Vliv tepelných úprav kuřecích jater na změny obsahu biogenních aminů a polyaminů

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Vliv tepelných úprav kuřecích jater na změny obsahu biogenních aminů a polyaminů Diplomová práce Konzultant: prof. Ing. Pavel Kalač, CSc. Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc. Vypracovala: Bc. Michaela Sultana, roz. Pelikánová Brno 2014

2 Zadání

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Vliv tepelných úprav kuřecích jater na změny obsahu biogenních aminů a polyaminů vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

4 Poděkování Ráda bych poděkovala pracovníkům katedry aplikované chemie Zemědělské fakulty Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích za možnost spolupráce, zvláště pak panu prof. Ing. Pavlovi Kalačovi, CSc. za odborné vedení při zpracování diplomové práce, za jeho věnovaný čas a veškeré poskytnuté informace.

5 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá vlivem různých tepelných úprav (vaření, dušení, restování) kuřecích jater na změny obsahu biogenních aminů (BA) a polyaminů (PA). Dalšími sledovanými faktory byly vliv ročního období a způsob skladování kuřecích jater. Analytickou koncovkou pro stanovení BA a PA byla metoda kapalinové chromatografie s využitím techniky UPLC. Průměrný obsah biogenních aminů ve výchozím syrovém materiálu (šest vzorků chlazených a tři vzorky zmrazených jater) byl velice nízký s nejvyšším zastoupením histaminu (4,11 mg.kg -1 ). Tryptamin a fenylethylamin nebyly detekovány v žádném ze vzorků. Obsah polyaminů byl značně vyšší, s větším množstvím sperminu (135 mg.kg -1 ) než spermidinu (42,3 mg.kg -1 ). Celkový obsah BA a PA v sušině chlazených jater byl téměř dvakrát vyšší v létě než v zimě (P < 0,001). Obsah putrescinu a histaminu byl statisticky významně vyšší v játrech chlazených než mražených (P < 0,01). Naopak obsah kadaverinu a tyraminu byl vyšší v mražených játrech (P < 0,001). Obsah obou polyaminů byl o 20 % nižší v játrech mražených (P < 0,01). Restování mělo menší vliv na pokles BA (80 % původního obsahu) než vaření (65 % původního obsahu) (P < 0,001). Nejnižší obsahy obou PA byly zjištěny v játrech restovaných (70 % původního obsahu), zatímco dušením a vařením jejich obsah klesl přibližně na 80 % (P < 0,01). Klíčová slova: kuřecí játra, biogenní aminy, potravní polyaminy, tepelné úpravy, UPLC Abstract This thesis examined the effects of different cooking methods (boiling, stewing and roasting) on chicken liver in order to measure changes in the levels of biogenic amines (BA) and polyamines (PA). Two other factors were also considered, season and method of chicken liver storage. BA and PA levels were determined using a liquid chromatography method (UPLC). The mean level of BA in the original raw material (six and three samples of refrigerated and frozen livers, respectively) was very low, with the highest being histamine (4,11 mg.kg -1 ). Tryptamine and fenylethylamin were not detected in any of the samples. The level of PA was significantly higher than the level of BA, with more spermine (135 mg.kg -1 ) than spermidine (42,3 mg.kg -1 ). The total content of BA and PA in the dry matter of refrigerated livers was almost twice as high in the summer than in the winter (P < 0,001). When comparing refrigerated against frozen

6 livers, the levels of putrescine and histamine were significantly higher in the refrigerated liver (P < 0,01), while the levels of cadaverine and tyramine were higher in the frozen liver (P < 0,001), and the levels of spermine and spermidine were 20 % lower in the frozen liver (P < 0,01). Roasting had less of an effect in the decline of BA (80 % of the original content) than cooking (65 % of the original content) (P < 0,001). The lowest levels of spermine and spermidine were found in the roasted liver (70 % of the initial content) while stewing and cooking caused a decrease of approximately 80 % (P < 0,01). Key words: chicken livers, biogenic amines, dietary polyamines, heating methods, UPLC

7 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Charakteristika a metabolismus biogenních aminů Základní charakteristika Vznik biogenních aminů Rozdělení biogenních aminů Reakce a změny biogenních aminů Zdroje biogenních aminů Biologické účinky biogenních aminů a polyaminů PA a rakovina Vliv PA na trávicí trakt Další účinky Toxikologie biogenních aminů Detoxikační systém Toxické účinky Hygienické limity Obsah biogenních aminů a polyaminů v potravinách Maso a vnitřnosti MATERIÁL A METODIKA Odběr vzorků Kuchyňské úpravy Vaření Dušení Restování Analýza vzorků Použité chemikálie, přístroje a zařízení Stanovení sušiny Stanovení BA a PA metodou UPLC Statistické vyhodnocení dat VÝSLEDKY A DISKUSE Obsah BA a PA v kuřecích játrech Vliv kuchyňských úprav na obsah BA a PA v kuřecích játrech Vliv ročního období na obsah BA a PA v kuřecích játrech Vliv skladovacích teplot na obsah BA a PA v kuřecích játrech ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK... 59

8 1 ÚVOD Biogenní aminy jsou organické sloučeniny odvozené od aminokyselin, které se vyskytují prakticky ve všech potravinách jako běžné produkty metabolismu. Histamin, tyramin, fenylethylamin, kadaverin a putrescin vznikají v potravinách především bakteriální dekarboxylací volných aminokyselin. V mase a vnitřnostech vznikají hlavně působením kontaminující mikroflóry během skladování. Biogenní aminy mají řadu nežádoucích zdravotních účinků a představují určité riziko pro zdraví konzumenta, mohou však být využívány jako indikátory stupně kažení a kvality některých potravin. Obsah tzv. pravých polyaminů, spermidinu a sperminu, bývá vyšší v potravinách živočišného původu než v potravinách původu rostlinného. Vysoké hladiny sperminu a spermidinu jsou typické pro mladé a metabolicky aktivní tkáně. Jejich nejvyšší koncentrace se nacházejí například v játrech a ledvinách různých jatečných zvířat. Polyaminy vykazují škálu biologických účinků. Podílejí se hlavně na dělení a růstu buněk. Jejich vysoký příjem potravou je žádoucí při léčení ran a popálenin. Jejich příjem je však třeba omezit u pacientů s nádorovým onemocněním. Játra hospodářských zvířat mají vysoký obsah polyaminů, především sperminu. Změny obsahu polyaminů při různých tepelných úpravách byly zatím zkoumané na mase a například vepřových játrech. Pro kuřecí játra jsou zatím dostupné pouze údaje o obsahu polyaminů po porážce. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vypracovat literární rešerši o biogenních aminech a polyaminech a vlivu tepelných úprav na změny jejich obsahu v mase a vnitřnostech. Cílem praktické části bylo zjistit změny obsahu biogenních aminů a polyaminů způsobené dušením, vařením a restováním kuřecích jater v chlazeném a mraženém stavu v různých ročních obdobích. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika a metabolismus biogenních aminů Základní charakteristika Biogenní aminy (BA) jsou skupinou alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází odvozených od aminokyselin, které vykazují různé biologické účinky. Vyskytují se v živočišných tkáních i rostlinných pletivech, kde vykonávají řadu důležitých funkcí. Příliš vysoké hladiny biogenních aminů v potravinách jsou však známkou kažení a mohou vést až k otravám (Velíšek a Hajšlová, 2009) Vznik biogenních aminů Biogenní aminy vznikají z aminokyselin působením dekarboxylas, které obsahují jako kofaktor pyridoxal-fosfát nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transaminas. Tzv. endogenní biogenní aminy jsou jako produkty metabolismu v nízkých koncentracích přirozeně obsaženy prakticky ve všech potravinách. Tzv. exogenní biogenní aminy vznikají v potravinách v důsledku mikrobiální kontaminace a při kvasných procesech (Velíšek a Hajšlová, 2009). Pro vznik biogenních aminů v potravinách musí být splněny tři základní podmínky: přítomnost volných aminokyselin jako prekursorů v substrátu (potravině), přítomnost mikroorganismů s dekarboxylasovou aktivitou, vhodné podmínky pro růst a množení mikroorganismů. Tvorba biogenních aminů v potravinách závisí také na aktivitě mikrobiálních dekarboxylačních enzymů. Ta je ovlivněna mnoha faktory jako je teplota, doba skladování, aktivita vody, ph, redoxní potenciál nebo obsah solí (Komprda, 2004). 10

