spolupráci mezi buňkami. Výslednou strukturu ovlivňují faktory prostředí i biologické vlastnosti zúčastněných mikroorganismů (Davey a O`Toole 2000). Vysoce hydratovaná extracelulární polymerní matrix představuje hlavní část objemu biofilmu. Je tvořena především polysacharidy, dále může obsahovat některé kyseliny nebo malé množství proteinů. Součástí matrix může být i nebuněčný materiál z prostředí, minerální krystaly, produkty koroze nebo krevní komponenty (Donlan 2002) Quorum sensing (QS) U mikrobiálních buněk biofilmu byl popsán způsob mezibuněčné komunikace související s buněčnou hustotou. Tento jev, nazývaný,,quorum sensing and response, je založen na produkci malých organických molekul podobných hormonům, jejichž koncentrace je závislá na množství buněk. U gramnegativních bakterií se jedná o acetyllaktony homoserinu u grampozitivních bakterií o látky proteinové povahy. Bylo prokázáno, že v případě absence produkce těchto molekul u mutantních kmenů byl vytvořený biofilm tenký s plně nevyvinutou strukturou. Schopnost QS umožňuje bakteriím 11

12 vnímat informace z okolního prostředí a přizpůsobovat se pomocí řízení exprese genů. Procesy jako konjugace, sporulace, produkce antibiotik, symbióza, formování biofilmu nebo produkce virulentních faktorů jsou řízeny prostřednictvím QS (Lazar 2011) Formování biofilmu Formování biofilmu je možné rozdělit do několika fází, jak znázorňuje Obr. 1. Tento proces je ovlivňován mnoha faktory. Je nutné brát v úvahu vlastnosti povrchu jako je jeho hydrofilita nebo strukturovanost. Mikroorganismy se obecně snáze přichycují k hydrofobním materiálům a materiálům s drsným povrchem. Dalším z faktorů je chemická modifikace povrchu molekulami z okolního živného média. Podstatné jsou i vlastnosti samotného živného média v okolí povrchu, hydrodynamické vlastnosti, dostupnost živin, teplota, ph a koncentrace iontů (Donlan 2002). Účinek těchto faktorů se však může u jednotlivých organismů lišit. Například některé mikroorganismy tvoří biofilm pouze při dostatku živin, jiné vyžadují pro tvorbu biofilmu nutričně chudá média (O`Toole a kol. 2000, Davey a O`Toole 2000). Adhezi významně ovlivňují také vlastnosti buněčného povrchu, hydrofobicita, přítomnost fimbrií, bičíků, přítomnost povrchových polysacharidů a proteinů nebo produkce extracelulárních polymerních látek (Donlan 2002). Kapalné médium PK SK Pevný povrch Obr.1. Fáze formování biofilmu na rozhraní pevného povrchu a kapaliny: (1) vytvoření vrstvy organických molekul na rozhraní dvou prostředí (znázorněno tečkami); (2) Reverzibilní adheze primárních kolonizátorů (PK); (3) přechod k ireverzibilní adhezi, tvorba mikrokolonií a počátek tvorby extracelulární polymerní matrix; (4) tvorba prostorové struktury, extracelulární polymerní matrix (EPM), množení buněk; (5) přichycení sekundárních kolonizátorů (SK) k primárnímu biofilmu, další rozvoj trojrozměrné struktury; (6) zralý biofilm se strukturou kanálků (Ch), otvorů a dutin, tvořený fyziologicky heterogenní populací mikroorganismů; (7) buňky opouštějící strukturu biofilmu. (Upraveno dle Nikolaev a Plakunov 2007) 12

13 3. Dezinfekce Pod pojmem dezinfekce se rozumí soubor opatření, které vedou ke zničení nebo usmrcení patogenních případně potenciálně patogenních mikroorganismů na neživých površích, v prostředí nebo na neporušené kůži. Dezinfekční postupy mohou být fyzikální, chemické nebo kombinované. Cílem těchto postupů je zabránit přenosu nákazy (Melicharčíková 1998). Podle vztahu ke konkrétní epidemiologické situalci lze dezinfekci rozdělit na ochrannou a ohniskovou. Ochranná neboli profylaktická dezinfekce nemá vztah ke konkrétnímu ohnisku nákazy a je součástí komplexních hygienických opatření. Ohnisková neboli represivní dezinfekce je zaměřena na zneškodňování patogenních mikrobů v ohnisku nákazy a přerušení dalšího šíření infekce (Melicharčíková 1998). Pro zdravotnické prostředky, které nemohou být dostupnými metodami sterilizovány, je dle Přílohy č. 3 k vyhlášce 195/2005 Sb. určen vyšší stupeň dezinfekce (Vyhláška 195/2005 Sb). Vyšší stupeň dezinfekce, dříve znám také jako chemická sterilizace v roztocích, je proces zaručující usmrcení většiny mikroorganismů, s vyjímkou některých vysoce odolných vývojových stádií. Využívá se například při dekontaminaci optických přístrojů (Melicharčíková 1998). Chemické dezinfekční látky patří do kategorie biocidů, tedy látek zpomalujících nebo zastavujících růst nežádoucích organizmů. Dezinfekční látky musí splňovat určitá kritéria, mezi něž patří účinnost na buněčné i nebuněčné mikroorganismy v nízké koncentraci a krátkém expozičním čase, bezpečnost pro materiál dezinfikovaných předmětů, personál i pacienty a rovněž pro životní prostředí (Števkovičová 2007). Účinnost biocidních látek je ovlivňována různými faktory. Především koncentrací biocidu, dobou působení, ph, teplotou, přítomností látek narušujících účinnost i vlastnostmi samotných mikroorganismů (Russel 2003). Odolnost mikrobů se liší i v rámci jedné populace, což může být dáno jak geneticky, tak růstovou fází buněk (Melicharčíková 1998) Přehled dezinfekčních látek používaných ve zdravotnictví Hydroxidy a jiné alkálie jsou účinné v závislosti na koncentraci hydroxidových iontů. Účinek není podstatně ovlivňován přítomností organických látek, a proto jsou často přidávány pro zvýšení účinnosti k jiným dezinfekčním roztokům (Melicharčíková 1998). 13

14 Účinek kyselin a jejich derivátů je založen na působení vodíkových iontů, aniontů nebo celých molekul, povrchové aktivitě, oxidačních nebo dehydratačních schopnostech. Použití anorganických kyselin je značně omezeno vzhledem k jejich korozivním a dráždivým účinkům (Melicharčíková 1998). Látky s oxidačním účinkem patří mezi velmi účinné dezinfekční prostředky. Způsobují poškození buněčných struktur, DNA a enzymů prostřednictvím uvolňovaných radikálových částic. Účinnost je snižována přítomností organické kontaminace (Števkovičová 2007). Halogeny způsobují oxidativní poškození a vznik pro buňku toxických sloučenin (Melicharčíková 1998). Sloučeniny s aktivním chlorem patří k nejúčinnějším dezinfekčním látkám a mají proto široké využití ve zdravotnictví i jiných oborech. Jodové přípravky se používají ve formě vodných a alkoholových roztoků nebo jodoforů, což jsou komplexní organické molekuly nesoucí atom jodu (Števkovičová 2007). Nevýhodou halogenových přípravků je jejich snížená účinnost v prostředí s organickou kontaminací a korozivní účinky (Melicharčíková 1998). Akoholy a ethery mají schopnost koagulovat a denaturovat bílkoviny (Melicharčíková 1998). Alkoholy také poškozují buněčné membrány, inhibují syntézu DNA, RNA, proteosyntézu a syntézu peptidoglykanu. Nejúčinnější jsou 60% 70% vodné roztoky a účinnost není významně ovlivňována přítomností organické kontaminace (Števkovičová 2007). Aldehydy se vyznačují redukčními a alkylačními vlastnostmi produkovaných radikálů, které reagují s funkčními skupinami bílkovin a nukleových kyselin. Používají se v kombinaci s dalšími dezinficiencii a detergenty (Melicharčíková 1998). V minulosti hojně používaný formaldehyd se vzhledem ke svým karcinogenním a teratogenním účinkům využívá spíše ke sterilizaci v autoklávech za dodržování podmínek zajišťujících bezpečnost pracovníků (Števkovičová 2007). Fenolové sloučeniny patří mezi látky poškozující buněčné membrány (Števkovičová 2007). Samotný fenol patří k nejdéle používaným dezinfekčním prostředkům. Je však vysoce toxický a má leptavé účinky na kůži a sliznice. V dnešní době se samostatně k dezinfekci nevyužívá, ale je používán jako standard při stanovení fenolového koeficientu (Melicharčíková 1998). Mechanismem účinku sloučenin kovů jsou reakce s thiolovými skupinami bílkovin, čímž je narušena funkce enzymů. Působí především na gramnegativní bakterie (Melicharčíková 1998, Števkovičová 2007). Účinnost je snižována přítomností 14

15 organických látek v prostředí a nízkými teplotami, problém představuje také toxicita anorganických sloučenin těžkých kovů (Melicharčíková 1998). Povrchově aktivní látky neboli tenzidy snižují povrchové napětí svých rozpouštědel. Molekuly tenzidů obsahují jak skupiny rozpustné, tak nerozpustné v daném rozpouštědle. Účinnost se zvyšuje při vyšší teplotě. Podle struktury a elektrochemické povahy lze povrchově aktivní látky rozdělit na anionaktivní, kationaktivní, amfoterní a neionogenní. Anionaktivní tenzidy ve vodném prostředí disociují na aktivní anion a neaktivní kation, na rozdíl od kationaktivních tenzidů, které se rozpadají na aktivní kation a neaktivní anion. V molekule amfoterních tenzidů jsou obsaženy skupiny kyselé i zásadité, proto disociuje v závislosti na ph. V kyselé oblasti se chová jako kationaktivní tenzid, v zásadité oblasti naopak jako anionaktivní. V oblasti neutrálního ph jsou amfoterní tenzidy málo rozpustné. Neionogenní tenzidy v roztoku nedisociují. Mezi kationaktivní tenzidy patří kvartérní amoniové sloučeniny, vyznačující se silným membrány poškozujícím účinkem. Jejich účinnost se výrazně nemění v prostředí kontaminovaném organickými látkami (Števkovičová 2007). Kvartérní amoniové sloučeniny působí především na grampozitivní bakterie a mikroskopické houby (Melicharčíková 1998). Dezinfekční prostředky jsou často používány v kombinacích. Spolupůsobením vhodných látek je umožněno použití nižších koncentrací prostředku, dosažení lepšího dezinfekčního působení (Melicharčíková 1998), rozšíření spektra účinnosti na mikroorganismy, menší pokles účinnosti v prostředí kontaminujících látek a snížení rizika selekce rezistentních mutantů. Obvyklá je kombinace dezinfekční složky se složkou s čistícím účinkem, kterou představují tenzidy (Števkovičová 2007) Testování citlivosti mikrobů k antimikrobním látkám zejména v rutinní praxi a související legislativa Účinnost antimikrobních látek je třeba hodnotit při vývoji látek nových, jejich zavádění do praxe i průběžně během používání. V běžné provozní praxi je nutné provádět nejen kontrolu účinnosti antimikrobních látek na mikroorganismy, ale rovněž kvality práce při dezinfekčních postupech (Melicharčíková 1992). Na rozdíl od testování citlivosti k antibiotikům, kde se stanovuje minimální inhibiční koncentrace, je třeba při hodnocení účinnosti dezinfekčních prostředků zjišťovat počty všech životaschopných buněk. I buňky inhibované v růstu mohou být totiž zdrojem 15

16 kontaminace a mohou obnovit bakteriální populaci po nástupu příznivějších podmínek (Luppens a kol. 2002). Povinnost provozovatelů zdravotnických zařízení, ústavů sociální péče nebo léčebně preventivních zařízení dodržet hygienické požadavky při výkonu a kontrole dezinfekce, vyššího stupně dezinfekce a sterilizace je zakotvena v zákoně 258/2000 Sb. o ochraně veřejného zdraví v platném znění. V paragrafu 55 tohoto zákona je přímo určena povinnost kontrolovat účinnost dezinfekce (Zákon 258/2000 Sb). Způsoby výkonu dezinfekce i vyššího stupně dezinfekce a také jejich kontroly, jsou uvedeny v Příloze č. 3 k vyhlášce 195/2005 Sb. (Vyhláška 195/2005 Sb.) Testování nových, potenciálně využitelných dezinfekčních prostředků, probíhá v evropských zemích ve třech fázích. První jsou suspenzní testy nezohledňující praktické podmínky, poskytující pouze základní informace o dezinfekční účinnosti. Druhá fáze je rozdělena do dvou kroků. V prvním z nich se používají suspenzní testy jejichž podmínky se co nejvíce přibližují praktickým podmínkám. Druhý krok zahrnuje testy simulující praktické použití, například dezinfekce povrchů nebo rukou. Třetí fází je samotné testování účinnosti v praxi (Luppens a kol. 2002). Testování účinnosti před uvedením biocidů na trh v členských státech Evropské unie upravuje Směrnice Evropského parlamentu a rady 98/8/ES (Směrnice 98/8/ES). Je-li cílem prováděných testů zisk reprodukovatelných výsledků, například při základním výzkumu nebo porovnávání látek, je nutné k testům používat mikroby se známými a prověřenými vlastnostmi. Tyto požadavky splňují kmeny uchovávané ve sbírkách mikroorganismů. Při skladování a manipulaci s mikrobiálními kmeny musí být dodrženy standardní podmínky, aby nedošlo ke změně vlastností mikrobů. Je také nutné pracovat se známým množstvím mikrobiálních buněk v suspenzi. Množství buněk lze zjistit měřením optické hustoty pomocí nefelometru, počítáním v komůrce nebo pomocí srovnávacího zákalového standardu, takzvané McFarlandovy stupnice. Obvykle se hustota pohybuje v řádech 10 8 až 10 9 buněk v 1 ml suspenze (Kneiflová 1985). Z hlediska interpretace výsledků lze metody dělit na dvě skupiny. První skupinou jsou metody kvalitativní u nichž nelze stanovit přesný počet přežívajících mikrobů. Vypovídají pouze obecně o schopnosti mikrobů množit se po expozici antimikrobní látce a následné kultivaci v živné půdě. Obvykle se hodnotí jako pozitivní, pokud mikrob roste a daná látka je tedy neúčinná. Nebo negativní pokud se žádný nárůst nevytvoří a látku lze považovat za účinnou. Druhou skupinu představují metody kvantitativní, které umožňují sledovat vliv různých faktorů na dynamiku dezinfekčního procesu. Umožňují stanovit 16

17 mikrobicidní efekt (ME) látky, neboli pokles počtu jednotek tvořících kolonie (CFU) za daných podmínek. (Kneiflová 1985). ME = No/Nd - logno - lognd No...počet CFU v kontrolním pokusu Nd...počet CFU v pokusu s použitím antimikrobní látky Kvalitativní standardní suspenzní metoda Je metodou technologicky jednoduchou a tudíž vhodnou pro rychlou kontrolu účinnosti dezinfekčních roztoků a srovnávání účinnosti různých látek. Pomocí standardní suspenzní metody lze stanovit nejkratší účinnou dobu expozice při dané koncentraci nebo nejnižší účinnou koncentraci při určité době expozice (Kneiflová 1985). Při testování přípravku s neznámou účinností je u standardního postupu prvním krokem takzvaný předpokus, kdy se stanoví účinnost antimikrobiální látky v ředěních , při expozičních časech 5, 15 a 30 minut na vybraný bakteriální druh. K ředění buněčné suspenze nebo jako kontrolní vzorek se používá sterilní destilovaná voda. Následně se podle výsledků předpokusu vybírá 4 5 vhodných ředění a volí se expoziční časy. Vzorky antimikrobní látky o různé koncentraci a kontrolní vzorek se rozplní do sterilních Petriho misek po 9,9 ml. Do každé z misek se přidá 0,1 ml mikrobiální suspenze a krouživým pohybem promíchá. Po zvolených časech expozice se bakteriologickou kličkou přenáší vzorek do zkumavky s vhodným tekutým médiem. Při teplotě odpovídající optimu použitého mikroorganismu se kultivuje po dobu 48 h nebo 5 až 7 dní v případě bakteriálních spor. Hodnotí se vznik zákalu v médiu, povrchové blanky nebo sedimentu. Pro přesnou identifikaci pomnožených mikrobů se provádí kontrola formou kultivce vzorku na pevném médiu. Za účinný antimikrobní prostředek při dané koncentraci a době expozice lze považovat ten, u něhož nedošlo k růstu mikroorganismů u nejméně třikrát opakovaného pokusu (Kneiflová 1985) Kvantitativní suspezní metoda Vychází ze standardní suspenzní metody. Hodnotí se však kvalitativně, stanovením počtu CFU po kultivaci na pevném médiu. Metodu s kvalitativním hodnocením výsledků lze použít pro posouzení závislosti průběhu hynutí mikrobů na koncentraci antimikrobní látky a expozičním čase (Kneiflová 1985). Obvyklým postupem je výběr tří nebo čtyř nejvhodnějších ředění na základě výsledků předpokusu s ředěními antimikrobní látky 10-1 až Do 9,9 ml zředěného 17

18 dezinfekčnícho roztoku se přidává 0,1 ml mikrobiální suspenze. Po zvolené době expozice se část suspenze přenáší do zkumavky s neutralizátorem a poté s bujonem, tento postup se opakuje v celkem pěti zkumavkách. Následně se 0,5 ml suspenze přenáší na plotnu s pevným médiem, nechá oschnout v sušárně nebo termostatu a kultivuje 24 až 48 h. Hodnotí se počet CFU (Kneiflová 1985) Suspenzní mikrometoda Modifikace suspenzní metody, která využívá mikrotitračních destiček. Umožňuje stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), minimální baktericidní koncentrace látky ve vodném roztoku (MBC) a minimální baktericidní koncentrace při bílkovinné zátěži (MBC-B). Suspenzní mikrometoda vychází ze standardní suspenzní metody, avšak použití mikrotitračních destiček o 96 jamkách umožňuje rychlé zpracování velkého množství vzorků při malé spotřebě kultivačních médií (Kneiflová 1988) Metoda stanovení (přetrvávajícího) bakteriostatického působení chemických látek Slouží ke zjištění schopnosti antimikrobní látky inhibovat množení mikrobů, je-li trvale přítomna v prostředí. Usmrcení mikrobů není podmínkou. Antimikrobní látka se přidává přímo do kultivačního média. intervalech 24, 48 a 120 h se provádí hodnocení zákalu v médiu. Poté se kultivací na pevné půdě ověří schopnost množení a identifikují se případné rostoucí mikroby. Pokus se opakuje nejméně třikrát a poté se stanoví MIC, neboli nejmenší koncentrace látky bránící množení mikroorganismů. Ověření kultivací na pevné půdě je nezbytné, neboť zákal v bujonu může být způsoben nejen množením použitých mikroorganismů, ale také kontaminací nebo reakcí testované antimikrobní látky (Kneiflová 1985) Stanovení bakteriostatického účinku látek na mikroby fixované na nosičích Metoda s mikroby fixovanými na nosičích z pevných materiálů navazuje při testování nových antimikrobních látek na základní suspenzní metody. Jako nosiče se vybírají materiály odpovídající dané oblasti použití přípravku, přičemž je nutné ověřit, zda materiál nepůsobí na mikroby toxicky (Kneiflová 1985). Při typickém uspořádání pokusu se nejprve provádí předpokus pro ověření potenciálních toxických účinků samotného testovaného materiálu. Na nosiče se nanese mikrobiální suspenze o různé hustotě a nechá se zaschnout. Stejným způsobem se připraví 18

19 i kontrolní skleněné nosiče. Po 60 minutách se nosič otiskne na agarovou plotnu. Po určité době kultivace se porovnává nárůst kolonií na otiscích vzorků testovaných materiálů s kontrolou. Poté následuje samotná fáze testování účinnosti. Na očištěné suché nosiče se nanese mikrobiální suspenze a nechá zaschnout. Následně se kontaminované nosiče otřou tamponem napuštěným antimikrobní látkou v daném ředění. Ve stanovených časových intervalech se nosiče otiskují na pevné médium, které musí obsahovat látku neutralizující případné zbytky testované antimikrobní látky. Po kultivaci při 37 C a době 24 hodin se hodnotí množství narostlých kolonií (Kneiflová 1985). Jedním z možných nosičů jsou skleněné matové perličky. Jejch výhodou je standardní velikost a jakost materiálu, snadné ulpívání mikrobů na jejich povrchu a také jednoduchá manipulace. Při testu se perličky obvykle zalévají mikrobiální suspenzí v tekutém kultivačním médiu v Petriho misce. Po 10 minutách se přebytečné médium odsaje a perličky se na filtračním papíře suší při teplotě 37 C po dobu 60 minut. Suché nosiče lze krátkodobě skladovat v lednici. Kontaminované perličky se vloží do zkumavky s naředěným antimikrobním přípravkem, po uplynutí doby expozice se perličky vyjmou, opláchnou v neutralizačním roztoku a přenesou do kultivačního bujonu. Po určité době kultivace se provádí kvalitativní hodnocení, tedy pozitivní nebo negativní růst mikroba (Kneiflová 1985). 19

20 4. Rezistence bakteriálních buněk v biofilmu k antimikrobním látkám 4.1. Příčiny a mechanismy rezistence mikrobů v biofilmu Vliv extracelulární matrix Extracelulární matrix tvoří podstatnou část hmoty biofilmu (Donlan 2002, Donlan a Costerton 2002). Představuje překážku pro difuzi dezinfekčních látek k buňkám ve vnitřních vrstvách a snižuje tak účinnost dezinfekce (Bridier a kol. 2011, Donlan a Costerton 2002). Ztížená difuze a interakce se složkami biofilmu vedou k vytvoření koncentračního gradientu biocidu (Russel 2003). Ve vnitřních vrstvách biofilmu se pak mohou vyskytovat subletální koncentrace dezinfekčních prostředků umožňující rozvoj adaptivní odpovědi buněk (Bridier a kol. 2011). Schopnost penetrace dezinfekčních prostředků je mimo jiné ovlivňována působením elektrostatických sil. Negativně nabitá hmota biofilmu brání difuzi pozitivně nabitých částic. Roli mohou hrát také hydrofobní interakce mezi dezinfekční látkou a složkami extracelulární matrix (Bridier a kol. 2011). U druhu Bacillus subtilis byl popsán extrémě nesmáčivý a pro plyny nepropustný povrch biofilmu, který představoval značnou překážku v účinnosti mnoha biocidů. Tyto povrchové vlastnosti byly ovlivněny polysacharidovými i proteinovými složkami extracelulární matrix (Epstein a kol. 2011). Dezinfekční látky jsou obvykle vysoce reaktivní a chemické reakce s organickými složkami matrix biofilmu, jako jsou proteiny, nukleové kyseliny nebo sacharidy také snižují jejich účinnost (Stewart a kol. 2000). Tento efekt se projevuje výrazněji u látek s vyšší reaktivitou, jako je například chlornan sodný, naproti tomu látky méně reaktivní pronikají hmotou biofilm lépe. I antimikrobní látky, které mají slabší účinnost proti planktonickým bakteriím, mohou být tedy potenciálně účinné proti biofilmu, neboť jejich penetrace není tolik ovlivňována reakcemi s extracelulární matrix. (Stewart a kol. 2001). V extracelulární matrix mohou být přítomny i enzymy schopné inaktivovat složky desinfekčních přípravků. Pokusy s Pseudomonas aeruginosa ukázaly, že peroxid vodíku není schopen dostatečně proniknout biofilmem tvořeným kmenem P. aeruginosa produkujícím katalázu, zatímco u kmenů mutantních v genech pro katalázu byla schopnost průniku vyšší (Stewart a kol. 2000). 20

21 Vliv extracelulární matrix je však jen jedním z faktorů rezistence, neboť i v případě, kdy byla zjištěna kompletní penetrace do biofilmu, byla citlivost bakterií nižší než u planktonických buněk (Stewart a kol.2001, Cochran a kol. 2000), také buňky biofilmu převedené do suspenze vykazovaly nižší citlivost (Kubota a kol. 2009) Fenotypové adaptace buněk Během růstu buněk v biofilmu se díky jeho trojrozměrné struktuře vytváří chemické gradienty nutričních látek i produktů metabolismu. Důsledkem této chemické heterogenity prostředí je vznik fyziologicky heterogenní populace buněk. Změny v rychlosti růstu, aktivitě buněk, složení buněčných membrán a aktivaci obranných mechanismů mohou vést ke zvýšené rezistenci. Také aktivace genů spojených se stresovou odpovědí poskytuje buňkám ochranu, například před oxidativním stresem (Bridier a kol. 2011). Dalším možným mechanismem rezistence je aktivace systému efluxních pump. Tento systém umožňuje buňkám vyloučit toxické látky a přežít tak v prostředí, kde jim jsou vystaveny. Napříkad u biofilmu tvořeného kmenem Salmonella typhimurium ATCC byla zaznamenána exprese genů pro široké spektrum efluxních pump po vystavení subletálním koncentracím triclosanu. Systém pump je společný pro dezinfekční látky i antibiotika, indukce exprese efluxních pump působením triclosanu tedy může vést ke zkřížené rezistenci s antibiotiky (Tabak a kol. 2007). V souvislosti s biofilmem však mechanismy efluxních pump nebyly dosud uspokojivě prostudovány a bude předmětem dalších výzkumů, zda hrají významnou roli při vzniku rezistence biofilmu (Bridier a kol. 2011). Quorum sensing ovlivňuje vznik buněčného fenotypu charakteristického pro biofilm. Byla zjištěna regulace stresové odpovědi pomocí tohoto mechanismu, řízení produkce ochranných enzymů, například katalázy nebo superoxid dizmutázy (Bridier a kol. 2011). V biofilmu se vyskytuje určité malé množství perzistentních buněk, které byly nalezeny i v populaci planktonických buněk. Jedná se o velmi odolné fenotypické varianty, nikoliv genetické mutanty (Bridier a kol. 2011). Množství perzistentních buněk je závislé na růstové fázi populace. Jen velmi málo těchto buněk bylo pozorováno v kulturách v logaritmické fázi, naopak ve stacionární fázi růstu a biofilmu množství perzistentních buněk vzrůstá (Lewis 2005). 21

22 Přenos genů a mutace Přenos genetické informace, v podobě plazmidů, transpozomů a integronů se podílí na adaptaci mikroorganismů k podmínkám okolního prostředí. Jednou z vlastností, která může být takto přenášena, je i rezistence k antimikrobním látkám. Vysoká hustota buněk, extracelulární matrix, přítomnost velkého množství uvolněné DNA nebo nutriční podmínky v prostředí biofilmu mohou podporovat přenos genetické informace (Bridier a kol. 2011). Vznik rezistentních variant buněk může být vyvolán rovněž mutacemi. Mutace jsou jednak spontánní, ale i způsobené vnějšími vlivy. Oxidativní stres vznikající v důsledku nepříznivých podmínek v biofilmu může způsobovat zlomy v DNA a zvyšovat tak riziko vzniku rezistentních variant (Bridier a kol. 2011). Sledování mutantů Pseudomonas aeruginosa PA01 rezistentních vůči rifampicinu a ciprofloxacinu v biofilmu ukázalo až více než stonásobně zvýšenou frekvenci mutací oproti planktonickým buňkám (Driffield a kol. 2008) Ochrana ve vícedruhovém biofilmu Biofilm tvořený více druhy mikroorganismů se v přírodním prostředí vyskytuje mnohem častěji než jednodruhový. Obecně lze říci, že vícedruhové biofilmy vykazují vyšší rezistenci než jednodruhové. Příčin této zvýšené rezistence může být několik. Prvním možným mechanismem jsou interakce mezi extracelulárními polymery produkovanými buňkami jednotlivých druhů. Důsledkem může být vytvoření zvýšeně viskózní matrix, méně prostupné pro biocidy (Bridier a kol. 2011). Další možností je produkce enzymů schopných biocidy degradovat. Enzymy produkované jedním druhem mikroorganismu mohou poskytovat ochranu jinému druhu, který jejich produkce není schopen. Produkuje-li ochranné enzymy více druhů, mohou se vzájemně doplňovat (Bridier a kol. 2011). Ochranu před působením antimikrobních látek může poskytovat rovněž určité prostorové uspořádání v trojrozměrné struktuře biofilmu, díky němuž je méně odolný druh chráněn spojením s druhem odolnějším vůči působení biocidu. Takováto mezidruhová spolupráce je možná jak mezi různými prokaryoty, tak mezi prokaryotickými a eukaryotickými mikroorganismy (Bridier a kol. 2011). U smíšeného biofilmu Streptococcus mutans UA159 a Veillonella parvula DSM 20 byl studován vliv růstu buněk ve smíšeném biofilm na expresi některých genů. V případě S. mutans ve smíšeném biofilmu bylo zjištěno, že transkripce 15 genů byla podstatně vyšší, 22

23 zatímco transkripce 19 genů byla utlumena v porovnání s jednodruhovým biofilmem. Přítomnost V. parvula ve smíšeném biofilmu tedy měla vliv na fyziologii buněk S. mutans, přičemž tyto změny vedly ke zvýšené rezistenci (Luppens a kol. 2008) Metody studia účinnosti antimikrobních látek na buňky v biofilmu Kultivace biofilmu in vitro Pro zavedení standardizované metody hodnocení účinnosti antimikrobních látek na mikrobiální biofilmy je nezbytným předpokladem vytvoření postupů vedoucích k zisku vhodných vzorků biofilmu. Tyto vzorky musí být jednak reprodukovatelné, ale také by měly mít vlastnosti srovnatelné s biofilmem vyskytujícím se v prostředí, kde mají být dané antimikrobní látky používány (Buckingham-Meyer 2007) Statické metody kultivace Během statické kultivace nedochází v systému k proudění kultivačního média. Tyto metody jsou oproti metodám dynamickým méně náročné z hlediska potřeby specializovaného vybavení. Proudění kultivačního média však do značné míry ovlivňuje vlastnosti biofilmu a tedy i rezistenci k antimikrobním látkám. Biofilm kultivovaný statickou metodou vykazoval výrazně vyšší ciltivost k dezinfekčním látkám než biofilmy kultivované dynamicky pod vlivem proudění média (Buckingham-Meyer 2007) Kultivace ve zkumavkách Bakterie jsou v tekutém živném médiu inkubovány v plastových nebo skleněných zkumavkách. Po skončení inkubace je médium odstraněno a případný biofilm vytvořený na stěnách zkumavky je obarven, například safraninem. Hodnotí se vytvořený nárůst (Christensen a kol. 1985). Ve zkumavkách s vhodným médiem mohou být umístěny i nosiče z různých materiálů, na kterých se vytváří biofilm (Mariscal a kol. 2007) Kultivace v mikrotitračních destičkách Jamky mikrotitrační destičky se plní suspenzí bakterií v živném médiu. Po určité době inkubace se živné médium odstraní a jamky se promývají například fyziologickým roztokem, poté následuje fixace a barvení. Nárůst biofilmu se hodnotí spektrometrickým měřením optické hustoty. Díky použití spektrometrie se jedná o metodu objektivnější a přesnější než výše zmíněná zkumavková metoda (Stepanović a kol. 2000). 23

24 Kultivace na membránovém filtru Další ze statických kultivačních metod využívá nitrocelulózových filtrů. Filtry se umístí na vhodné pevné kultivační médium. Následně jsou inokulovány bunčnou suspenzí. Kultivace může probíhat jak aerobně, tak anaerobně v podmínkách optimálních pro daný mikroorganismus, výhodou je také možnost snadné manipulace a přenášení vzorků biofilmu na filtru (Spratt a kol. 2001) Dynamické metody kultivace Dynamické metody umožňují kultivovat vzorky biofilmu pod vlivem různých rychlostí a typů proudění kultivačního média a tedy i lépe simulovat podmínky v přirozeném prostředí. Bylo prokázáno, že rezistence mikrobů v biofilmu vzrůstá s rychlostí proudění během kultivace (Buckingham-Meyer 2007). S vyjímkou kultivace na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky jsou všechny zde zmíněné metody kontinuální. Je tedy možné během kultivace přivádět do systému čerstvé médium Kultivace na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky Využívá reakční nádoby složené ze dvou částí. Horní část funguje jako víko a je opatřena 96 hroty. Tyto hroty jsou umístěny tak, aby odpovídaly pozicím kanálků ve spodní části nádoby nebo jamek mikrotitrační destičky. Díky proudění kultivačního média v kanálcích vzniká na zanořených hrotech homogenní biofilm (Ceri a kol.1999). Pro testování citlivosti vytvořeného biofilmu je celé víko s hroty porostlými biofilmem přemístěno do standardní 96 jamkové destičky s roztoky testovaných antimikrobních látek. Jedná se o poměrně jednoduchou a rychlou metodou pro kultivaci biofilmu a testování citlivosti k antimikrobiálním látkám, neboť umožňuje testování různých látek a jejich koncentrací během jedné analýzy (Ceri a kol.1999). Typickým zařízením fungujícím na principu kultivace na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky je Calgary Biofilm Device (Obr. 2). 24

25 Obr.2 Calgary Biofilm Device : (A) naklápějící se podstavec vytváří proudění kulitvačního média, může být umístěn v inkubátoru pro kontrolu teploty nebo koncentrace kyslíku; (B) Příčný řez zařízením znázorňující hroty umístěné v otvorech inkubační nádoby; (C) víko zařízení. (Upraveno dle Ceri a kol.1999) Kultivace v průtokové komůrce K vývoji průtokových komůrek vedla potřeba kultivační metody, která by umožňovala studium biofilmu ovlivněného různými hydrodynamickými podmínkami. Průtokové komůrky mohou být konstruovány jako jednoprůtokové. U těch je živné médium vytékající z komůrky likvidováno. Metoda je však použitelná pouze pro nízké rychlosti průtoku, vzhledem k velké spotřebě živných médií (Teodosió a kol. 2010). Vyšších rychlostí proudění umožňují dosáhnout recirkulační soustavy. Do komůrky se umisťují nosiče z různých materiálů, například PVC (Teodosió a kol. 2010) Kapkový reaktor ( drip flow reactor ) Kapkový reaktor je zařízením, které umožňuje kultivaci biofilmu při malé rychlosti proudění média. Skládá se z několika paralelně umístěných nakloněných komor, v nichž jsou vloženy nosiče z různých materiálů, sloužící jako povrch pro vytvoření vzorků biofilmu. Každá z komor může být mikroorganismy inokulována zvlášť, po inokulaci je komora ponechána po dobu h bez proudění, aby došlo k přichycení buněk k povrchu. Poté je inokulační médium vypuštěno a následuje fáze kontimuálního proudění, 25

26 kdy komorami po kapkách protéká kultivační médium (Stewart a kol. 2001). Kapkový reaktor je vhodný pro simulaci biofilmů v prostředí jako jsou katetry, ustní dutina, plíce pacientů s cystickou fibrozou nebo některá zařízení v potravinářském průmyslu (Goeres a kol. 2009) Rotační diskový reaktor Rotační diskový reaktor umožňuje kultivovat biofilm pod vlivem různého proudění, ale v jinak konstantních podmínkách. Skládá se z kultivační nádoby s rotujícími disky a druhé mísící nádoby, která zajišťuje recirkulaci média, aniž by bylo narušováno proudění v kultivační nádobě (Möehle a kol. 2007). Disky mohou být výměnné a vyrobené z různých materiálů. Jedná se o flexibilní systém upravitelný tak, aby simuloval různá prostředí (Pitts a kol. 2001) Rotační válcový reaktor ( rotating annular reactor ) Rotační válcový reaktor obsahuje dva válce, vnější válec je statický a na jeho vnitřní stranu lze upevnit kupony, pro nárůst vzorků biofilmu. Proudění média je zajištěno rotací vnitřního válce. Rotační válcový reaktor umožňuje kultivaci vzorků bifilmu při udržení relativně stálých hydrodynamických podmínek podmínek (Lawrence a kol. 2000) CDC reaktor CDC reaktor je zařízením, ve kterém je možné kultivovat bakterie v biofilmu pod vlivem středních a vysokých rychlostí proudění média. Skládá se ze skleněné reakční nádoby s odtokovým otvorem. Do víka nádoby ústí přívod kultivačního média a otvor pro výměnu plynů. K víku jsou uchyceny vyjímatelné tyče, na každou z nich lze umístit kupony z různých materiálů, které slouží jako povrch pro růst biofilmu. Uvnitř nádoby je míchadlo, které zajišťuje mísení kultivačního média a stálou rychlost proudění (Obr. 3). CDC reaktor umožňuje kultivovat bakterie v biofilmu pod vlivem kontrolovaných podmínek a získat reprodukovatelné vzorky biofilmu (Goeres a kol. 2005). 26

27 Obr.3.: CDC reaktor obsahující 8 vyjímatelných tyčí, na každou z nich lze umístit tři kupony, zařízení tedy umožňuje kultivaci celkem 24 vzorků biofilmu (Goeres a kol. 2005) Hodnocení citlivosti biofilmu k dezinfekčním látkám Pro testování účinnosti antimikrobních látek jsou sice v praxi používány testy s bakteriemi přichycenými na pevných nosičích (kapitola 3.2), při těchto testech ale není mikroorganismům dán dostatečný čas k vytvoření struktury biofilmu. Takovéto vzorky postrádají charakteristické vlastnosti biofilmových populací. Přestože se u testů s bakteriemi na nosičích jedná o krok dopředu oproti běžným suspenzním testům, které poskytují informace pouze o vlastnostech planktonických populací, je nutné se zaměřit na vytvoření standardních metod pro měření citlivosti biofilmů k antimikrobiálním látkám (Luppens a kol. 2002) Kultivační plotnová metoda stanovení počtu životaschopných buněk Kultivační plotnová metoda je již tradičním, často využívaným postupem ke zjištění počtu životaschopných buněk. Pro stanovení citlivosti buněk v biofilmu má však několik nedostatků. Ukazuje pouze dezinfekční účinnost. U přípravků určených k dezinfekci biofilmu je však kromě usmrcení mikrobů často jedním z požadavků i účinná redukce biomasy biofilmu na povrchu (Pitts a kol 2003). Při převádění buněk biofilmu do buněčné suspenze může dojít k ovlivnění výsledků, neboť ne vždy se podaří převést do 27

28 roztoku všechny buňky přichycené na nosiči, proces může také některé buňky poškodit (Hamilton a kol. 2009). Dalším problémem je potřeba zjišťovat při hodnocení dezinfekčních přípravků i přítomnost nemnožících se, ale přesto živých buněk (Luppens a kol. 2002), které však tato metoda neodhalí. Nevýhodou je také náročnost na množství materiálu a zdlouhavost. Biofilm je kultivován na pevných nosičích z různého materiálu, a následně vystaven působení dezinfekčního přípravku. Podmínky jsou voleny tak, aby napodobovaly přirozené prostředí. Po určité době je dezinfekční účinek zastaven přidáním neutralizačního činidla (Hamilton a kol. 2009). Poté je nutné rozrušit bakteriální biofilm, oddělit jej od nosiče a uvolnit buňky do roztoku. Lze použít seškrábání, například dřevěnou tyčinkou, setření tamponem, promíchávání na vortexu ve zkumavce se skleněnými korálky, ultrazvuk, stomaching, neboli mechanické převádění biologických vzorků do suspenze pomocí k tomu určeného zařízení. Někdy je možné tyto postupy kombinovat s účinkem surfaktantů nebo enzymů (Hamilton a kol. 2009). Roztok s uvolněnými bakteriálními buňkami se očkuje na vhodné pevné médium v několika ředěních. Stanovuje se počet CFU (jednotek schopných tvořit kolonie) na cm -2 povrchu nosiče (Chorianopoulos a kol. 2008) Metody využívající barvení Barvení lze využít pro hodnocení nárůstu biofilmové biomasy. Při barvení krystalovou violetí je nárůst biofilmu nejprve propláchnut, aby byly odstraněny nepřichycené buňky, následuje fixace. Lze využít například Bouinovo fixační činidlo, fixaci horkým vzduchem nebo metanol. Po vypláchnutí zbytků barviva je přidáno vhodné extrakční činidlo. Nejčastěji je používán etanol avšak lze použít i 33% ledovou kyselinu octovou nebo metanol. Hodnocení se provádí pomocí měření optické hustoty. Přestože krystalová violeť barví pouze bakteriální buňky, nikoliv extracelulární hmotu (Stepanović a kol. 2007), je tato metoda využívána spíše k hodnocení účinnosti při odstraňování hmoty biofilmu z povrchu, neboť nerozlišuje mezi živými a usmrcenými buňkami, nelze tudíž hodnotit baktericidní účinnost testované látky (Pitts a kol 2003) Optické metody detekce metabolicky aktivních buněk Detekce metabolicky aktivních buněk je možná při použití resazurinu. Jedná se o ve vodě rozpustné, netoxické barvivo. V přítomnosti živých buněk je modrý resazurin redukován na růžový resofurin. Pro detekci lze použít fluorescenci nebo spektrofotometrii 28

29 (Mariscal a kol. 2009). Existují i další barviva fungující na podobném principu například tetrazoliová sůl XTT, která je redukována na barevný derivát formazanu (Smith a Hunter 2008), 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorid (CTC) (Pitts akol. 2003), trimethyl tetrazolium chlorid (TTC) (Kim a kol. 2010). Tyto metody však nejsou schopny zachytit metabolicky neaktivní, ale přesto živé buňky, které se v biofilmu po působení antimikrobní látky mohou vyskytovat. Je možné použít i komerční kity pro detekci živých buněk. Například LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, který umožňuje odlišení buněk s porušenými buněčnými membránami (Smith a Hunter 2008). Množství živých buněk lze zjistit i pomocí sledování enzymatického štěpení fluorescentního substrátu. Příkladem může být využití schopnosti enzymu glukuronidázy, produkovaným buňkami Escherichia coli, hydrolyzovat takovýto substrát. Do zkumavek obsahujících nosiče se vzorkem biofilmu se přidá fluorogenní médium, po určité době inkubace se měří fluorescence tohoto média, jejíž hodnota je závislá na počtu metabolicky aktivních mikroorganismů (Mariscal a kol. 2007). Obr.4. Vizualizace inaktivace buněk během působní antimikrobní látky Horní řádek: S použitím LIVE/DEAD BacLight kitu pro detekci živých buněk, ty jsou obarveny zeleně (barvivo Syto9), buňky s porušenou membránou jsou obarveny červeně (propidium jodid). Dolní řádek: Životaschopné buňky obarveny zeleně, je možné pozorovat vyhasínání fluorescenčního signálu, související s unikáním flouroforů z buněk s porušenými membránami. (Upraveno dle Bridiere a kol. 2011) 29

30 Měření vodivosti živného média Metabolizující buňky vyvolávají změny ve vodivosti živného média, neboť slabě nabité složky média jsou buňkami přeměňovány na nabité ionty metabolických produktů. Vodivost je možné měřit v zařízení, které se skládá ze sterilizovatelné nádoby s vhodným živným médiem, do níž se vkládá vzorek biofilmu na nosiči, a dvou elektrod napojených na mikroprocesor (Wirtanen a kol. 2001). Jedná se například o zařízení BacTrac 4100 (Wirtanen a kol. 2001) nebo Rapid Automated Bacterial Impedance Technique (RABIT) (Chorianopoulos a kol. 2008) Kalorimetrie Měřením produkce tepla lze rovněž určit metabolickou aktivitu buněk. Výhodou této metody je její rychlost, možnost sledovat změny v reálném čase, citlivost a nedestruktivnost. Je možné použít jednu nádobu jak pro kultivaci, tak pro následné měření. Zařízení se skládá z průtokové komůrky, kde je možné kutivovat vzorky biofilmu. Měření probíhá pomocí čipu, který převádí teplo produkované metabolizujícími bakteriemi uvnitř komůrky na elektrický potenciál (Buchholz a kol. 2010) Kvantitativní PCR Běžné metody založené na analýze DNA mají pro testování citlivosti mikrobů k antimikrobním látkám jednu zásadní nevýhodu. DNA totiž v prostředí přetrvává i po usmrcení buněk a tyto metody poté nejsou schopny rozlišit mezi živými a mrtvými buňkami. To však lze obejít přidáním propidium monoazidu, který prochází pouze do buněk s porušenými membránami. V buňkách se kovalentně váže na DNA a brání amplifikaci. S použitím propidium monoazidu je možné využít kvantitativní PCR ke zjištění množství živých buněk s neporušenými membránami. Lze tedy stanovit účinnost antimikrobních látek, které působí na principu narušení buněčných membrán (Nocker a kol. 2007). 30

31 4.3. Účinnost dezinfekčních látek na bakteriální buňky v biofilmu a porovnání s planktonickými buňkami Látky působící v závislosti na ph - alkálie a kyseliny Kyseliny Antimikrobní účinek kyselin je založen jednak na působení vodíkových iontů, ale také nedisociovaných molekul. Zejména slabé organické kyseliny se v prostředí s nízkou hodnotou ph vyskytují v nedisociované podobě bez náboje a mohou procházet přes plazmatickou membránu buněk. Uvnitř buněk je hodnota ph vyšší, molekuly kyselin tedy disociují na nabité ionty (Brul a Coote 2009). Pro účely potravinářského průmyslu byla testována schopnost kmene Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM1149 v různých růstových fázích přežívat v přítomnosti organických kyselin. Bylo zjišťováno přežití po 30 minutách působení antimikrobní látky u planktonických buněk v logaritmické i stacionární fázi růstu a buněk v biofilmu. Nejprve byl použit roztok kyseliny octové o 5,5 11% koncentraci v 50mM octanu sodném, což odpovídá hodnotám ph 3,3 2,9. Buňky biofilmu a planktonické buňky ve stacionární fázi vykazovaly vyšší rezistenci než planktonické buňky ve fázi logaritmické (Graf 1). Zvýšená rezistence buněk biofilmu se projevovala především při vyšších koncentracích kyseliny octové (Kubota a kol. 2009). Dále byla studována schopnost bakteriálních buněk biofilmu udržet si své vlastnosti i po resuspendaci. Resuspendované buňky biofilmu L. plantarum subsp. plantarum JCM1149 si zachovaly zvýšenou rezistenci vůči 8,2% roztoky kyseliny octové v 50mM octanu sodném o výsledném ph 3 (Graf 2), což naznačuje vliv jiných faktorů na zvýšenou rezistenci než je samotná přítomnost buněk ve struktuře biofilmu. Narozdíl od planktonických buněk ve stacionární fázi růstu, přetrvávala tato rezistence i po zředění buněčné suspenze (Kubota a kol. 2009). Bylo testováno také působení dalších organických kyselin vůči planktonickým buňkám L. plantarum subsp. plantarum JCM1149 ve stacionární i logaritmické fázi růstu a buňkám v biofilmu. Kyselina octová v koncentraci 2,7 27% (ph 2,5 1,7), kyselina citronová v koncentracích 4,6 27% (ph 2,0 1,4), kyselina mléčná v koncentracích 0,9 20% (ph 2,3 1,5) a kyselina jablečná v koncentracích 2,7 18% (ph 2,1 1,5). Buňky v biofilmu vykazovaly vyšší rezistenci vůči organickým kyselinám než buňky planktonické (Graf 3). Také planktonické buňky ve stacionární fázi byly odolnější než buňky ve fázi 31

32 logaritmické. Velké rozdíly v rezistenci mezi buňkami biofilmu a planktonickými, byly pozorovány především u kyselin octové a mléčné. Tento jev je možné vysvětlit větší hydrofobicitou jejich nedisociovaných molekul v porovnání se zbývajícími dvěmi sloučeninami. Biofilmy obecně vykazují zvýšenou rezistenci vůči hydrofobním molekulám, což se projevilo nejen v případě organických kyselin, ale i například etanolu (Kubota a kol. 2009). Ve studii vlivu dezinfekčních metod na potenciálně patogenní mikroorganismus Burkholderia cenocepacia byla prokázána účinnost 1,25% kyseliny octové při době působení 15, 30, 60 minut jak na planktonické buňky, tak buňky v biofilmu. Při době působení 15 minut se však po 24 hodinách objevil opětovný nárůst biofilmu. Po 15 minutách působení kyseliny octové došlo tedy pouze ke snížení počtu živých buněk biofilmu pod detekovatelnou hranici. Tyto buňky se však byly schopny dále množit (Tabulka 1). Použití kyseliny octové tedy není metodou vhodnou k dezinfekci respiračních pomůcek pro nemocné cystickou fibrózou (Peeters a kol. 2008). Velmi malá účinnost kyseliny octové při ph 5 a době působení 30 minut byla zjištěna vůči Listeria monocytogenes LO28. Procento usmrcených buněk bylo poměrně nízké vzhledem k ostatním testovaným látkám a to jak u biofilmu různého stáří, tak u planktonických buněk v exponenciální i stacionární fázi (Graf 4). Slabou účinnost sníženého ph na buňky L. monocytogenes, je možné vysvětlit, přirozenou produkcí kyselin během metabolických procesů a tedy zvýšenou tolerancí vůči kyselému prostředí (Chavant a kol. 2004). Graf 1: Množství životaschopných buněk Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM1149 v různých růstových fázích po expozici kyselině octové (ph 3,3 2,9) (Upraveno dle Kubota a kol. 2009) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) (kontrola) Koncentrace Kyselina kyseliny octová octové (%) (%) biofilm ( ), planktonická stacionární fáze ( ) a planktonická logaritmická fáze ( ) Jako kontrola byl použit sterilní fyziologický roztok. Hodnoty označené písmenem a byly pod detekčním limitem. 32

33 Graf 2: Množství přežívajících buněk Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM1149 v různých růstových fázích po aplikaci roztoku kyseliny octové v octanu sodném (ph 3) (Upraveno dle Kubota a kol. 2009) Přežívající buňky (%) Ředění (log CFU.ml -1 ) Planktonické buňky Resuspendované buňky biofilmu Biofilm Tabulka 1: Hodnocení vlivů různých dezinfekčních látek na množství živých buněk okamžitě po aplikaci a po 24 h pomocí měření redukce resazurinu (data převzata z Peeters a kol. 2008) Antimikrobní látka Koncentrace (%) Doba působení (min) B. cenocepacia LGM Ihned po Po 24 h B. cenocepacia LGM Ihned po Po 24 h aplikaci aplikaci Průměr relativního fluorescenčního signálu (%) Kyselina octová 1, ,7 (5,2) Etanol Peroxid vodíku 0, ,6 (5,6) 68,7 (13,1) 18,1 (3,1) 34,4 (9,6) 0, ,7 (7,7) 37,9 (1,2) - 16,8 (4,0) ,4 (10,8) 19,9 (10,2) - 3,9 (1,6) ,9 (0,8) 15,8 (1,6) - - Chlorhexidin 0, ,8 (2,3) 102,0 (1,7) 22,4 (5,7) 8,2 (8,2) 0, ,4 (6,8) 80,5 (9,8) - 4,4 (0,9) Chlornan sodný 0, ,2 (0,5) 9,7 (1,9) 0, , Hodnoty v závorkách udávají směrodatnou odchylku. 33

34 Graf 3: Množství životaschopných buněk Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM1149 v různých růstových fázích po expozici organickým kyselinám (Upraveno dle Kubota a kol. 2009) (kontrola) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) (kontrola) Koncentrace kyseliny octové (%) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) (kontrola) Koncentrace kyseliny citronové (%) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) (kontrola) Koncentrace kyseliny mléčné (%) Koncentrace kyseliny jablečné (%) biofilm ( ), planktonická stacionární fáze ( ) a planktonická logaritmická fáze ( ) Jako kontrola byl použit sterilní fyziologický roztok. Hodnoty označené písmenem a byly pod detekčním limitem. 34

35 Graf 4: Citlivost Listeria monocytogenes LO28 v různých růstových fázích k antimikrobním látkám (Upraveno dle Chavant a kol. 2004) Mortalita buněk (%) Kyselina octová ph 5 Hydroxid sodný ph 12 Na 2SO 4 Na 2SO 4 ph 5+ Na 2SO 4 ph 12+ QAC Planktonické buňky v logaritmické fázi ( ), stacionární fázi ( ) a biofilmu různého stáří: 6 h (šrafování na bílém pozadí), 1 den (šrafování na světle šedém pozadí), 7 dní(šrafování na tmavě šedém pozadí), 7 dní bez doplňování čerstvého média (tečky na světle šedém pozadí). Mezi výsledky označenými stejným písmenem nebyl statisticky významný rozdíl. Graf 5: Hodnocení efektivity různých antimikrobních látek při odstraňování masy biofilmu Burkholderia cenocepacia LMG ( Upraveno dle Peeters 2008) Relativní absorbance (%) Koncentrace (%) Doba působení (min) Hodnoceno měřením absorbance po barvení hmoty biofilmu krystalovou violetí. kyselina octové (AA), Dettol (Det), etanol (Eth), horká voda (HW), peroxid vodíku (H 2 O 2 ), Hospital antiseptic concentrate (HAC), cetrimid (Cet), chlorhexidin (Chx) a chlornan sodný (NaOCl). 35

36 Zásady Při působení hydroxidu sodného o ph 12 byla prokázána velmi dobrá účinnost vůči Listeria monocytogenes LO28 ve všech testovaných růstových fázích. S vyjímkou 6 h starého biofilmu byla účinnost usmrcování buněk u všech růstových fází buněk vyšší než 90 % (Graf 4). Vyšší odolnost 6 h starého biofilmu může být vysvětlena přidáním čerstvého média po 2 h inkubace. Jelikož přidáním čerstvého média došlo ke zvýšení ph, rozdíl v hodnotě ph před aplikací NaOH a po ní tedy nebyl tak výrazný, jako u buněk v ostatních fázích růstu. Dalším možným faktorem je zvýšená rezistence způsobená fyziologickými změnami buněk v počátečních fázích adheze k povrchu. Podobný výsledek byl zjištěn také při použití Na 2 SO 4 o ph převyšujícím hodnotu 12 (Graf 4). Při pozorování skenovacím elektronovým mikroskopem bylo zjištěno, že buňky po 6 h inkubace ještě netvořily typickou trojrozměrnou strukturu biofilmu, ale jednalo se pouze o jednotlivé buňky přichycené k povrchu (Chavant a kol. 2004) Látky se silnými oxidačními účinky Peroxid vodíku Peroxid vodíku je silným oxidačním činidlem, fungujícím na proncipu produkce hydroxylových radikálů. Ty poškozují základní struktury v buňce oxidací lipidů, proteinů a DNA (McDonnell a Russel 1999). V koncentraci 600 mg l -1 vykazoval peroxid vodíku menší účinnost proti Pseudomonas aeruginosa PAO1 rostoucí v biofilmu na alginátových kuličkách (Graf 6) i na skleněném povrchu (Graf 7) v porovnání s planktonickými buňkami. Vizualizací průběhu pronikání peroxidu do biofilmu pomocí titračního reagens bylo zjištěno, že poměrně slabý biofilm na alginátových kuličkách pronikání peroxidu významně nebrání. Nebylo také pozorováno spojení mezi počáteční hustotou buněk biofilmu a citlivostí k peroxidu. Omezený transport antimikrobní látky se tedy v případě snížené citlivosti slabého biofilmu P.aeruginosa na alginátu podílí jen ve velmi malém procentu. Na skleněném povrchu však stejný mikroorganismus vytvářel biofilm s odlišnou, výrazně silnější strukturou. V případě silnější vrstvy biofilmu je zvýšená rezistence pravděpodobně důsledek souhry více faktorů mezi nimiž hraje omezený transport důležitou roli (Cochran a kol. 2000). Při hodnocení schopnosti peroxidu vodíku redukovat biomasu biofilmu Burkholderia cenocepacia LMG bylo zjištěno, že podstatné redukce (tj. redukce biomasy větší než 50 %) bylo po 30 minutách působení dosaženo až při použití 3% 36

37 koncentrace peroxidu (Graf 5). Byla také pozorována poměrně vysoká rezistence buněk B. cenocepacia v biofilmu vůči baktericidnímu působení peroxidu vodíku (Tabulka 1), která může být důsledkem produkce enzymů katalázy a peroxidázy v kombinaci s růstem v biofilmu (Peeters a kol. 2008). Graf 6: Vliv peroxidu vodíku (600 mg.l -1 ) na buňky Pseudomonas aeruginosa PAO1 v planktonické fázi a biofilmu na alginátových kuličkách (Cochran a kol. 2000) Dezinfekční koeficient (l.mg -1.min -1 ) Planktonické buňky Biofilm Stáří biofilmu (h) Graf 7: Vliv monochloraminu a peroxidu vodíku na buňky Pseudomonas aeruginosa PAO1 v planktonické fázi a biofilmu na skleněném povrchu (Cochran a kol. 2000) Planktonické buňky Biofilm Dezinfekční koeficient (l.mg -1.min -1 ) Monochloramin Peroxid vodíku 37

38 Kyselina peroctová (PAA) Mechanismus působení PAA je velmi podobný peroxidu vodíku. Oproti němu má však několik výhod, působí i při výrazně nižších koncentracích a také nepodléhá inaktivaci peroxidázami (McDonnell a Russel 1999). Pro buňky Pseudomonas aeruginosa PAO1 v různých fázích růstu byla po 6 h inkubace s PAA zjištěna výrazně vyšší tolerance buněk biofilmu vůči baktericidnímu působení PAA v porovnání s planktonickými buňkami v logaritmické fázi růstu. Avšak vysokou toleranci vykazovaly také planktonické buňky ve stacionární fázi růstu (Graf 8), což lze vysvětlit přítomností perzistentních buněk jak v biofilmu tak v planktonické stacionární fázi (Spoering a Lewis 2001). Určitou roli, ale mohlo hrát také poměrně malé stáří biofilmu (18 h). Koncentrace PAA 400 µg.ml -1, která je čtyřnásobkem MIC, byla prokázána jako dostačující k usmrcení buněk P. aeruginosa ve všech třech testovaných růstových fázích (Spoering a Lewis 2001). Zajímavý efekt popsali Van der Veen a Abee (2011). Při použití PAA vůči smíšenému biofilmu Listeria monocytogenes a Lactobacillus plantarum pozorovali výrazně vyšší odolnost v porovnání s jednodruhovým biofilmem L. monocytogenes. To ukazuje na ochranný efekt L. plantarum vůči L. monocytogenes ve smíšeném biofilmu. Graf 8: Vliv koncentrace PAA na usmrcování buněk P. aeruginosa PAO1 v různých růstových fázích (Upraveno dle Spoering a Lewis 2001) Množství životaschopných buněk (CFU.ml -1 ) A C B Koncentrace PAA (µg.ml -1 ) Buňky v (A) logaritmické planktonické fázi, (B) stacionární planktonické fázi, (C) biofilmu 38

39 Ozon Ozon je oxidačním činidlem, které je vzhledem ke schopnosti spontánního a rychlého rozkladu na neškodné látky využíváno především v potravinářském průmyslu a při úpravě pitné vody (Nagayoshi a kol. 2004). Hodnocení vlivu doby působení ozonu na buňky Listeria monocytogenes 10403S rostoucí v biofilmu na povrchu z nerezavějící oceli ukázalo, že doba působení měla statisticky významný vliv pouze při nízké koncentraci ozonu. Pro vyšší koncetrace ozonu nebyl mezi dobou působení 30 a 60 minut statisticky významný rozdíl. Účinnost ozonu při usmrcování buněk se zvyšovala s rostoucí koncentrací (Graf 9) (Baumann a kol. 2009) Ozonovaná voda s koncentracích ozonu 0,5 4 mg.l -1 vykazovala vysokou účinnost při usmrcování orálních mikroorganismů v planktonické fázi. Účinnost byla vyšší u gramnegativních bakterií v porovnání s grampozitivními. Velmi dobrá účinnost byla u ozonované vody v koncentraci 4 mg.l -1 pozorována také proti bakteriálnímu biofilmu lidského zubního plaku. Ozonovaná voda je tedy vhodným prostředkem pro odstraňování zubního plaku, čištění zubních náhrad, případně některých lékařských nástrojů (Nagayoshi a kol. 2004). Graf 9: Hodnocení účinnosti ozonu na biofilm kmene Listeria monocytogenes 10403S (Upraveno dle Baumann a kol. 2009) Množství životaschopných buněk (CFU.ml -1 ) Koncentrace a doba působení ozonu (ppm, s) 39

40 Antimikrobní látky obsahující halogeny Chlornan sodný Je jednou z nejrozšířenějších látek využívaných k dezinfekci povrchů. Ve vodném roztoku molekula chlornanu sodného disociuje na sodné kationty a chlorné anionty, které reagují s molekulami vody za vzniku kyseliny chlorné. Poměr množství chlorných iontů a molekul kyseliny chlorné závisí na ph roztoku (McDonnell a Russel 1999). Účinnost chlornanu sodného na buňky Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM 1149 byla poměrně nízká v porovnání s účinností na buňky v planktonické logaritmické fázi růstu (Graf 10). Planktonické buňky ve stacionární fázi si zachovávaly zvýšenou rezistenci pouze při nízkých koncentracích chlornanu (Kubota a kol. 2009). Při hodnocení účinku na Burkholderia cenocepacia LMG 18828, byla pozorována redukce celkové masy biofilmu vyšší než 50 % při všech testovaných koncentracích chlornanu sodného (Graf 5). U kmene B. cenocepacia LMG byla po aplikaci 0.05% chlornanu sodného po dobu 5 minut zjištěna přítomnost živých buněk, byl také pozorován opětovný nárůst po 24 hodinách, vyšší koncentrace chlornanu byly dostačující pro usmrcení buněk biofilmu (Tabulka 1) (Peeters a kol. 2008) Simões a kol. (2010) porovnávali účinnost chlornanu sodného vůči jednodruhovému a vícedruhovému biofilmu bakterií izolovaných z distribučního systému pitné vody. Hodnocení schopnosti redukce masy biofilmu ukázalo vyšší odolnost vícedruhového biofilmu téměř ve všech případech (Graf 11). Také redukce počtu životaschopných buněk byla u vícedruhového biofilmu nižší než u biofilmu jednoho druhu (Graf 12). Vůbec nejvyšší odolnost byla pozorována u biofilmu tvořeného všemi šesti sledovanými druhy mikrobů. Z výsledků je zřejmé, že druhová diverzita ve společenství biofilmu zvyšuje jeho odolnost vůči působení chlornanu sodného. Pro kmen Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC v planktonické formě byla k zabránění růstu nutná koncentrace chlornanu sodného 5,25 g.l -1 při době působení jednu minutu, ačkoliv doporučená koncentace je 1,31 g.l -1. Naopak pro usmrcení buňek v tři dny starém biofilmu byla doporučená koncentrace dostatečná a obecně nižší testované koncentrace chlornanu byly účinnější (Grafy 13 a 15). Po 5 minutách působení byly účinné všechny testované koncentrace (Graf 14). Podobný jev, kdy byly velmi dobře účinné nízké koncetrace kyseliny chlorné, byl pozorován i u Escherichia coli. Je tedy možné že u buněk S. enterica existuje podobný mechanismus (Wong a kol. 2010). 40

41 Graf 10: Chlornanu sodného na Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM 1149 v různých růstových fázích (Upraveno dle Kubota a kol.2009) (kontrola) Životaschopné buňky (log CFU.ml -1 ) Chornan sodný (ppm) biofilm ( ), planktonická stacionární fáze ( ) a planktonická logaritmická fáze ( ) Jako kontrola byl použit sterilní fyziologický roztok. Hodnoty označené písmenem a byly pod detekčním limitem. Graf 11: Hodnocení účinnosti chlornanu sodného při redukci biomasy (a) jednodruhového a (b) vícedruhového biofilmu (Upraveno dle Simões a kol. 2010) Redukce hmoty biofilmu (%) Redukce hmoty biofilmu (%) 41

42 Graf 12: Hodnocení vlivu chlornanu sodného na počet životaschopných buněk (a) jednodruhového a (b) vícedruhového biofilmu (Upraveno dle Simões a kol. 2010) Redukce životaschopných buněk (%) Redukce životaschopných buněk (%) 42

43 Graf 13: Citlivost třídenního biofilmu Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC k antimikrobním látkám při době působení 1 minutu (Upraveno dle Wong a kol. 2010) (BC) benzalkonium chlorid, (CA) kyselina citronová, (CG) chlorhexidin glukonát, (QAC) kvarterní amoniová sloučenina, (SH) chlornan sodný, jako kontrola byla použita voda. Graf 14: Citlivost třídenního biofilmu Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC k antimikrobním látkám při době působení 5 minut (Upraveno dle Wong a kol. 2010) Množství životaschopných buněk Množství buněk log(cfu.ml -1 ) log(cfu.ml -1 ) Množství životaschopných buněk log(cfu.ml -1 ) (BC) benzalkonium chlorid, (CA) kyselina citronová, (CG) chlorhexidin glukonát, (QAC) kvarterní amoniová sloučenina, (SH) chlornan sodný, jako kontrola byla použita voda. 43