Yi TPMT. Diagnostická souprava. Návod k použití. Haasova 27 Brno Česká republika. tel.:

Transkript

1 Yi TPMT Diagnostická souprava Návod k použití Výrobce: YBUX s.r.o. Haasova 27 Brno Česká republika IČ tel.: ybux@ybux.eu Název: Yi TPMT Popis: Diagnostická souprava pro detekci polymorfismů v genu TPMT Použití: Pro diagnostické použití in vitro. Skladování: Skladujte při teplotě -18 C. Přepravujte na ledu. Velikost balení: 3 25 reakcí Bezpečnostní informace: Souprava Yi TMPT neobsahuje látky nebezpečné pro životní prostředí ani zdraví škodlivé látky.

2 Návod k použití 1. Účel použití, indikace Tato diagnostická souprava je určena pro detekci přítomnosti tří klinicky významných polymorfismů v genu pro thiopurin S-methyltransferázu (TPMT), zejména u pacientů léčených thiopurinovými léčivy. Při léčbě thiopurinovými léčivy jsou patrné značné individuální rozdíly jak v odpovědi na léčbu, tak v projevu nežádoucích účinků. Předpoklady ke vzniku nežádoucích účinků lze v současné době testovat na základě genetické výbavy daného jedince. Za metabolismus thiopurinů je majoritně zodpovědný enzym thiopurin S-methyltransferáza. Přibližně 10 % populace nese mutaci, která zapříčiňuje sníženou nebo nulovou aktivitu tohoto enzymu z toho plynoucí možný výskyt nežádoucích účinků léčby. Ze všech pacientů, kteří vykazují deficienci ve funkci enzymu TPMT, % [1.] nese jednu ze tří bodových mutací 238G>C, 460G>A nebo 719A>G (Tab. 1) detekovaných touto soupravou. Je tedy velmi vhodné testovat pacienty léčené thiopuriny právě na tyto tři polymorfismy, a to nejlépe již před začátkem terapie. Číslo SNP Fluorofor Označení polymorfismu mastermixu rs Standardní alela FAM TPMT 238 (bílá) 238G>C HEX rs Standardní alela FAM TPMT 460 (žlutá) 460G>A HEX rs Standardní alela FAM TPMT 719 (modrá) 719A>G HEX Tabulka 1: přehled detekovaných polymorfismů a jejich značení 2. Princip metody Detekční souprava je navržena tak, aby bylo možné testovat tři nejčastější [1.] polymorfismy v genu TPMT (238G C, 460G A, 719A G). Detekce alel probíhá pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (real-time PCR). Během této reakce je kopírován vybraný úsek molekuly DNA. V případě, že se jedná o standardní (wild-type) alelu, na kopírovaný úsek se váže oligonukleotidová sonda značená fluoroforem HEX a pokud je přítomná mutovaná alela, na vlákno DNA se váže sonda značená fluoroforem FAM (Obr. 1).

3 Obrázek 1: K úseku DNA, kde se nachází mutace, je komplementární vlákno DNA, které je na jednom konci opatřeno reportérovou barvou a na konci druhém zhášečem. V momentě, kdy nasedne na komplementární úsek genomu, zhášeč se uvolní od reportéru a emituje záření, které je zachyceno přístrojem. (ilustrace; zdroj: Cykler, kde tato reakce probíhá, je vybaven snímačem, který detekuje fluorescenci konkrétní sondy a vyhodnocuje přítomnost wild-type nebo mutantní alely a v případě heterozygota alel obou. Detekční souprava využívá technologii hot start minimalizující nespecifické reakce a zajišťující maximální senzitivitu. Součástí předpřipravené reakční směsi je dutp a uracil-dna-glykosyláza (UDG) zabezpečující odstranění případných kontaminací amplifikačními produkty, synteticky vyrobený plasmid, který slouží jako pozitivní kontrola pro všechny tři polymorfismy a fluorofor ROX, který slouží jako interní kontrola fluorescence. 3. Obsah balení Yi TPMT obsahuje tři hotové reakční směsi. Každá reakční směs je určena pro detekci jednoho polymorfismu. Jednotlivé zkumavky jsou barevně odlišeny: Bílá Reakční směs pro detekci SNP 238G C (rs ) Žlutá Reakční směs pro detekci SNP 460G A (rs ) Modrá Reakční směs pro detekci SNP 719A G (rs ) Objem: 500 µl 25 reakcí o objemu 18 µl. Reakční směs je optimalizována tak, aby nebylo nutné přidávat do směsi jakoukoliv další komponentu. Exspirace je uvedena na štítku každé zkumavky. Součástí detekční soupravy jsou i pozitivní kontroly pro genotyp homozygotní pro WT alelu, homozygotní pro MUT alelu a heterozygotní genotyp. Zkumavky s kontrolami mají průhledné víčko a jsou popsány následujícím způsobem: WT Pozitivní kontrola pro wild-type alelu v polymorfismu 238, 460, 719 HET Pozitivní kontrola pro heterozygotní genotyp polymorfismu 238, 460, 719 MUT Pozitivní kontrola pro mutantní alelu polymorfismu 238, 460, 719 NK Negativní kontrola bez obsahu DNA zkumavky Objem: 50 µl. Exspirace je uvedena na štítku.

4 4. Složení reakční směsi Hot Start Taq polymeráza; NaCl; KCl; MgCl 2 ; (NH 4 ) 2 SO 4 ; Rox fluorofor; dutp; Tris HCl; EDTA; UDG; Glycerol; FAM fluorofor; HEX fluorofor; zhášeč BHQ-1; DDW DNA/RNA free; puc57 vektor 1). 1) vektor puc57 je obsažen jen v pozitivních kontrolách, tj. ve zkumavkách WT, HET a MUT 5. Další potřebné vybavení a chemikálie (nejsou součástí soupravy) Souprava na izolaci DNA -např. QIAamp DNA Investigator Kit (Qiagen) TE pufr nebo odpovídající alternativa pro ředění DNA (AE pufr, voda) Automatické pipety, špičky s filtrem Termocykler s detekcí fluorescence na následujících vlnových délkách: Barvivo Excitace (nm) Emise (nm) Použití FAM MUT HEX WT ROX pozadí Tabulka 2: Excitační a emisní maxima použitých fluochromů Graf 1: Emisní spektra použitých fluorochromů. 6. Vstupní materiál Jako vstupní materiál lze použít vzorek DNA rozpuštěný ve vodě, v TE pufru nebo v AE pufru, o koncentraci 1-10 ng/ μl. DNA může být izolována např. z plné krve odebrané do zkumavky s EDTA (ne s heparinem) nebo z bukálního stěru. Pokud se DNA nevyšetřuje bezprostředně po izolaci, měla by být skladována při teplotě -18 C ve vhodném pufru. Skladování při teplotě +4 C po dobu delší než 1 měsíc, uchovávání DNA ve vodě a opakované rozmrazování a zamrazování vzorku může mít za následek degradaci vzorku DNA a selhání PCR.

5 7. Pracovní postup Poznámky: V každé analýze je nutno zařadit pozitivní i negativní kontroly k ověření správného průběhu reakce. Doporučená vstupní koncentrace DNA je 1-10 ng/μl. Postup: 1. Pipetujte 18 μl reakční směsi pro požadovaný polymorfismus do mikrozkumavky nebo do reakční destičky čí stripu. 2. Přidejte 2 μl vyšetřované DNA nebo kontroly do každé zkumavky. Celkový objem reakční směsi je 20 μl. 3. Zavřete zkumavky nebo strip víčkem či destičku fólií a vložte do cykleru. 4. Spusťte následující program: - Genotyping SNP Genotyping, End point Analysis: - Program Vašeho cykleru určený pro alelovou diskriminaci - Nastavte ROX jako fluorofor pasivní reference, je-li vyžadováno přístrojem. - Pokud je toto nastavení možné, je vhodné nastavit slope correct. - Standardní alela (WT) je pro všechny polymorfismy značena fluoroforem HEX. - Mutantní alela (MUT) je pro všechny polymorfismy značena fluoroforem FAM. - Reakční profil podle hodnot v Tabulce 3 Program PCR amplifikace (pro všechny SNP identický) TPMT_RT_DD_MM_RRRR Krok č. Proces Teplota Čas Záznam fluorescence 1 dekontaminace UDG 50 C 2 min. X 2 aktivace polymerázy deaktivace UDG 95 C 2 min. 3 PCR: denaturace 95 C 15 s 4 PCR: annealing a elongace 60,5 C 30 s X 5 opakování Zpět na 3 35x 6 Post-PCR záznam fluorescence 60,5 C 30 s X Tabulka 3: Podmínky PCR reakce

6 8. Hodnocení výsledků Většina ovládacích softwarů pro real-time cyklery dokáže výsledky rozklastrovat dle detekovaného polymorfismu. Zejména při nižších koncentracích DNA může dojít k tomu, že přístroj nebude tyto výsledky hodnotit. Poté se tedy výsledek hodnotí z nárůstů křivek a hodnot finální naměřené fluorescence. Hodnotíme vzorky, kde je ct v rozmezí 22. až 32. cyklus. Vzorky, které jsou mimo doporučené ct, nelze objektivně hodnotit. Pokud se detekujeme nárůst produktu PCR / fluorescence sondy HEX, jedná se o vzorek s wild type alelou (Obr. 2). V případě, že se výrazně prudce zvedají křivky pro sondu FAM i HEX, jedná se o heterozygota (Obr. 3). Pokud je detekována pouze sonda FAM, jedná se o recesivního homozygota. Obrázek 2: nárůst fluorescenčního signálu sondy HEX u vzorku s wild type alelou. Obrázek 3: nárůst fluorescenčních signálů obou sond, HEX i FAM, u vzorku jedince s heterozygotním genotypem ve sledovaném polymorfismu. Pro stanovení hodnoty Ct může být při nízkých koncentracích vstupní DNA třeba nastavit baseline mezi 5. a 18. cyklus. Threshold se v takovém případě nastavuje pro každý polymorfismus zvlášť podle výsledků pozitivních kontrol nad hodnotu šumu pozadí.

7 9. Řešení problémů Žádný produkt amplifikace vzorků Žádný produkt amplifikace plasmidových kontrol. Falešně pozitivní nárůst fluorescence Přítomnost produktu PCR ve slepé kontrole Zkontrolujte, zda Vaše DNA dosahuje požadované koncentrace Kontaktujte výrobce Po vyloučení možné kontaminace vzorku kontaktujte výrobce. Po vyloučení možné kontaminace reakčních směsí kontaktujte výrobce. Pokud dojde k nárůstu fluorescence až po Nárůst fluorescence až po 32. cyklu Zákaznický servis 32.cyklu, zopakujte reakci. Jinak lze reakci vyhodnotit. ybux@ybux.eu telefon: Literatura [1.] Yates CR, Krynetski EY, Loennechen T, Fessing MY, et al. Molecular diagnosis of thiopurine S-methyltransferase deficiency: Dig Dis Sci 123 Author's personal copy genetic basis for azathioprine and mercaptopurine intolerance. Ann Intern Med. 1997;8: