Obecná toxikologie - zjišťování toxicity, informační zdroje a testy toxicity, legislativa. Základy toxikologie a ekologie Marek Šír

Transkript

1 Obecná toxikologie - zjišťování toxicity, informační zdroje a testy toxicity, legislativa Základy toxikologie a ekologie Marek Šír sirm@vscht.cz

2 Základní zdroje dat Pozorování jedinců vystavených účinku toxické látky Epidemiologické studie vystavení toxické látce v pracovním prostředí, životním prostředí, v důsledku stravovacích návyků/životního stylu, v důsledku průmyslových havárií Klinické studie - záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků Testy toxicity záměrné vystavení účinku toxické látky: In vitro v moderní toxikologii nejvýznamnější zdroj poznatků, na biomolekulách, buněčných preparátech (leukocity, jaterní buňky), s využitím jednoduchých organismů (bakterie, prvoci, červi) In vivo pokusy v živém organismu, na zvířatech (myši, potkani, králíci) (Zákon č. 246/1992, Zákon na ochranu zvířat proti týrání, část třetí Ochrana pokusných zvířat) Ex vivo mimo živý organismus, např. na tkáních z poraženého dobytka (In silico) SAR, QSAR

3 Vztah dávky a odpovědi Systémový účinek závisí přímo na absorbované dávce Typy dávek: Dávka podaná Dávka absorbovaná je dána biologickou dostupností, může nabývat 0 100% hodnoty dávky podané. Absorpce kriticky závisí na cestě do organismu Dávka se obvykle udává v mg / kg (hmotnost toxické látky / hmotnost organismu). Základní cesty vstupu látky do organismu: Vdechnutím Požitím Přes kůži Intravenosně Typy odpovědí: kvantální (binární) (jev se vyskytne / nevyskytne, např. smrt, spánek) stupňovitá (např. inhibice určitého enzymu, úbytek svalové hmoty, změna krevního tlaku)

4 podíl odpovědí % podíl odpovědí % Závislost účinku na dávce jednorázová expozice 100 Kumulativní závislost, procentuální podíl jedinců, u kterých se projevil účinek log D Diferenciální závislost, frekvence účinku, na vrcholu křivky se účinek projeví u 50% jedinců log D

5 Podíl odpovědí % Závislost účinku na dávce jednorázová expozice Pojmy: Tvar křivky vychází z receptorové teorie: ED 50 střední efektivní dávka (efekt obecně) ID 50 střední inhibiční dávka (inhibice enzymu) TD 50 - střední toxická dávka LD 50 střední letální dávka S + R k 1 k 2 SR E = k 1 [S] / (k 2 + k 1 [S]) ED E účinek, podíl odpovědí (bezrozměrný) [S] konc. substrátu [R] - konc. molekul receptoru [SR] konc. komplexu k rychlostní konstanta TI terapeutický index TI = LD50 / ED50 Důležitý parametr ve vztahu k lékům, čím je větší hodnota TI, tím je větší rozpětí bezpečnosti dané látky. ED10 ED50 Log D

6 Testy in vitro Požívá testování na zjednodušených modelech (biomolekuly, subcelulární preparáty, buněčné preparáty, izolované orgány), testování na nižších organismech. Potřeba testů in vitro vychází ze základní strategie 3R: Replacement (nahrazení): metody in vitro mimo živý organismus, tzn. alternativa bez použití pokusných zvířat Reduction (redukce): snížení počtu pokusných zvířat Refinement (zmírnění): upravené metody experimentování Přináší informace zejména o: Interakci toxická látka receptor Biochemickém mechanismu účinku Genotoxicitě na buněčné úrovni Naopak nelze získat informace o: Toxokinetice, systémových účincích, orgánové toxicitě Příklady Test na nitěnkách (Tubifex tubifex) rychlý orientační test toxicity látek rozpustných ve vodě Amesův test na bakteriích Salmonella typhimurium test mutagenity

7 Testy akutní toxicity in vivo Stále nezbytná součást metod experimentální toxikologie Použití: Klasifikace látek podle toxicity, např. testování silně toxických léčiv Princip: Zjišťuje se závislost akutního účinku na jednorázové dávce testované látky Nejčastěji zjišťován letální účinek mortalita Medián letální dávky LD 50, medián letální koncentrace LC 50 Minimálně 3 dávky pod, blízko a nad očekávanou LD 50 Poté 2 týdny sledování období latence, sledovány další zjevné toxické projevy Testování nejčastěji na hlodavcích, skupiny mezi 5 10 jedinci Problém mnohdy obtížně přenositelné na jiné druhy (člověka)

