nastavení real-time PCR cykleru Rotor Gene 3000

Transkript

1 Verze: 1.4 Datum poslední revize: nastavení real-time PCR cykleru Rotor Gene 3000 (Corbett Research) generi biotech

2 OBSAH: 1. Nastavení teplotního profilu a spuštění cykleru Zadání vzorků Způsoby vyhodnocení dat Vyhodnocení alelické diskriminace mód Quantification Vyhodnocení alelické diskriminace - Scatter Graph Analysis Vyhodnocení alelické diskriminace - mód Allelic Discrimination generi biotech 2/25

3 1. Nastavení teplotního profilu a spuštění cykleru 1.1. Vložte vzorky do cykleru 1.2. Spusťte software cykleru a v záložce Advanced vyberte nový run ( New ) generi biotech 3/25

4 1.3. Vyberte typ rotoru a zkumavek. Následně stiskněte Next 1.4. Zvolte objem reakce Reaction Volume (obvykle 20 nebo 25 µl). generi biotech 4/25

5 1.5. Nastavte teplotní profil analýzy v okně Edit profile V záložce Hold nastavte délku a teplotu úvodní denaturace. generi biotech 5/25

6 V záložce Cycling nastavte délku a teplotu denaturace a následného annealingu. Lze nastavit také počet cyklů. generi biotech 6/25

7 1.6. Nastavte snímání fluorescence v příslušných kanálech. Po označení oblasti s annealingem (na obrázku znázorněno šedou barvou) stiskněte tlačítko Acquiring to Cycling A. V tabulce, která se objeví označte zvolený kanál v oblasti Available Channels a pomocí šipky mezi okny jej přesuňte do oblasti Acquiring Channels generi biotech 7/25

8 1.7. V případě potřeby proveďte kalibraci podle návodu výrobce cykleru (nastavený gain by se mezi kanály neměl příliš lišit) generi biotech 8/25

9 1.8. Uložte run do zvoleného adresáře a spusťte analýzu generi biotech 9/25

10 2. Zadání vzorků 2.1. Jméno a typ vzorků zadejte v okně Edit samples, které se automaticky otevře po spuštění runu (popis vzorků lze upravovat také dodatečně, otevřením okna Edit samples z hlavního menu) generi biotech 10/25

11 Způsoby vyhodnocení dat Na základě kvantifikace genové exprese mód Quantification Vyhodnocení probíhá podle hodnot Ct, které se získají manuálním nastavením hodnoty Threshold. Data pro každý fluorescenční kanál je třeba vyhodnotit zvlášť. Scatter Graph Analýza Tento způsob umožňuje rychlé a jednoduché vyhodnocení získaných dat prostřednictvím grafu. Software dokáže ke vzorkům přiřadit příslušný genotyp. Nelze manuálně nastavit hodnotu Threshold. Na základě konečné fluorescence mód Allelic Discrimination Tento způsob umožňuje data vyhodnotit na základě konečné fluorescence (fluorescence v posledním cyklu qpcr). Lze zde manuálně přizpůsobit hodnotu Threshold. generi biotech 11/25

12 3. Vyhodnocení alelické diskriminace mód Quantification 3.1. V hlavním menu v modulu Analysis vyberte možnost Quantitation, označte požadovaný fluorescenční kanál a stiskněte příkaz Show generi biotech 12/25

13 3.2. V okně Quantitation Analysis nastavte při použití módů Dynamic Tube a Slope Correct zobrazení Log. Scale 3.3. V pravé dolní části okna lze manuálně nastavit hodnotu Threshold (zvolená hodnota bývá obvykle 0,05 ± 0,03). Pokud se tabulka nezobrazí automaticky, stačí kliknout myší na graf. generi biotech 13/25

14 3.4. Práh (threshold) pro Ct Calculation umístěte do poloviny exponenciální části nárůstu fluorescenčního signálu) a v modulu More Settings zvolte NTC threshold v rozmezí 1-20 % (pro odstranění nespecifického signálu). Doporučujeme nechat si viditelné pouze křivky pro příslušnou pozitivní kontrolu (WT/MUT) a zvolit takovou hodnotu NTC, při které zmizí křivka v kanále, kde nemá být daná pozitivní kontrola detekována. Toto nastavení následně použijte při vyhodnocování vzorků 3.5. Při odečtu hodnot pro genotypovou analýzu by měly být prahové fluorescence stejné pro oba kanály a měly by být lokalizovány do exponenciální fáze nárůstu fluorescence tj. v té oblasti, která je v logaritmickém zobrazení lineární generi biotech 14/25

15 3.6. V tabulce Quant. Results odečtěte hodnoty Ct Pro odečet hodnot Ct v dalším fluorescenčním kanálu (například u multiplexní PCR, genotypová analýza, interní pozitivní kontroly) opět označte v modulu Analysis / Quantitation požadovaný kanál a postupujte způsobem popsaným výše (od kapitoly 3.1.) generi biotech 15/25

16 4. Vyhodnocení alelické diskriminace - Scatter Graph Analysis 4.1. Po spuštění programu stiskněte tlačítko Analysis. V nově otevřeném okně v záložce Other zvolte možnost Scatter Graph Analysis. generi biotech 16/25

17 4.2. Následně označte oba fluorescenční kanály a stiskněte tlačítko Show generi biotech 17/25

18 4.3. Zobrazí se analýza alelické diskriminace. V horním okně jsou data znázorněna v grafu, kde na ose x je počet proběhlých cyklů PCR a na ose y je hladina fluorescence. Fluorescenční kanál FAM/Sybr je zobrazen hladkou křivkou, JOE/HEX křivkou s puntíky. V levém dolním okně je grafické znázornění jednotlivých skupin vzorků (WT, MUT a HET). generi biotech 18/25

19 4.4. Při vyhodnocování alelické diskriminace doporučujeme nechat si viditelné pouze křivky pro příslušnou pozitivní kontrolu (WT/MUT) a podle toho si přiřadit daný genotyp k označení alely (např. WT je detekován v kanále FAM/Sybr a objeví se v levém horním rohu grafu ( Scatter Analysis Graph ). Nechte si viditelné pouze křivky standardů pro zvolený genotyp (např. HET). Myší ohraničte skupinu standardů a pravým myšítkem zvolte možnost Define Genotype. Vyberte genotyp. Takto pokračujte i s ostatními genotypy (WT a MUT). generi biotech 19/25

20 4.5. Po definování oblastí se ve vedlejším okně ( Scatter Analysis Results ) ve sloupci Genotype zobrazí výsledek analýzy Toto nastavení následně použijte při vyhodnocování vzorků. Oblasti pro definování genotypu přizpůsobte rozptylu vzorků v grafu. generi biotech 20/25

21 5. Vyhodnocení alelické diskriminace - mód Allelic Discrimination 5.1. Po spuštění programu stiskněte tlačítko Analysis. V nově otevřeném okně v záložce Other zvolte možnost Allelic Discrimination Následně označte oba fluorescenční kanály (s pomocí klávesy Shift) a stiskněte tlačítko Show. generi biotech 21/25

22 5.3. Zobrazí se analýza alelické diskriminace. V horním okně jsou data znázorněna v grafu, kde na ose x je počet proběhlých cyklů PCR a na ose y je hladina fluorescence. Fluorescenční kanál FAM/Sybr je zobrazen hladkou křivkou, JOE/HEX křivkou s puntíky. generi biotech 22/25

23 5.4. Software dokáže na základě hodnoty konečné fluorescence daného vzorku (či standardu) vyhodnotit jeho genotyp. Nejdříve je ale třeba definovat fluorescenční kanály pro jednotlivé genotypy. V liště vyberte nabídku Genotypes a v nově otevřeném okně Genotyping vyberte fluorescenční kanály pro všechny genotypy. Poznámka: Wild-type je detekován v kanále FAM/Sybr Mutant v kanále JOE/HEX Heterozygot v kanálech FAM/Sybr a zároveň JOE/HEX (zvolte tedy oba) Genotypy se po vyhodnocení analýzy zobrazí v přehledné tabulce (viz bod 5.8.) generi biotech 23/25

24 5.5. V pravé dolní části okna lze manuálně nastavit hodnotu Threshold (zvolená hodnota bývá obvykle 0,05 ± 0,03). Pokud se tabulka nezobrazí automaticky, stačí kliknout myší na graf. generi biotech 24/25

25 5.6. Doporučujeme ponechat si viditelné pouze křivky pozitivních kontrol WT, MUT a HET (po kliknutí na vzorek v pravé části monitoru křivka zmizí, nebo se naopak objeví). Dále je třeba linii Thresholdu nastavit tak, aby ležela těsně nad nespecifickými křivkami je to křivka pro standard WT v kanále JOE/HEX a křivka pro standard MUT v kanále FAM/Sybr Při hodnocení více mutací v rámci jednoho runu je nezbytné nastavit hodnotu threshold pro každou mutaci zvlášť podle příslušných standardů. Toto nastavení pak použijte pouze pro hodnocení vzorků testovaných na danou mutaci V levé dolní části je zobrazena tabulka (viz obrázek výše) s genotypy pro jednotlivé standardy. Takto se genotypy přiřadí i ke vzorkům DNA. generi biotech 25/25