11 3.1.3 Rozdělení biogenních aminů Podle chemické struktury se nejvýznamnější biogenní aminy dělí na: aromatické: tyramin (TYM) a 2 fenylethylamin (PEA) heterocyklické: histamin (HIM) a tryptamin (TRM) alifatické diaminy: putrescin (PUT) a kadaverin (CAD) polyaminy: spermidin (SPD), spermin (SPM) a agmatin (AGM) Tab.1 Prekursory, klasifikace a chemická struktura biogenních aminů Prekursor Biogenní amin Klasifikace Chemická struktura histidin histamin heterocyklická, monoamin tryptofan tryptamin heterocyklická, monoamin fenylalanin fenylethylamin aromatická, monoamin tyrozin tyramin aromatická, monoamin lysin ornithin, arginin, agmatin putrescin, spermin putrescin, spermidin kadaverin putrescin spermidin spermin alifatická, diamin alifatická, diamin alifatická, polyamin alifatická, polyamin 11

12 Diaminy se někdy zjednodušeně řadí mezi polyaminy a heterocyklické aminy se mohou řadit do skupiny aromatických. Putrescin, spermidin a spermin byly a někdy ještě jsou tradičně zařazované mezi BA. Od 90. let minulého století jsou klasifikovány jako samostatná skupina. Díky jejich specifické biologické aktivitě v eukaryotických buňkách jsou označovány jako fyziologické polyaminy. Podle struktury je putrescin diamin. Řadí se však jak mezi klasické BA, tak mezi polyaminy, protože je prekurzorem pro vznik sperminu a spermidinu (Kalač a Krausová, 2005) Reakce a změny biogenních aminů BA jsou reaktivní látky. Jejich enzymové reakce vedou k derivátům biogenních aminů a dalším sloučeninám. Kromě toho mohou oxidativní deaminací poskytovat aldehydy. Za zvýšené teploty nebo dlouhodobým skladováním reagují s triacylglyceroly za vzniku amidů mastných kyselin. Stejně jako ostatní aminosloučeniny BA vstupují do reakcí neenzymového hnědnutí, kde vznikají příslušné iminy jako primární reakční produkty. Iminy vznikají také oxidací aminů, např. peroxidem vodíku nebo hydroperoxidy lipidů. Sekundární aminy (zejména SPM a SPD) mohou tvořit karcinogenní nitrosaminy reakcí s oxidy dusíku. V alkoholických nápojích vznikají reakcí tryptaminu s aldehydy deriváty β-karbolinu (Velíšek a Hajšlová, 2009) Zdroje biogenních aminů Polyaminy (PA) jsou tvořeny de novo biosyntézou jako fyziologické polyaminy, zatímco BA vznikají nespecifickou bakteriální dekarboxylací aminokyselin (Kalač a Krausová, 2005). Základními zdroji polyaminů v lidském těle jsou: endogenní (de novo) biosyntéza, produkce střevní mikroflórou, příjem potravou. S potravou se do organismu dostává více polyaminů než endogenní biosyntézou. Proto je důležité znát obsahy polyaminů v potravinách a nápojích (Kalač, 2009). 12

13 Endogenní biosyntéza Obsah polyaminů v buňce je regulován dvěma klíčovými enzymy ornithindekarboxylasou (ODC) a S-adenosylmethionindekarboxylasou (AdoMetDC) (Kalač, 2009). Polyaminy v buňkách jsou syntetizovány z ornithinu. Dekarboxylací ornithinu ornithindekarboxylasou vzniká putrescin. Methioninadenosyltransferasa katalyzuje přeměnu methioninu na S-adenosylmethionin. Dekarboxylační činností AdoMetDC vzniká propylaminová skupina z S-adenosylmethioninu. Následná adice aminopropylové skupiny na putrescin vede k syntéze spermidinu. Přeměna putrescinu na spermidin probíhá za účasti enzymu spermidinsyntasy. Další adice aminopropylové skupiny vytváří spermin. Syntézy sperminu se účastní enzym sperminsyntasa. Hlavními prekurzory polyaminů v buňce jsou tedy aminokyseliny methionin a ornithin. (Thomas a Thomas 2003; Moinard a kol., 2004). Schéma biosyntézy PA ukazuje obr. 1 (Hillary a Pegg, 2003). Dříve se předpokládalo, že buňky kryjí svoji potřebu PA vlastní syntézou. Bylo však prokázáno, že lidský organismus využívá i PA z potravy, které ukládá jako rezervu ve svalech a kůži (Křížek a Kalač, 1998). Obr. 1 Schéma endogenní biosyntézy polyaminů (Hillary a Pegg, 2003) 13

14 Produkce střevní mikroflórou Významným místem pro tvorbu polyaminů je gastrointestinální trakt. Bakterie čeledi Enterobacteriaceae a rodu Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Klebsiella, Morganella a Proteus jsou schopné dekarboxylovat aminokyseliny z potravy za vzniku příslušných BA (Teti a kol., 2002) Katabolismus Ve zdravých buňkách je obsah polyaminů regulován i katabolickými enzymy, které umožňují zpětnou konverzi sperminu na putrescin. Hlavními enzymy pro zpětnou konverzi jsou spermidin/spermin acetyltransferasa, polyaminooxidasa a případně diaminooxidasa (Thomas a Thomas, 2003). 3.2 Biologické účinky biogenních aminů a polyaminů Biogenní aminy, zejména HIM, TYM a polyaminy PUT, SPD a SPM jsou u živočichů potřebné pro řadu fyzilologických funkcí. Při nadměrném příjmu potravou však mohou některé BA vyvolávat projevy otravy (Křížek a Kalač, 1998). BA mohou ovlivňovat řadu procesů probíhajících v organismu, a to např. regulaci tělesné teploty, příjem potravy, krevní tlak, alergie. BA jsou také zdroji dusíku a prekurzory pro syntézu hormonů, alkaloidů, nukleových kyselin a proteinů. HIM má vliv na krevní tlak a sekreci žaludeční šťávy. TYM také ovlivňuje krevní tlak a kontrakci hladkého svalstva. Některé aminy jako TYM, PUT, CAD a SPD mohou zneškodňovat volné radikály, mají tedy antioxidační účinky (Kohajdová a kol., 2008). Funkci polyaminů napovídá už jejich chemická struktura. Za fyziologickéo ph jsou aminoskupiny kladně nabity. Tvoří tak kationty se 2, 3, či 4 kladnými náboji u PUT, SPD či SPM, které se silně váží na polyanionické molekuly jako jsou DNA a RNA. V jádře buněk se podílejí na transkripci DNA (Agostinelli a kol., 2009; Thomas a Thomas, 2003). V buňkách jsou polyaminy vázány také na fosfolipidové membránové struktury, a tak ovlivňují aktivitu iontových kanálů. Mají vliv i na aktivitu některých receptorů jako např. receptory pro růstové faktory. Z toho vyplývá, že polyaminy ovlivňují buněčnou diferenciaci a proliferaci a účastní se signalizace mezi buňkami. Jejich nahromadění v buňce však může vyvolat apoptosu. Příčinou je pravděpodobně 14

15 zvyšování oxidačního stresu, kdy se hromadí peroxid vodíku vznikající katabolismem polyaminů (Moinard a kol., 2004) PA a rakovina Při nádorovém bujení se projevuje zvýšená spotřeba PA. Díky jejich účasti na růstu buněk se PA akumulují v nádorové tkáni. U pacientů s rakovinou je zvýšený obsah PA také v tělních tekutinách. Látky, které inhibují biosyntézu PA, mohou předejít rakovině a mohou být také použity pro léčebné účely. Mezi tyto zkoumané chemopreventivní nebo antineoplastické činitele patří inhibitory ornithindekarboxylasy a strukturní analogy a deriváty polyaminů (Kalač, 2009). Strukturní analogy nahrazují přirozené PA v buňce. Tyto analogy však nejsou schopné zajistit funkce přirozených PA. Následkem je selhání buněčného metabolismu a smrt buňky (Thomas a Thomas, 2003). Aminooxidasy jsou hlavími enzymy metabolismu BA. Jsou považovány za biologické regulátory, a to zejména pro růst a diferenciaci buněk. Aminooxidasy se podílejí na inhibici růstu rakovinných buněk. Vedlejší produkty oxidace polyaminů jako aldehydy, peroxid vodíku a jiné reaktivní formy kyslíku vedou ke změnám redoxních dějů. Jejich cytotoxický efekt se projeví poškozením buněčné membrány a jádra nebo modulací membránové permeability vedoucí k apoptose. Ovšem oxidační produkty BA jsou i karcinogenní. Akrolein, který vzniká při oxidaci SPD a SPM, je jak karcinogenní, tak cytotoxický. Rovnováha mezi aminooxidasami a antioxidačními enzymy je tedy rozhodující pro inhibici či rozvoj rakoviny. Dlouhotrvající nerovnováha mezi těmito enzymy působí karcinogenně, zatímco v krátkodobém měřítku jsou aminooxidasy cytotoxické pro nádorové buňky (Toninello a kol., 2006; Thomas a Thomas, 2003). Nádorové buňky jsou schopné vychytávat extracelulární PA jak z potravy, tak PA syntetizované střevními bakteriemi. Tímto způsobem dokáží tlumit efekt chemoterapeutik. V 90. letech proto začal výzkum zaměřený na omezení růstu nádorů snížením příjmu potravních (exogenních) polyaminů. Tento přístup spolu s inhibicí polyaminů v nádorových buňkách se jeví jako slibný (Kalač, 2009) Vliv PA na trávicí trakt Polyaminy přijímané potravou hrají důležitou roli při vývoji a růstu trávicího traktu novorozenců. U dospělých jsou polyaminy nutné pro udržení normálního růstu a vlastností zažívacího traktu (Kalač, 2009). 15

16 Potravinové alergie mohou být způsobené abnormální střevní propustností makromolekul a nedostatečnou zralostí imunitního systému v submukose. Polyaminy upravují propustnost střevní stěny a vyvolávají zrání některých střevních imunitních komponent. Exogenní PA tedy hrají důležitou roli v prevenci potravinových alergií (Iyngkaran a Yadav, 1987). Polyaminy jsou za normálních podmínek důležitými stimulanty růstu sliznice gastrointestinálního traktu. Byl zkoumán vliv deficitu PA u normálně rostoucích potkanů dietou s velice nízkým obsahem polyaminů. Po prvním týdnu došlo jen k malým změnám v gastrointestinálním traktu týkajícím se enzymů jako sacharasa, maltasa a laktasa. Po dvou měsících byly vyvolány především významné změny v obsahu RNA ve sliznici jejuna, jater, ledvin a plic. Šest měsíců této diety vyústilo v hypoplazii sliznice tenkého i tlustého střeva (Deloyer a kol., 2001). Podání polyaminů, hlavně sperminu, zvýšilo rychlost léčení žaludečních vředů vyvolaných stresem u potkanů (Wang a Johnson, 1990) Další účinky Polyaminy mají antioxidační účinky, kterými se podílejí na redukci poškozování buněčných membrán a DNA. PA likvidují hydroxylové radikály. SPD a SPM potlačují singletový kyslík a peroxid vodíku. PA inhibují oxidaci polyenových mastných kyselin. Spermin je schopný regenerace tokoferolu z tokoferoxylového radikálu prostřednictvím vodíkového donoru z aminoskupiny. Sperminový radikál potom váže peroxidové radikály do komplexů. V porovnání se známými antioxidanty jako je vitamin C či vitamin E jsou však velice neefektivními zhášeči volných radikálů (Fujisawa a Kadoma, 2005; Kohajdová a kol., 2008). Zvýšený příjem polyaminů má příznivý efekt na hojení ran a pooperční stav pacientů (Kalač a Krausová, 2005). Toto se ovšem netýká pooperačních stavů pacientů s nádorovými onemocněními. 3.3 Toxikologie biogenních aminů Detoxikační systém Ve střevním traktu savců působí účinný detoxikační systém. Hlavní roli zde hrají enzymy monoaminooxidasa (MAO) a diaminooxidasa (DAO). Tyto enzymy však mají 16

17 jen určitou kapacitu. Dokáží metabolizovat normální příjem BA potravou. Nadměrný příjem BA, který se může projevit již u potravin bez senzorických projevů kažení, přesahuje kapacitu těchto enzymů. Detoxikační schopnost každého organismu je velice individuální a zhoršuje se při některých onemocněních. Aktivitu enzymů snižuje i alkohol a některé léky, tzv. inhibitory MAO (MAOI). Nejvýraznějšími inhibitory MAO jsou zejména klasická antidepresiva (Deshpande, 2002; Křížek a Kalač, 1998) Toxické účinky Nejvýznamnějšími biogenními aminy z hlediska jejich zdravotního rizika jsou tyramin, histamin, 2-fenylethylamin, kadaverin a putrescin. Nejvíce studovány jsou tyramin a zejména histamin (Sládková a kol., 2007). Z hlediska značných individuálních rozdílů v detoxikační schopnosti organismu je obtížné stanovit nejvyšší přijatelné koncentrace jednotlivých aminů. Püssa (2008) například uvádí, že k vyvolání projevů intoxikace musí být přijato alespoň mg histaminu v jednom jídle. FAO a WHO (2013) uvádějí, že k intoxikaci může dojít u zdravých jedinců již při příjmu od 90 mg histaminu. Hodnota jednorázové neškodné dávky (NOAEL) u histaminu byla stanovena na 50 mg. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) (2011) také navrhl bezpečné limity pro HIM a TYM. Pro zdravé jedince je to max. 50 mg HIM v jednom jídle. Zdraví jedinci mohou přijmout 600 mg TYM v jednom jídle, ale pacienti užívající MAOI třetí generace pouze 50 mg TYM a uživatelé klasických MAOI 6 mg TYM v jednom jídle. Toxicita polyaminů byla prokázána u potkanů při požití 600 mg.kg -1 tělesné hmotnosti. S potravou však nemůže být přijato tak velké množství PA (Kalač, 2009). Sekundární aminy (SPD, SPM) mohou tvořit nitrosaminy reakcí s dusitany a vytvářet tak karcinogenní sloučeniny. N-nitrososloučeniny mohou vznikat interakcí aminosloučenin s nitrosačními činidly jako dusitany a oxidy dusíku, a to během skladování, konzervace a vaření potravin. Reakce nitrosačních činidel s primárními aminy vede k tvorbě alkylačních produktů s krátkou životností. Reagují s ostatními složkami potravin a jsou zbavovány toxického účinku. Nitrosace sekundárních aminů vede k tvorbě stabilních N- nitrososloučenin. Terciární aminy tvoří nestabilní N-nitrosoprodukty. Jako potenciální karcinogeny se uvádějí PUT a CAD. Zahříváním PUT může vznikat pyrrolidin a z CAD piperidin. Z nich se působením tepla vytvářejí N- nitrosopyrrolidin a N-nitrosopiperidin (Kohajdová a kol., 2008). 17

18 Toxicita histaminu K otravě histaminem dochází, pokud nefunguje správně regulační a detoxikační systém histaminu, pokud konzument přijal příliš mnoho inhibitorů metabolismu histaminu (alkohol, některá antidepresiva), nebo pokud byl vysoký obsah histaminu v potravě (Püssa, 2008). Histamin účinkuje vazbou na membránové receptory H1, H2, H3 a H4 v cílových buňkách v různých tkáních. Jeho efekt se projevuje v respiračním, kardiovaskulárním, gastrointestinálním a hematoimunologickém systému a na kůži. Nejčastější symptomy intoxikace jsou spojeny s kardiovaskulárním systémem. Způsobuje patologické rozšíření krevních cév se svěděním kůže (kopřivka), tachykardii, arytmii a změny krevního tlaku. HIM zvyšuje permeabilitu cév a sekreci hlenu. Velmi časté jsou silné bolesti hlavy. Může se objevit nevolnost, slabost, pálení v puse a krku a dysfagie. Kontrakce hladkého svalstva v gastrointestinálním traktu mohou způsobit zvracení, průjem a křeče v břiše. Bolest a svědění může být zapříčiněno stimulací senzorických a motorických neuronů histaminem (Püssa, 2008; Maintz a Novak, 2007). Na obr. 2 je zobrazeno podrobné schéma účinků histaminu v závislosti na receptoru, na který se histamin váže (Maintz a Novak, 2007). K otravám histaminem dochází nejčastěji v zemích s vysokou konzumací mořských ryb. Pak se jedná o tzv. skombrotoxikosu. Intoxikace se projeví okamžitě nebo do půl hodiny a většinou trvá 3 hodiny až několik dní. Nejčastějšími původci skombrotoxikosy jsou tuňák, makrela, sardinky a ančovičky. Tyto druhy ryb mají ve svalovině značný obsah volného, tzn. v bílkovinách nevázaného histidinu. Při nedokonalém vychlazení ryb po vylovení podléhá tento volný histidin rychlé a účinné bakteriální dekarboxylaci. Hlavní bakterie, které vyvolávají tvorbu histaminu ve svalovině ryb a způsobují tak otravu, jsou z čeledi Enterobacteriaceae. Nejčastěji je to Morganella morganii a Klebsilla pneumoniae (Püssa, 2008). V roce 2011 zjistila Státní zemědělská a potravinářská inspekce několikanásobné překročení povoleného limitu pro histamin v sardinkách původem z Estonska. Do oběhu v ČR se dostalo 9216 kg tohoto zboží. V létě 2012 bylo do ČR doručeno 90 kg mražených steaků tuňáka ze stejné šarže, která způsobila zdravotní problémy u konzumentů v Belgii (Duben, 2012). Prester (2011) podává informace o otravách histaminem z ryb v různých zemích v posledním desetiletí. 18

19 Obr. 2 Schéma účinků histaminu (Maintz a Novak, 2007) Histamin může být metabolizován dvěma způsoby, a to oxidativní deaminací pomocí DAO, nebo pomocí histamin-n-methyltransferasy (HNMT). Jestli je histamin katabolizován DAO nebo HNMT, závisí na jeho lokalizaci. DAO protein je uložen ve vezikulárních strukturách spojených s plasmatickou membránou epitelových buněk a po stimulaci je vylučován do krevního oběhu. DAO tedy mohou být zodpovědné za inaktivaci extracelulárního histaminu (např. po požití potravin bohatých na histamin). Naproti tomu HNMT je cytosolický protein, který může konvertovat histamin pouze v intracelulárním prostoru buněk. To znamená, že tyto enzymy nesoutěží o substrát i přes to, že mají podobnou afinitu k histaminu. U savců je nejvyšší aktivita DAO v tenkém a tlustém střevě, v placentě a ledvinách. Snížená aktivita DAO může být ukazatelem poškození střevní sliznice při zánětlivých a nádorových onemocněních a u osob 19

20 podstupujících chemoterapii. HNMT je považován za klíčový enzym pro degradaci histaminu v bronchiálním epitelu. Je exprimován také v ledvinách, játrech, slezině, tlustém střevě, prostatě, vaječnících a v průduškách (Maintz a Novak, 2007). Obr. 3 Schéma metabolismu histaminu (Maintz a Novak, 2007) Asi 1% populace trpí tzv. histaminovou intolerancí. Příznaky intolerance jsou téměř totožné s příznaky otravy, jsou však vyvolány i nízkým množstvím přijatého histaminu. Příčinou vzniku histaminové intolerance může být endogenní nadprodukce histaminu způsobená například alergií. Hlavním důvodem je však narušená enzymatická degradace histaminu způsobena genetickou nebo získanou vadou funkce DAO či HNMT (Hayder a kol., 2011; Maintz a Novak, 2007). 20

21 Toxicita tyraminu Na začátku šedesátých let minulého století si britský neurolog Barry Blackwell začal všímat souvislostí mezi konzumací sýrů a následnou nevolností s bolestmi hlavy a hypertenzí u pacientů užívajících inhibitory MAO (konkrétně antidepresivum tranylcypromin). V roce 1963 poprvé popsal tyto vedlejší účinky u dvanácti pacientů (Blackwell, 1963). Stejné symptomy měli i pacienti po konzumaci kvasnicového extraktu. Další studie prokázaly zodpovědnost tyraminu za tyto účinky (Blackwell a Mabbitt, 1965; Blackwell a kol., 1967). Příjem 500 mg tyraminu v jednom jídle může zvýšit systolický tlak o 30 mmhg u zdravých mužů. U žen stačí k dosažení stejných účinků i nižší dávka, protože jsou na tyramin obecně citlivější. Přebytek tyraminu v gastrointestinálním traktu může vést k jeho vstupu do systémové cirkulace. TYM působí na adrenergní nervová zakončení jako nepřímé sympatomimetikum, a tak zvyšuje přítomnost noradrenalinu na příslušných receptorech (Ladero a kol., 2010). To vede k dočasnému zvýšení krevního tlaku, bolesti hlavy, nevolnosti a zvracení. U pacientů užívajících inhibitory MAO může TYM vyvolat hypertenzní krizi (krevní tlak nad 180/120 mmhg) se silnými bolestmi hlavy, krvácením do mozku i selháním srdce (Křížek a Kalač, 1998; Sathyanarayana Rao a Yeragani, 2009). TYM může mít mimo jiné i vliv na střevní mikroflóru. Zvyšuje přilnavost enteropatogenu E. Coli O157:H7 k buňkám epitelu. Zvýšená hladina TYM v mozku bývá spojována s neurologickými poruchami, jako schizofrenie, Parkinsonova choroba a deprese (Ladero a kol., 2010) Hygienické limity Je velice obtížné stanovit maximální hodnoty pro obsah biogenních aminů v potravinách, a to z několika důvodů. Značné individuální rozdíly v detoxikačních schopnostech organismu jsou jedním z nich. Absorpce, metabolismus a účinnost jednoho BA mohou být modifikovány přítomností jiných BA. Proto má starší vyzrálý sýr výraznější toxické účinky než ekvivalentní množství histaminu ve vodném roztoku (Ladero a kol., 2010) 21

22 Jediným BA, pro který jsou v současné době stanoveny maximální limity v EU a v USA, je histamin. Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny stanovuje legislativní limit pro histamin u produktů rybolovu z druhů ryb spojovaných s vysokým množstvím histidinu a u produktů rybolovu, které byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku a byly vyrobeny z těchto druhů ryb. Jedná se o ryby čeledi Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatomidae a Scombresosidae. U sedmi vzorků z devíti z určité šarže musí být dodržen limit 100 mg.kg -1 a zbylé dva vzorky mohou obsahovat do 200 mg.kg -1 histaminu. V případě rybích produktů ošetřených enzymatickým zráním v láku platí limit do 200 mg.kg -1 u sedmi z devíti vzorků a dva mohou obsahovat do 400 mg.kg -1 histaminu. V některých zemích se uvádí limit 2 mg.l -1 histaminu v importovaných alkoholických nápojích. Pro ostatní potraviny nejsou stanoveny limity BA s tím, že koncentrace od 1000 mg.kg -1 jsou obecně považovány za velice nebezpečné (Ladero a kol., 2010; Kvasničková, 2011). 3.4 Obsah biogenních aminů a polyaminů v potravinách Biogenní aminy se vyskytují prakticky ve všech potravinách jako běžné produkty metabolismu. Vyšší množství BA se nachází ve fermentovaných výrobcích, jako jsou sýry, trvanlivé salámy, kysané zelí, víno, pivo atd., kde vznikají mikrobiální činností. V rybách a v mase vznikají hlavně působením kontaminující mikroflóry během skladování. Vysoké koncentrace BA se nacházejí v potravinách v pokročilém stupni kažení (Velíšek a Hajšlová, 2009). BA tedy představují určité riziko pro zdraví konzumenta, mohou však být využívány jako indikátory stupně kažení a kvality některých potravin. Nejvíce případů otrav biogenními aminy je způsobeno konzumací sýrů a ryb (Ruiz-Capillas a Jiménez-Colmenero, 2004). Obsah histaminu v některý druzích ryb a sýrů se může pohybovat i okolo mg.kg -1. Nejvyšší koncentrace tyraminu se nacházejí v mase a v sýrech. Dlouhozrající sýr vyrobený ze syrového mléka může obsahovat i přes 1000 mg.kg -1 (Ladero a kol., 2010). Obsah polyaminů bývá vyšší v potravinách živočišného původu než v potravinách rostlinného původu. PUT je produkován činností bakterií a jeho vysoké množství v potravinách živočišného původu je spojováno s nevhodným ošetřením 22

23 potravin. Vysoké hladiny polyaminů SPD a SPM jsou typické pro mladé a metabolicky aktivní tkáně. Jejich nejvyšší koncentrace se nacházejí například v játrech a ledvinách různých jatečných zvířat (Kalač a kol., 2005). Dalšími uváděnými potravinami s vysokým množstvím polyaminů bývají citrusové plody (pomeranč, mandarinka, grapefruit), ovocné džusy, kyselé zelí, sýr a sójová omáčka. Tyto potraviny jsou bohaté na putrescin. Vysoký obsah spermidinu bývá v sušených sójových bobech a výrobcích ze sóji, v hrášku, kukuřici, v sýrech s modrou plísní, brokolici a květáku. Kromě masa a masných výrobků je spermin hojně zastoupený v některé zelenině (dýně) a v sýrech (Atiya Ali a kol., 2011; Eliassen a kol., 2002). Průměrný příjem polyaminů ve stravě je μmol/os/den. Vyšší celkový příjem polyaminů (700 μmol/os/den) v Evropě je kolem Středozemního moře, zatímco na severu Evropy se příjem polyaminů pohybuje kolem μmol/os/den. Rozdíly ve struktuře potravin a příjmu polyaminů jsou spojeny s rozdíly v incidenci chronických onemocnění. Právě dieta oblasti Středozemního moře je známá pro své ochranné účinky. Antioxidační efekt polyaminů by mohl hrát důležitou roli v prevenci chronických onemocnění (Atiya Ali a kol., 2011) Maso a vnitřnosti Hlavními biogenními aminy v mase a rybách bývají histamin, kadaverin, putrescin a tyramin (Velíšek a Hajšlová, 2009). Volné aminokyseliny hrají hlavní roli ve vzniku aminů v mase. Jsou jejich prekurzory a tvoří substrát pro růst mikroorganismů. S proteolytickými procesy se zvyšuje koncentrace BA. Čerstvé maso obsahuje jen minimum těchto BA. Zvýšené obsahy se zjišťují při nedodržení hygieny a při nevhodném skladování. Naproti tomu SPD a SPM jsou přirozené polyaminy běžně se vyskytující v mase. Obsah SPD v mase je však nízký ve srovnání s hladinami SPM. Při technologickém zpracování a skladování masa je třeba zajistit takové podmínky, které eliminují mikrobiální kontamici a vznik BA (Ruiz-Capillas a Jiménez-Colmenero, 2004). Vinci a Antonelli (2002) uvedli, že BA jsou indikátory kažení červeného (hovězího) i bílého (kuřecího) masa. Konkrétně koncentrace CAD rostla nejvíce u obou typů masa a mohla by být použita k monitorování kažení masa. U červeného masa byl značný nárůst i koncentrace TYM, a to po 15 dnech skladování. Obecně bylo pozorováno, že koncentrace BA rostly dříve a rychleji u kuřecího masa, které má kratší svalová vlákna a může být snadněji napadeno proteolytickými enzymy. 23

24 Kuřecí maso Čerstvé kuřecí maso může být označeno za potravinu s vysokým obsahem SPD a hlavně SPM. Ještě větší obsah těchto polyaminů se nachází v kuřecích játrech a srdci (Kozová a kol., 2009a). Obsah některých aminů v kuřecím mase ukazuje tabulka 2. Silva a Glória (2002) sledovali obsah BA v čerstvém kuřecím mase. Za normálních fyziologických podmínek je přítomnost SPD a SPM v mase běžná (tab. 2). V kuřecích stehnech bylo zanedbatelné množství HIM. Ostatní BA byly v čerstvém kuřecím mase pod hranicí detekce. Koncentrace PUT, CAD, HIM a TYM rostly během skladování při 4 C. Po 15 dnech skladování byl obsah těchto aminů zřetelně vyšší v prsní svalovině v porovnání se stehenní. Obsah SPM se během skladování snižoval a obsah SPD zůstal konstantní. Degradace SPM může být způsobená mikroorganismy, které využívají tento polyamin jako zdroj dusíku. Rosinska a Lehotay (2014) zjišťovali vliv doby skladování a různých teplot na produkci BA v kuřecím, vepřovém a hovězím mase. Skladováním při 24 C rostl obsah BA (CAD, TYM, PUT, HIM) nejrychleji právě v kuřecím mase. Po 10 dnech skladování byl obsah BA v kuřecím mase až třikrát vyšší než v mase vepřovém či hovězím. Kozová a kol. (2009a) uvedli, že čerstvé kuřecí maso obsahuje vyšší množství SPD než maso vepřové či hovězí. V kuřecích játrech je velmi vysoké množství SPD a hlavně SPM (tab. 2). Krausová a kol. (2006a) uvádějí, že obsah SPD v kuřecích játrech je dvakrát větší než v játrech vepřových, ale několikrát nižší než v játrech mladých býčků a krav. Tepelné úpravy kuřecího masa za vyšších teplot (pečení: C, smažení: 180 C, grilování: 215 C) způsobily větší ztráty SPM a SPD (až o %) než vaření a dušení při 97 C (Kozová a kol., 2009a). 24

25 Tab.2 Obsah aminů v čerstvém kuřecím mase a vnitřnostech Kuřecí maso PUT HIM SPD SPM Literatura (mg.kg -1 ) (mg.kg -1 ) (mg.kg -1 ) (mg.kg -1 ) stehna ND 0,7 7,2 16,2 Silva a Glória (2002) prsa ND ND 7,3 17,9 Silva a Glória (2002) křídla 0,7-9,3 23,2 Cipolla a kol. (2007) prsa - - 4,8 36,8 Kozová a kol. (2009a) stehna ,2 38 Kozová a kol. (2009a) játra ,7 133 Kozová a kol. (2009a) srdce ,1 82,7 Kozová a kol. (2009a) játra 4,4-56,9 119,6 Krausová a kol. (2006a) Pozn.: PUT putrescin, HIM histamin, SPD spermidin, SPM spermin, ND obsah pod mezí detekce Vepřové maso Obsah polyaminů v čerstvém vepřovém mase a vnitřnostech je uveden v tabulce 3. Obsah PUT v čerstvém mase je většinou pod hranicí detekce. Vyšší hodnoty byly detekovány pouze u masa zpracovaného za špatných hygienických podmínek nebo za nevhodných skladovacích podmínek. Zvýšený obsah PUT je častý také u mletého masa, které snáze a rychleji podléhá mikrobiální kontaminaci (Kalač, 2006). Krausová a kol. (2008) uvádějí, že obsah PUT byl pod hranicí detekce u vepřové pečeně dlouhodobě skladované při 18 C. Během chladírenského skladování při 3 C a při různých způsobech balení nebyl PUT detekován ve vepřové pečeni ani po 21 dnech. Obsah SPD u čerstvého vepřového masa nepřesahuje 5 mg.kg -1.Obsah SPM je běžně vyšší a většinou v rozmezí mg.kg -1 (Kalač, 2006). Obsah plyaminů ve vepřových játrech je téměř srovnatelný s jejich obsahem v játrech kuřecích. Obsah SPM převládá nad obsahem SPD, jehož množství je však u vepřových jater přibližně poloviční v porovnání s kuřecími (Krausová a kol., 2006a). Paulsen a Bauer (2007) sledovali vliv tepelných úprav na obsah BA u vepřového masa. Uvedli, že maximální úbytek SPM a SPD během různých tepelných úprav byl 26%, zatímco úbytek CAD, HIM, PUT a TYM bývá více než 50%. Krausová a kol. (2007) uvádí úbytek SPD a SPM o 30 40% během různých tepelných úprav vepřových jater. 25

26 Tab.3 Obsah polyaminů v čerstvém vepřovém mase a vnitřnostech Vepřové maso SPD SPM Literatura (mg.kg -1 ) (mg.kg -1 ) pečeně 2,7 19,8 Paulsen a Bauer (2007) libové 2,9 4,9 30,1 70,3 Bardócz a kol. (1993) libové 4,6 28,3 Okamoto a kol. (1997) játra 32,1 115,4 Krausová a kol. (2006a) játra 23,3 94,5 Krausová a kol. (2007) ledviny 7,97 47,9 Kozová a kol. (2008) slezina 36, 3 31,4 Kozová a kol. (2008) slezina Villanueva-Valero a kol. (2005) Pozn.: SPD spermidin, SPM spermin Hovězí maso Obsah polyaminů v hovězím mase je velice podobný obsahu polyaminů v mase vepřovém. Vyskytuje se hlavně SPM, a to většinou v rozsahu mg.kg -1. Obsah SPD nepřesahuje 5 mg.kg -1 (Kalač, 2006). Obsah PUT i SPD je často pod hranicí detekce. Vyšší hladiny SPM se objevují u mladých a rychle rostoucích zvířat (Krausová a kol., 2006b). Yano a kol. (1995) uvedli, že obsah SPD a SPM se v hovězím mase nezměnil během skladování při 10 C, 5 C a 0 C. Z ostatních aminů se vždy nejdříve objevil TYM. Při skladování při 10 C byl TYM detekován po 4 dnech, CAD po 5 dnech a PUT po 7 dnech. TYM a CAD byly detekovány po 10 dnech skladování při 5 C a PUT byl detekován až 16. den. Při skladování hovězího masa při 0 C byl TYM poprvé detekován až po 25 dnech, zatímco CAD a PUT nebyly detekovány ani po 39 dnech. Kozová a kol. (2009b) uvedli, že skladováním hovězího masa při 18 C se původní obsah SPM poněkud zvýšil, po půl roce však klesl o 30 % původního obsahu. Žádný jiný BA nebyl během této doby detekován. Tepelnými úpravami 5 a 10 dní starého masa klesl obsah SPM přibližně na 70 % výchozí hladiny v čerstvém mase. Obsah polyaminů v hovězích játrech je podstatně vyšší v porovnání s jejich obsahem v hovězím mase. Oproti játrům jiných hospodářských zvířat mají hovězí játra mnohem vyšší obsah SPD a nižší obsah SPM. Krausová a kol. (2006a) zjistili nižší obsah SPD v játrech mladého býka (stáří měsíců) než v játrech krav (průměrné stáří 26

27 61 měsíců). Vzhledem k tomu, že vyšší hladiny polyaminů se obecně očekávají ve tkáních mladých zvířat, toto zjištění bylo překvapující. Tab.4 Obsah polyaminů v hovězím mase a vnitřnostech Hovězí maso SPD SPM Literatura (mg.kg -1 ) (mg.kg -1 ) svíčková ND 21,7 Krausová a kol. (2006b) svíčková 1,5 30 Yano a kol. (1995) svíčková 2,2 17 Eliassen a kol. (2002) kýta ND 22 Krausová a kol. (2006b) játra (býk) 121,5 43 Krausová a kol. (2006a) játra (kráva) 160,5 34,7 Krausová a kol. (2006a) Pozn.: SPD spermidin, SPM spermin, ND obsah pod mezí detekce Stejně jako játra teplokrevných hospodářských zvířat i játra kuřecí mají vysoký obsah polyaminů, zejména sperminu. Zatím jsou dostupné údaje o obsahu PA v kuřecích játrech po porážce. Narozdíl od masa nebo například vepřových jater chybějí informace o změnách obsahu BA a PA v kuřecích játrech po různých kuchyňských úpravách. Cílem práce proto bylo zjistit, jak se v kuřecích játrech mění obsah aminů po třech různých tepelných úpravách. 27

28 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Odběr vzorků Vzorky kuřecích jater od různých dodavatelů byly zakoupeny v supermarketech v Českých Budějovicích. Chlazená kuřecí játra byla po zakoupení skladována při teplotě 4 ± 1 C. Kuchyňské úpravy a další zpracování chlazených jater probíhaly ± 1 den kolem jejich data spotřeby, aby bylo napodobeno chování spotřebitele plně využívajícího dobu skladovatelnosti. Mražená kuřecí játra byla po zakoupení skladována při 18 ± 1 C. Vzhledem k jejich delší době trvanlivosti (1 rok) byla zpracována ±1 měsíc kolem jejich data spotřeby. Den před zpracováním byla játra přesunuta z mrazničky do chladničky na dobu cca 18 hodin a poté po dobu asi jedné hodiny před zpracováním ponechána při pokojové teplotě do dosažení úplného rozmražení. Přehled dodavatelů včetně dat zakoupení, trvanlivosti a zpracování jater je uveden v tabulce 5. Tab.5 Dodavatelé, data zakoupení, spotřeby a zpracování kuřecích jater Chlazená játra dodavatel zakoupeno datum spotřeby zpracováno Vocílka BILLA Rabbit Trhový Štěpánov Drůbežářský závod Klatovy DZ Klatovy Rabbit Vodňanské kuře, výrobce Vodňanská drůbež Mražená játra dodavatel zakoupeno datum spotřeby zpracováno Rabbit Vaigl a syn Údlice Vodňanské kuře

29 4.2 Kuchyňské úpravy Kuchyňské úpravy kuřecích jater byly provedeny podle metodiky použité pro obdobný výzkum jater vepřových (Krausová a kol., 2007), což umožní porovnání získaných výsledků. Kuřecí játra byla nakrájena na malé kousky o rozměru cca 1x1 cm. Poté byl materiál důkladně promíchán. Tři vzorky o hmotnosti kolem 20 g byly odebrány před tepelným zpracováním pro přípravu výluhů pro stanovení výchozího obsahu BA a PA v syrových játrech. Zbytek jater byl rozdělen do třech částí a každá tato část byla zpracována jinou kuchyňskou úpravou. Z každé skupiny jater po různých kuchyňských úpravách byly připraveny tři výluhy pro stanovení obsahu BA a PA. Z každého vzorku (syrové i tepelně zpracované) bylo odebráno 3x10 g ke stanovení obsahu sušiny. Souhrnně: každá z analýz byla provedena ve třech opakováních. Postup byl použit u 6 vzorků chlazených a u 3 vzorků mražených kuřecích jater získaných z obchodní sítě Vaření Do mikrotenových sáčků bylo vloženo cca 60 g kuřecích jater a přilito cca 60 ml destilované vody tak, aby hmotnostní poměr jater a vody byl 1 : 1. Sáčky s vpichovým teploměrem byly ponořeny do vodní lázně. Po dosažení stálé teploty C uvnitř sáčků se játra vařila 10 minut Dušení Do mikrotenových sáčků bylo vloženo cca 60 g kuřecích jater a přilito cca 15 ml destilované vody tak, aby hmotnostní poměr jater a vody byl 4 : 1. Další postup byl totožný s postupem vaření Restování Nakrájená játra byla za stálého míchání restována na teflonové pánvi na kuchyňském elektrickém vařiči. Vpichovým teploměrem byla sledována teplota jater. Po dosažení stálé teploty (kolem 97 C) byla játra restována přibližně 8 minut. 29

30 4.3 Analýza vzorků Použité chemikálie, přístroje a zařízení Kromě běžných laboratorních pomůcek, laboratorního skla a chemikálií byly pro analýzu BA a PA použity následující chemikálie, přístroje a zařízení. Chemikálie: vesměs čistoty p.a., resp. Gradient grade for LC 1,7-diaminoheptan, Sigma Aldrich, Německo, Acetonitril, Merck, Německo, Dansylchlorid, Sigma Aldrich, Německo, Dusík (UN 1066), Linde Technoplyn, ČR, n-heptan, Penta, ČR, Histamin dihydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Hydrogenuhličitan sodný, Lachema, Neratovice, ČR, Kadaverin dihydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Kyselina chloristá, Acros Organic, New Jersey, USA, Phenethylamin hydrochlorid, Aldrich, Německo, Prolin, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Putrescin dihydrochlorid, Aldrich, Německo, Spermidin trihydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Spermin tetrahydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Tryptamin hydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Tyramin hydrochlorid, Fluka, Buchs, Švýcarsko, Uhličitan draselný, Lachema, Nertovice, ČR, Uhličitan sodný, Lachema, Neratovice, ČR. Přístroje a zařízení: Kapalinový chromatograf, Agilent 1200 Series, Rapid Resolution LC System, USA Analytické váhy, B 204, Mettler Toledo, Švýcarsko, Ponorný mixer Bosch, Německo, Odstředivka Sigma 2 5, Německo, 30

31 Chladnička Bosch KGV, Německo, Ultrazvuková lázeň Bandelin Sonorex RK 31, Německo, Vařič jednoplotýnkový Eta , ČR, Vpichový teploměr Amarell Electronic, Německo (přesnost ± 0,5 o C). Vodní lázeň vícemístná s prstencovým víkem GFL, Německo, Sušárna ULM 400, Německo, Termostat Thermovap, ČR, Třepačka Heidolph MultiReax, Německo, Stanovení sušiny Vlivem různých kuchyňských úprav se měnil obsah sušiny ve vzorcích. Pro objektivní vyjádření změn obsahů BA a PA ve vzorcích byly jejich obsahy přepočítány na sušinu. Syrové, vařené, dušené a restované vzorky jater o hmotnosti cca 10 g byly vysušeny do konstantní hmotnosti při 105 C v laboratorní sušárně Stanovení BA a PA metodou UPLC Ke stanovení BA a PA byla použita metoda ultraúčinné kapalinové chromatografie (UPLC) s UV detekcí. Před analýzou na přístroji byly zásadité BA a PA extrahovány ze vzorků kyselinou chloristou. Vyextrahované aminy bylo nutné převést derivatizací na dansylderiváty, které byly poté separovány v chromatografickém systému Extrakce BA a PA z matric Do plastové nádobky byl odebrán vzorek syrových či tepelně opracovaných jater o hmotnosti cca 20 g zvážený s analytickou přesností a poté bylo přilito 50 ml 0,6 M kyseliny chloristé, směs byla zhomogenizována kuchyňským ponorným mixérem (Bosch, 600W) po dobu 3 minut, směs byla odstředěna (Sigma 2-5, průměr rotoru 272 mm) při 1800 g (3500 rpm) po dobu 10 minut, supernatant byl přefiltrován přes skládaný filtrační papír (pro kvalitativní analýzu, nekrepovaný, nehlazený) a byl odečten celkový objem filtrátu. 31

32 Extrakty byly do analýzy skladovány v chladničce při teplotě 4 ± 1 C. Běžná doba skladování extraktů byla kratší než 1 měsíc. Vývary z dušených a vařených jater byly přefiltrovány přes mlynářské síto a poté byly okamžitě zmraženy na 18 ± 1 C. Rozmraženy byly těsně před derivatizací Derivatizace BA a PA dansylací Derivatizace extraktů a vývarů proběhla dle publikovaného postupu (Dadáková a kol., 2009). Byl odpipetován 1 ml kyselého extraktu vzorku, bylo přidáno 100 μl vnitřního standardu, kterým byl roztok 1,7 heptandiaminu o koncentraci 400 mg.l -1 v roztoku 0,6 M kyseliny chloristé, vzniklý roztok byl zneutralizován 1,5 ml neutralizačního uhličitanového roztoku vždy čerstvě připraveného před každou analýzou, Tab.6 Příprava uhličitanového neutralizačního roztoku Počet vzorků K 2 CO 3 (g) 0,666 1,332 1,998 2,664 3,33 4,664 5,328 AB (ml) Příprava roztoku AB, který nemusí být čerstvý: Roztok A: Na 2 CO 3 Roztok B: NaHCO 3 2,65 g do 50 ml 4,2 g do 100 ml; pomocí pufru A bylo nastaveno ph pufru B na hodnotu 9,2 byly přidány 2 ml derivatizačního činidla (roztok 5 mg dansylchoridu na 1 ml acetonu), tento roztok musí být vždy čerstvě připraven před každou derivatizací, vzorky byly umístěny do laboratorní třepačky a nachaly se třepat 20 hodin ve tmě při laboratorní teplotě, poté bylo přidáno 200 μl roztoku L-prolinu (0,1 g v 1 ml destilované vody) a pro zreagování nadbytečného činidla se vzorky nechaly třepat ještě jednu hodinu ve tmě, k vyextrahování derivátů BA a PA byly přidány 3 ml heptanu a poté byl obsah zkumavky 2,5 minuty promícháván převracením, 32

33 do vialky byl odpipetován 1 ml supernatantu, který byl při 60 C odpařen pod dusíkem do sucha, odparek byl rozpuštěn v 1,5 ml acetonitrilu a byl přefiltrován přes skleněný filtr (velikost pórů 1,7 µm) do 1,5 ml vialky Analytická koncovka UPLC Analytickou koncovkou pro stanovení BA a PA byla metoda kapalinové chromatografie s využitím techniky UPLC. Derivatizovaný vzorek obsahoval dansylderiváty přítomných aminů. Provedení odpovídalo publikované metodě (Dadáková a kol., 2009). Kapalinový chromatograf, který byl použit k analýze, byl vybaven binární pumpou, autosamplerem, zařízením na odplynění mobilních fází, termostatem kolon a DA detektorem (Agilent Technologies, USA). Separace analytů probíhala v chromatografické koloně (Agilent Zorbax Elipse XDB-C18) o rozměrech 50 mm x 4,6 mm ID, s velikostí částic sorbentu 1,8 µm. Kolona byla vybavena RRLC In-line filtrem pro její ochranu. Vlastní chromatografická separace byla provedena s použitím mobilních fází A (100% acetonitril) a B (50% acetonitril) a gradientové eluce podle následujícího programu: 0 2 min A 40%, B 60% 2 3 min A 40 80%, B 60 20% 3 4 min A 80 90%, B 20 10% 4 6 min A 90 95%, B 10 5% 6 7 min A 95 45%, B 5 60% 7 12 min A 40%, B 60% Rychlost průtoku mobilní fáze činila 1 ml.min -1 a během analýzy byla konstantní. Teplota kolony byla udržována termostatem na 25 C. Objem nástřiku vzorků byl 5 µl. Jednotlivé analyty byly detekovány při vlnové délce 225 nm. Aminy byly identifikovány na základě retenčního času v porovnání se standardem. Dansylderiváty aminů jsou eluovány z kolony do 4 5 minut (obrázek 4). 33

34 Jejich separace je mnohem rychlejší a efektivnější než separace na standardních HPLC kolonách, kde eluce trvá minut (Dadáková a kol., 2009). Obr.4 Separace standardního roztoku Pozn.: Píky: 1 tryptamin, 2 fenylethylamin, 3 putrescin, 4 kadaverin, 5 histamin, 6 vnitřní standard 1,7- heptandiamin, 7 tyramin, 8 spermidin, 9 spermin Obr.5 Separace vzorku syrových jater Pozn.: Píky: 3 putrescin (3,05 mg.kg -1 ), 5 histamin (3,72 mg.kg -1 ), 6 1,7- heptandiamin, 7 tyramin (2,25 mg.kg -1 ), 8 spermidin (26,3 mg.kg -1 ), 9 spermin (59,9 mg.kg -1 ) 34

35 Rozmezí koncentrací pro danou metodu (2 150 mg.kg -1 ) je dostačující. Nižší koncentrace aminů nejsou toxikologicky významné. Vyšší koncentrace se mohou vyskytovat např. u zkažených ryb. V takovém případě není problém kyselé extrakty těchto vzorků zředit. V tabulce 7 jsou uvedeny limity detekce (LOD) a limity stanovitelnosti (LOQ) pro jednotlivé aminy. LOD je koncentrace analyzované látky, která poskytuje signál 3x větší, než je signál průměrného šumu. LOQ je koncentrace analyzované látky, která poskytuje signál 10x větší, než je signál průměrného šumu (Dadáková a kol., 2009). Opakovatelnost metody, tzn. chyba stanovení, kterou je třeba brát v úvahu při posuzování výsledků, byla zjištována deseti paralelními analýzami vzorku zhomogenizovaných syrových kuřecích jater. Obsahy tryptaminu, fenylethylaminu a kadaverinu byly pod mezí detekce. Pro ostatní aminy byly zjištěny následující hodnoty obsahu a opakovatelnosti: putrescin (3,92 mg/kg; 3,4 %), histamin (5,73 mg/kg; 3,1 %), tyramin (2,15 mg/kg; 4,9 %), spermidin (52,1 mg/kg; 5,2 %) a spermin (186 mg/kg; 5,7 %). Tab.7 Meze detekce (LOD) a stanovitelnosti (LOQ) pro jednotlivé aminy stanovené v nízkotučném sýru eidamského typu (převzato z práce Dadákové a kol., 2009). Amin LOD LOQ (mg.kg -1 čerstvé hmoty) (mg.kg -1 čerstvé hmoty) TRM 0,88 2,9 PEA ,5 PUT 0,63 2,1 CAD 0,58 1,9 HIM 0,56 1,9 TYM 0,98 3,3 SPD 0,36 1,2 SPM 1,12 3,7 35