8 5 zvířat 5 mg/kg 5 zvířat 50 mg/kg A B C A B C A T+ T+ T+ T T Metoda fixní dávky A alespoň 2 zvířata uhynou B uhyne 1, nebo 1 zjevné známky toxicity C žádné neuhyne ani známky toxicity T + - vysoce toxické T toxické Xn zdraví škodlivé N neklasifikované podle toxicity 5 zvířat 300 mg/kg B Xn Použití: Klasifikace látek podle toxicity C A Xn Princip: Stupňovité dávkování toxické látky a sledování odpovědi (smrt, zjevné známky toxicity) 5 zvířat 2000 mg/kg B C N N Menší počet zvířat Neumožňuje stanovit LD 50 Neměří kvantitativně míru toxicity

9 podíl odpovědí % Subchronické testy in vivo Posuzování bezpečnosti léčiv, potravinových aditiv, pesticidů Subakutní 2-4 týdny Subchronické dní Min. 3 dávkové hladiny, 1 neexponovaná skupina, někdy pozitivní kontrola, skupin zvířat Nejvyšší hladina max. 10% úhyn NOAEL Práh účinku LOAEL log D Měření odpovědí ztráta (přírůstku) hmotnosti, biochemické parametry, aktivity enzymů NOAEL (no observed adverse effect level) nebyl pozorován účinek LOAEL (the lowes observed adverse effect level) nejnižší dávka, kdy byl účinek pozorován

10 podíl odpovědí % Chronické testy in vivo Stanovení dlouhodobého působení látek na organismus, posuzování kumulativních účinků Opakované dávky po dobu dospělého života (u myši 6 měsíců, u potkana 2 roky) NOAEL Práh účinku % odpovědí v kontrolní populaci LOAEL log D Podávána maximální tolerovaná dávka (MTD) ze subchronického testu (slabý pokles hmotnosti), 1/2 MTD, 1/4 MTD, neexponovaná skupina Kontrolní populace nutná pro srovnání, i v kontrole určité % odpovědí bez expozice látce LOAEL nejnižší dávková hladina, při které je podíl odpovědí statisticky odlišný od kontrolní populace

11 Prahový model Předpokládá se, že pro danou látku existuje práh účinku, tzn. existuje bezpečná prahová dávka, pod níž je účinek nulový. Základní převedení dat z pokusných zvířat na člověka podle: Tělesné hmotnosti m Velikost povrchu těla S (S = k m 2/3 ) Energetických nároků EN (EN = k m 3/4 ) (k konstanta úměrnosti) Přípustná denní dávka (ADI acceptable daily intake): Při opakované expozici po celou dobu života představuje zanedbatelné nebo žádné riziko, odvozuje se z NOAEL ADI = NOAEL / (UF.MF) UF (faktor nejistoty, uncertainty factor) hodnoty 1-10, popisuje nejistoty při převodu hodnot ze zvířete na člověka, variabilitu mezi lidmi, nejistotu při převodu LOAEL na NOAEL MF (modifikační faktor, modifying factor) hodnoty 0<MF<10, zahrnuje nejistoty při statistickém vyhodnocení dat z různých typů studií

12 Inhalační expozice Nejvýznamnější nezamýšlená expozice toxickým látkám Stanovení absorbované dávky: D i = R V inh c inh t R = (c inh c exh ) / c i D absorbovaná dávka, c inh (c exh ) koncentrace látky ve vdechovaném (vydechovaném) vzduchu, t doba inhalace, R retence látky v plicích Retence pro páry organických látek v plicích se běžně pohybuje mezi 50 90%. Nařízení č. 361/2007 Sb. stanovuje podmínky ochrany zdraví při práci: NPK nejvyšší přípustná koncentrace koncentrace látky, která nesmí být v žádném časovém okamžiku překročena PEL přípustný expoziční limit průměrná koncentrace látky za určité časové období nesmí překročit PEL Minutové objemy vzduchu (l/min) prošlého plícemi: spánek: 6, lehká práce: 20, střední práce: 20-40, těžká práce: Příklad Látka NPK - P (mg/m3) PEL (mg/m3) Imisní limit (mg/m3) benzen ,005 ethanol

13 Přes kůži: V pracovním prostředí nezanedbatelná možnost expozice Stanovení přenosu přes kůži: J = K p.c Expozice kontaktem s kůží a požitím J tok látky jednotkovou plochou kůže, Kp permeabilita kůže (rozhodující je permeabilita zrohovatělé vrstvy stratum corneum, c koncentrace látky Příklad: J (methanol) = 11,5 mg/cm 2 /h možnost oslepnutí/úmrtí v důsledku kontaktu s kůží Požití: V pracovním prostředí nehody. V běžném životě mohou toxické látky vstupovat do těla s kontaminovanou potravou a vodou + nutno brát v úvahu pojídání půdy/prachu/strkání předmětů do úst u dětí. US EPA definuje průměrné a maximální hodnoty příjmu potravy, pitné vody a další veličiny pro stanovení míry expozice. Příklad Látka Pitná voda Zelenina Půda / prach (vstup ústy) Odhad průměrné hodnoty 1,4 l za den (dospělí), 1 l za den (děti) 200 g za den 100 mg za den (dospělí), 200 mg za den (děti)

14 Biologické monitorování Nepřímé určení absorbované dávky nebo její odezvy v organismu pomocí vnitřního ukazatele. Indikátorem expozice je samotná látka, metabolit, produkt reakce s biomolekulami, biochemický parametr Biologický expoziční limit (BEL) limitní hodnota, vychází z epidemiologických studií nebo z PEL Požadavky na biologický indikátor expozice dostatečná citlivost k podchycení reálných expozic, neinvazivnost odběru vzorku, specifičnost pro určitou látku, znalost kvantitativní závislosti Škodlivá látka Biologický indikátor BEL Vzorek toluen hippuronová kyselina 1600 mg/g kreatininu moč, konec směny

15 Testy karcinogenity in vivo Použití: identifikace látek, které vyvolávají novotvary (benigní a maligní nádory) a získat tak podklady pro stanovení přijatelných denních dávek (ADI) těchto látek a stanovení bezpečných limitů expozice Princip: Zjišťuje se frekvence výskytu novotvarů v závislosti na dávce Nutné velké množství zvířat, myš, potkan, skupiny nejméně 100 zvířat (50 samců, 50 samic), často speciální kmeny transgenické myši např. s nedostatečně aktivními nebo nefunkčními opravnými mechanismy DNA 3 4 dávkové hladiny, MTD, 1/2MTD, 1/3MTD, 1/4MTD Testovaná látka se podává dlouhodobě, obvykle po celou dobu života zvířete

16 Amesův test Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin. Vhodný pro přímé karcinogeny, nedokáže rozpoznat karcinogenitu látek, které jsou aktivovány až metabolizmem (prokarcinogeny). Několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium mutace v genech účastnících se syntézy aminokyseliny histidinu - vyžadují tedy externí zdroj histidinu. Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez přídavku histidinu. Jaterní enzymy Potenciální mutagen inkubace Vysoký počet změněných bakterií (his- na his+) udává, že látka způsobuje mutace kmeny Salmonella (vyžadující zdroj histidinu) Média s minimálním množstvím histidinu inkubace Kontrola

17 Bezprahový model Předpokládá, že pro danou látku neexistuje práh účinku neexistuje tedy koncentrace látky, která by nezpůsobovala biologickou odezvu. Bezprahový účinek se předpokládá u např. genotoxických karcinogenů, tzn. že teoreticky jediná molekula látky může vyvolat rakovinu. Při hodnocení rizika se vychází z tzv. VSD virtualy safe dose (zdánlivě bezpečná dávka). Ta je dána konceptem Risk De-minimis (minimální možné riziko): Riziko, které je pod hranicí společenského zájmu Případně riziko pod detekční schopností metod, které by bylo možné používat k jeho kontrole Jako přípustná míra rizika se obvykle volí hodnota (akceptovaná agenturami pro ochranu zdraví a životního prostředí (EPA, FDA apod.). V populaci osob se vyskytne během lidského života (70 let) 1 případ rakoviny navíc v důsledku expozice látce. Extrapolace experimentálních dat (z pokusů na zvířatech, epidemiologických studií) k velmi nízkým hladinám řada farmakokinetických / toxokinetických modelů, Nejjednoduší je lineární extrapolace k nulové hodnotě, nicméně obvykle se jedná o značně nelineární závislost.

18 Klasifikace karcinogenů Legislativa EU Direktiva 67/5448/EHS Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC International Agency for the Research on Cancer) Americký vládní Národní toxikologický program (NTP, National Toxicology Program) Americká agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA, United States Environmental Protection Agency) Organizace spojených národů Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemikálií (GHS, Globally Harmonized Systém of Classification and Labeling of Chemicals)

19 Klasifikace karcinogenů EU 3 kategorie 1 Prokázané lidské karcinogeny 2 Podezřelé lidské karcinogeny 3 Látky, které nejsou zařaditelné mezi karcinogeny US EPA - 5 skupin A E, (B1 a B2), + také podrobnější slovní hodnocení NTP- 2 kategorie IARC 5 skupin 1 Karcinogenní pro člověka 2A Pravděpodobně karcinogenní pro člověka 2B S potenciálním karcinogenním účinkem pro člověka (možné lidské karcinogeny) 3 Nejsou klasifikovatelné jako lidské karcinogeny 4 Pravděpodobně nekarcinogenní pro člověka GHS - 2 skupiny (1. má 2 podskupiny) Látka EU IARC NTP US EPA vinylchlorid 1 1 A A azbest 1 1 A B2 chloroform 3 2B B B2 Ethanol neklasifikován 1 neklasifikován neklasifikován

20 Predikční metody SAR, QSAR (quantitative structure-activity relationship) Kvantitativní vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou nejčastěji využíván v počátečním stádiu navrhování nových léčiv Farmakofor ve farmacii označení pro strukturní fragment v molekule spojený s určitou biologickou aktivitou Toxikofor odpovědný za toxické účinky (nitroareny, halogenalkeny, aromatické aminy ) 2-fenylethylamin: seskupení v endogenních neurotrasmiterech, budivých aminech a opiátech, např: adrenalin dopamin methamfetamin

21 Nejběžnější epidemiologické studie Kohortní sledování změn ve vybrané skupině exponované určité látce oproti kontrolní skupině, dlouhé časové období, Cíl: srovnání výskytu určitých nemocí, počtu úmrtí v závislosti na úrovni expozice Případové skupina jedinců s určitou nemocí se srovnává s kontrolní skupinou zdravých jedinců (co nejvíce podobní věk, pohlaví), Cíl: identifikace rizikových faktorů Průřezové náhodný výběr, jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice, pak následuje odpovídající vyšetření, Cíl: popsat vztah mezi nemocí a faktory, které ji mohou vyvolat nebo ovlivnit Tabulka s počty osob z kohortní nebo průřezové studie Expozice Onemocnění Celkem ANO NE ANO a b a + b NE c d c + d Celkem a + c b + d n Riziko onemocnění u exponovaných osob R1 = a/(a+b) Riziko onemocnění u neexponovaných osob R1 = c/(c+d) Relativní riziko R = [a/(a+b)] / [c/(c+d)]

22 Klinické studie Záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků Státní ústav pro kontrolu léčiv V několika fázích, jejichž cílem je získat pro navržený účel použití léku dostatek informací, aby se mohl vyhodnotit poměr mezi jeho prospěchem a riziky: I. Fáze představuje studie/klinická hodnocení nejčastěji prováděná na zdravých dobrovolnících. Výzkum na zdravých dobrovolnících se neprovádí, je-li podání látky zdravému člověku vysoce nevhodné (např. u cytostatik). Zjištění působení v organismu, dávkování pro minimalizaci nežádoucích účinků, od nízkých dávek, NE hodnocení účinnosti léčivého přípravku. II. Fáze Látka podávána v dané indikaci malému počtu vybraných nemocných (desítky až stovky). Ověřují se léčebné účinky. III. Fáze Studie s velkým souborem testovaných osob (stovky až tisíce pacientů) pak žádost o registraci a používání. IV. Fáze Shromažďování informací.

23 Informační zdroje - TOXNET Volně přístupné Informace o toxicitě látek, životním prostředí, lékařství Využívá řadu databází: TOXLINE Toxicology Literature On Line DART - Developmental and Reproductive Toxicology Database HSDB - Hazardous Substances Data Bank CCRIS - Chemical Carcinogenesis Research Information System GENETOX - Genetic Toxicology Data Bank IRIS - Integrated Risk Information System ITER - International Toxicity Estimates for Risk LactMed - Drugs and Lactation Database Household product Database

24 Zdroje toxikologických dat Web of Science (WoS) přístupné z VŠCHT Praha, přírodní a technické vědy Scopus přístupné z VŠCHT Praha, široké zaměření přírodní, technické, lékařské a humanitní vědy PubMed volně přístupné, medicína, farmakologie MedScape volně přístupné, medicína, toxikologie z pohledu medicíny

25 Informace o toxicitě Státní zdravotní ústav Centrum toxikologie a zdravotní bezpečnosti (CTZB) - toxikologické metody, biomedicína, chemická bezpečnost výrobků, toxikogenomika, + Národní referenční laboratoře a centra (NRL, NRC) Toxikologické informační středisko (TIS) Co dělat při akutní otravě volejte nebo Klinika pracovního lékařství 1. LF UK a VFN např. Centrum pracovního lékařství, Laboratoř průmyslové toxikologie možnost vyšetření biologického materiálu

26 Zákon 350/2011 Sb o chemických látkách a chemických směsích a o změně některých zákonů (chemický zákon) Upravuje práva a povinnosti právnických osob a podnikajících fyzických osob při výrobě, klasifikaci, zkoušení nebezpečných vlastností, balení, označování, uvádění na trh, používání, vývozu a dovozu chemických látek (a směsí) Definuje vlastnosti látek a směsí a skupiny nebezpečnosti: Výbušné Oxidující Vysoce toxické Toxické Karcinogenní 3 kategorie dle EU Extrémně hořlavé Vysoce hořlavé Zdraví škodlivé Žíravé Mutagenní Toxické pro reprodukci Hořlavé Dráždivé Nebezpečné pro životní Senzibilizující prostředí Výrobce, dovozce nebo následný uživatel, který uvádí na trh látku nebo směs, ji v závislosti na intenzitě jejích nebezpečných vlastností při klasifikaci zařazuje do jedné nebo více skupin nebezpečnosti.

27 Nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci a označování látek a směsí = nařízení CLP (classification, labelling and packaging) Nařízení CLP je právně závazné ve všech členských státech EU. Je přímo použitelné, většinou implementované do vnitrostátních právních předpisů GHS (Globálně harmonizovaný systém) - mezinárodní harmonizaci kritérií klasifikace látek a směsí Pokud je látka klasifikována jako nebezpečná informují výrobci, dovozci a následní uživatelé o nebezpečnosti prostřednictvím označení (např. štítek) Povinné údaje: a) jméno, adresa, tel. číslo dodavatele b) jmenovité množství látky c) identifikace výrobku d) výstražné symboly e) signální slova f) standardní věty o nebezpečnosti g) pokyny pro bezpečné zacházení

28 Nařízení (ES) č. 1272/2008 H věty (standardní věty o nebezpečnosti) P věty (pokyny pro bezpečné zacházení Do Vyhláška č. 402/2011, R věty: standardní věty označující specifickou rizikovost a S věty: standardní pokyny pro bezpečné zacházení. Výstražné symboly nebezpečnosti podle (ES) č. 1272/2008 Fyzikální nebezpečnost Nebezpečnost pro zdraví Nebezpečnost pro ŽP

29 Bezpečnostní listy Material Safety Data Sheets (MSDS) Pokud je daná látka klasifikována jako nebezpečná podle nařízení (ES) č. 1272/2008, je povinností osoby (výrobce i dovozce), která uvádí látku na trh, vypracovat Bezpečnostní list (u nás např. Penta, Sigma-Aldrich) Skládá se z několika oddílů Identifikace látky/směsi a společnosti, Identifikace nebezpečnosti, Složení/Informace o složkách, Pokyny pro první pomoc, Opatření pro hašení požáru, Opatření v případě náhodného úniku, Zacházení a skladování, Osobní ochranné prostředky, Fyzikální a chemické vlastnosti, Stálost a reaktivita, Toxikologické informace, Ekologické informace, Pokyny pro odstraňování, Informace o přepravě, Informace o předpisech

30 Další informační zdroje US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) - Protects Our Health, Environment & Economy Rozsáhlé studie: např. EPA-823-R Water Quality Criterion for the Protection of Human Health: Methylmercury 303 stran US FDA (U.S. Food and Drug Administration) - Protecting and Promoting Your Health WHO- World Health Organization IPCS - International Programme on Chemical Safety Vliv chemických látek na lidské zdraví, hodnocení rizika, posílení chemické bezpečnosti, management Evropská Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci

31 Knihy o toxikologii Články WoS, Scopus, PubMed Bezpečnostní listy (MSDS) Databáze - TOXNET H věty P - věty SZÚ, TIS, Klinika pracovního lékařství PEL, NPK, NPK-P Hg IARC, NTP, US EPA, GHS RfD, ADI, TDI, ARfD Aktuální Studie (WHO, IPEN, NGOs, BRI) Zákon 350/2011 Sb Nařízení (ES) č. 1272/2008 Nařízení vlády 361/2007 Sb. Testy toxicity