Mikrobiologické zkoumání potravin. Zákonitosti růstu mikroorganismů v přírodním prostředí, vliv fyzikálních faktorů na růst mikroorganismů

Transkript

1 Mikrobiologické zkoumání potravin Zákonitosti růstu mikroorganismů v přírodním prostředí, vliv fyzikálních faktorů na růst mikroorganismů

2 Potravinářská mikrobiologie - historie 3 miliardy let vývoj prvních bakterií 3 miliony let první lidé let zemědělské společnosti NaCl a kouř konzervační prostředky let omezení výživy s ohledem na náboženské zákazy a zákony víno, olej a med jako konzervační prostředky 1810 ve Francii patentováno konzervování 1859 isolace kyseliny sorbové z oleje plodů jeřábu 1860 Pasteur definoval základy tepelných procesů 1861 patent na mražené ryby 1880 v Německu zavedena pasterizace mléka 1885 popsána E.coli 1888 isolována Salmonella 1892 E.coli jako indikátor fekálního znečištění vody 1896 bakterie Clostridium botulinum popsána 1960 popsán aflatoxin 1981 propuknutí listeriosy v USA 1983 popsán toxin Campylobacter jejuni 2007 epidemie Listeria monocytogenes

3 Bezpečnost potravin Nemoci způsobené potravinami jsou pravděpodobně nejrozšířenějším zdravotním problémem v současném světě a jsou vyznamnou příčinou ekonomických ztrát WHO

4 Potraviny nejsou sterilní!!!! Kontaminace člověkem Vzduch, půda, voda Potraviny Nakládání a příprava potravin konzumenty Výroba, zpracování, marketing

5 Definice růstu Růstem myslíme jednak zvyšování počtu jednotlivých mikroorganismů, případně zbytnění jednotlivých organel, a tím i zvětšování jednotlivého mikrobu. Když je mikroorganismus v uzavřeném prostoru, po několik málo generací roste počet živých buněk exponencionálně, brzy nastává stacionární fáze pro omezení nedostatkem výživy a prostoru. V otevřeném systému s nepřetržitým přísunem živin je exponenciální růst po delší dobu. Pro růst mikrorganismů je možné použít mnoho technik, kterými se mění nejen životaschopnost, ale i počet buněk včetně buněčné hmoty.

6 Růst u jednobuněčných organismů Pro jednobuněčné organizmy jako jsou bakterie, růst může být měřen jako dva různé parametry: změna (přírůstek) buněčné hmoty a změna počtu buněk. Metody měření buněčné hmoty (cell mass) Metody pro měření buněčné hmoty jsou jak přímé, tak nepřímé techniky. 1. Přímé fyzikální měření sušiny (dry weight) mokré hmoty (wet weight),nebo objem buněk po centrifugaci. 2. Přímé chemické měření některých chemických složek buněk, jako je celkový N, celkový protein, nebo celkový obsah DNA. 3. Nepřímé měření chemické aktivity jako je rychlost produkce nebo spotřeby kyslíku (O 2 ) produkce nebo spotřeba oxidu uhličitého - CO 2

7 Standardní růstová křivka Růstová křivka mikrobů v uzavřeném systému Stacionární fáze Počet živých buněk (log) Fáze exponenciálního růstu Degradační fáze Lag-fáze Čas

8 Log vynesení růstu

9 Výpočet růstové rychlosti Je-li počáteční počet buněk x 0, pak po uplynutí generační doby je počet buněk 2x 0 a po uplynutí n generačních dob je x = 2 n.x 0 Z toho lze vypočítat počet generačních dob nebo řečeno jinak počet generací :

10 Výpočet růstové rychlosti Zprůměrné rychlosti dělení vypočítáme závislost počtu vzniklých buněk na čase : x = x 0.2 r.t Tato závislost ukazuje, že počet vzniklých buněk je exponenciální funkcí času

11 Výpočet růstové rychlosti n = log x log x 0 log2 Růstová rychlost r, v našem případě počet generací v určitém časovém úseku t je r = n/t

12 Výpočet růstové rychlosti Z průměrné rychlosti dělení můžeme také vypočítat střední generační dobu, což je doba nutná pro vytvoření jedné generace: Τ = 1/r = Τ. log2 / log x/x 0 Derivací závislosti počtu vzniklých buněk podle časového úseku (=okamžitý přírůstek buněk) dostáváme :

13 dx dt Výpočet růstové rychlosti dx/dt = x 0.2 rt.r.ln2 = x.r.ln2 Jestliže si definujeme specifickou rychlost růstu jako : μ = r.ln2, dostáváme jednoduchou diferenciální rovnici : dx/dt = μ.x

14 Výpočet růstové rychlosti μ = lnx 2 lnx 1 / t 2 -t 1 ln - logaritmus naturalis

15 Výpočet růstové rychlosti Dobu zvojení T získáme ze vztahu ln2 = μ. T T = ln 2 / μ = 0,693 / μ

16 Výpočet růstové rychlosti

17 Obsah živin Koncentrace klíčových živin může do určité míry ovlivnit rychlost růstu mikroorganismů. Vztah mezi rychlostí růstu a koncentrací živiny je znám jako Monodova rovnice, je matematicky identický rovnicí Michaelis-Menten (enzymová kinetika) Odráží závislost mikrobiálního růstu na rychlost limitující enzymové reakci.

18 Monodova rovnice μ = μ ms / S +K s μ specifická růstová rychlost μ m maximální specifická růstová rychlost Skoncentrace limitujícího substrátu K s saturační konstanta

19 Výskyt mikroorganismů Půda Voda Atmosféra Rostliny Živé organismy (zvířata, lidé)

20 Mikroorganismy ve vodě Psychrofilní a psychrotrofní druhy Manipulační mikroflora Enterobacteriaceae Staphylococcus Kontaminace sladké a mořské vody

21 Bakterie ve vzduchu Gram pozitivní tyčinky a koky Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium, Streptomyces Kvantitativní stanovení Význam pigmentů Souvislosti s kažením potravin

22 Plísně ve vzduchu Penicillium, Aspergillus (nesmáčenlivé spory) Fusarium (smáčenlivé spory) Cladosporium herbarum Aktivní šíření spor

23 Mikroorganismy v půdě Nejbohatší výskyt všech typů mikroorganismů bakterie, kvasinky, plísně, protozoa, řasy Clostridium, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas, Actinomycetes, Streptococcus, Leuconostoc, Flavobacterium, Proteus

24 Mikroorganismy rostlin Běžně se vyskytující mikroorganismy: Cladosporium, Botrytis cinerea (plíseň), Aureobasidium pullulans ( černá kvasinka) Sporobolomyces, Bullera, Kloeckera apiculata, Pichia membranofaciens G-tyčinky: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus G+bakterie: Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bacillus

25 Člověk jako zdroj mikroorganismů Kůže Trávicí ústrojí Výkaly

26 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní : živiny, ph, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace

27 Vnitřní faktory I Limitace substrátem potraviny slouží jako zdroj živin a energie. Využití substrátu závisí na příslušných enzymech Koncentrace klíčových živin určuje rychlost růstu (Monod) ph a pufrační kapacita. Optimum většiny bakterií je mezi 6,0 8,0 ph, kvasinky 4,5 6,0, vláknité houby 3,5 4,0. Jiné bakterie rozkládají zeleninu a jiné ovoce

28 ph Bakterie slabě kyselé až slabě alkalické ph Kvasinky preferují kyselé prostředí Plísn sně tolerují velmi široké rozmezí

29 Vnitřní faktory II Redox potenciál, E h [oxidant] + H + + ne = [ reduktant] n-počet elektronů, e přenesených Živé organismy mají jasný řád přenosu elektronů a vodíku v elektrotransportním řetězci. Schopnost přijímat nebo darovat elektrony, t.j. oxidovat nebo redukovat je vyjádřena redox potenciálem E h.

30 Vnitřní faktory III Redox potenciál se měří inertní kovovou elektrodou, obvykle Pt, proti referenční externí elektrodě. Je-li rovnováha různých přítomných redox párů posunuta do oxidovaného stavu, pak bude tendence elektrony přijímat a tvořit pozitivní potenciál což znamená oxidační prostředí. Naopak, jestli systém bude elektrony vysílat jde o redukční prostředí. Tendence molekuly přijímat nebo vysílat elektrony je vyjádřena standardním redox potenciálem E 0.

31 Vnitřní faktory IV E (mv) ph Syrové maso (po porážce) ,7 Mleté syrové maso ,9 Vařené párky a konzerv. maso -20 až ,5 Pšenice, celá zrna -320 až ,6 Ječmen, šrot ,0 Bramborová hlíza ,0 Hruška ,2 Citron ,2

32 Redox potenciál - E h

33 Vnitřní faktory V Vodní aktivita a w Vyjadřuje poměr parciálního tlaku vodních par nad subtrátem, vztaženým ke tlaku vodních par nad destilovanou vodou. a w = 0.93 dolní hrańice bakterií 0.88 dolní hranice kvasinek 0,80 dolní hranice vláknitých hub 0,61 xerofilní houby

34 Aktivita vody - a w Snížen ení aktivity vody: odstranění využitelné vody sušením, uzením, odpařením, mražením zvýšení obsahu tuku zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) difuze vody z buňky do prostředí zastavení metabolizmu až smrt buňky

35 Aktivita vody - a w

36 Vnější faktory Relativní vlhkost množství vody v atmosféře Teplota Složení atmosféry kyslík 21%, inhibiční účinek oxidu uhličitého, ochranné balení do dusíku Čas

37 Složen ení atmosféry Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík) CO 2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

38 Čas Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek Vnitřní faktory Vnější faktory

39 Technologie překp ekážek Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat. I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.

40 Prediktivní mikrobiologie Vychází ze znalostí vnitřních a vnějších faktorů Predikce růstu Pravděpodobnostní modely Kinetické modelování

41 Predikce růstu r modelování typ zákusekz Počáte teční počet LM 10 4 CFU Teplota 20/10 C ph 7 a w 0,997

42 Mechanické vlivy Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou buněčnou stěnou a malými rozměry K destrukci buněk dochází: opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním (odolnost enzymů) ošetření vysokým tlakem třepání s abrazivním materiálem

43 Technologické faktory krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace