MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2009 OMELKOVÁ VLADIMÍRA

2 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Název diplomové práce Mikrobiální osídlení různých druhů mouky Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Omelková Vladimíra Brno 2009

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: mikrobiální osídlení různých druhů mouky vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

4 Děkuji tímto vedoucímu této diplomové práce Ing. Liborovi Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení a připomínky, které věnoval mé práci. Zároveň děkuji celému kolektivu ústavu agronomie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. Dále děkuji všem, kteří napomohli při vytvoření této diplomové práce, zvláště pak Ing. Václavu Brachtlovi, RNDr. Anně Ivanové, Bc. Tomáši Hajduchovi a rodičům.

5 Obsah str. 1. ÚVOD CÍL PRÁCE SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY Obecné požadavky na mouku Mikroorganismy vyskytující se v mouce Bakterie vyskytující se v mouce Erwinia herbicola (Pantotea agglomerans) Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus Ostatní bakterie v mouce Kvasinky vyskytující se v mouce Saccharomyces cerevisiae Candida Rhodotorula Torulopsis Plísně vyskytující se v mouce Fyzikálně chemické podmínky pro růst a množení plísní Aspergillus Penicillium Alternaria Mucor Fusarium Cladosporium Vady v mouce způsobené mikroorganismy Samozahřívání mouky Kysnutí mouky Nitkovitost mouky a pečiva Plesnivění mouky Mykotoxiny a jejich výskyt v mouce Přehled nejdůležitějších mykotoxinů a jejich producentů vyskytujících se v mouce

6 Aflatoxiny Ochratoxiny Patulin Trichotheceny Zearalenon Toxické účinky mykotoxinů a metody stanovení EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál a metody Stanovované skupiny mikroorganismů Složení a příprava živných půd Vyjádření výsledků Výsledky a diskuze ZÁVĚR LITERATURA

7 1. ÚVOD Obiloviny jsou strategickou a historicky nejvýznamnější plodinou. Člověk nejprve sbíral semena z planě rostoucích rostlin a jimi doplňoval především masitou stravu. Archeologické výzkumy dokládají, že již v dobách neolitu, kdy člověk poznal jejich nenahraditelnost, je začal pěstovat. Obiloviny patří botanicky mezi trávy. Téměř všechny známé obiloviny patří do čeledi lipnicovité (Kučerová, 2004). Vlastní historie pekařství byla zahájena poznáním kvasných pochodů a následnou výrobou kvašeného chleba. Staří Egypťané využívali technologii kvašení již ve 13 stol. př. n. l. Výrobu chleba rovněž znali Židé a Řekové již před lety a pro rozkvašování používali kousek starého zralého těsta nebo rozkvašené sladké víno (Steibel, 1996). Cereální výrobky mají ve výživě člověka nezastoupitelné místo. Jsou především zdrojem energie, sacharidů a rostlinných bílkovin. Vzhledem k výši spotřeby jsou také významné obsahem vitamínů skupiny B a fosforu (Nováková, 2000). Dále zrno obsahuje biologicky významné látky jako cholin, který má velký význam pro nervomotorickou činnost. Kyselina para-aminobenzoová je významný růstový faktor. Cereálie mají zvýšený obsah tzv. fytochemikálií (flavanoidy, glukanáty, fytáty, ligniny), které mají ochranný účinek vůči některým onemocněním (Kučerová, 2004). Pekařské výrobky bezesporu patří mezi potraviny denní spotřeby, ze statistických údajů lze vyčíst, že spotřeba běžného pečiva se dnes pohybuje okolo 40 kg na osobu a rok, u chleba je to 55 kg na osobu a rok a u trvanlivého pečiva 7 kg na osobu a rok (Nováková, 2000). Dnešní spotřebitelé již nehodnotí nabízené produkty pouze podle jejich ceny, ale kladou důraz i na kvalitu výrobku, zejména na jeho senzorickou jakost a zdravotní nezávadnost. Výroba a distribuce pekařských výrobků vyžadují v zájmu uspokojení požadavků spotřebitele a ochrany jeho zdraví vysoký stupeň čistoty. Je tedy velice důležité, aby mlýnsko-pekárenský a cukrárenský průmysl zajišťoval hygienicky bezvadný stav svých provozoven, skladovacích prostor, manipulačních pomůcek i přepravních prostředků (Tichá, 1988). Tato práce si klade za cíl posoudit, zda a do jaké míry jsou pekařské výrobky kontaminovány mikroorganismy a jaké vady a onemocnění mohou přítomné mikroorganismy způsobit. 1

8 2. CÍL PRÁCE Hlavním záměrem této diplomové práce bylo posouzení mikrobiálního osídlení různých druhů mouky. Byly vytýčeny následující cíle: Zpracovat literární rešerši v níž budou shrnuty poznatky o mikroflóře mouk. Zaměřit se na kontaminující mikroorganismy. Charakterizovat mikroorganismy a produkty jejich metabolismu negativně ovlivňující lidské zdraví. Charakterizovat opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům. Experimentálně stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných výrobcích. Výsledky zpracovat tabelárně popř. graficky. Vyhodnocení provést formou diskuse a výsledky shrnout v závěru práce. 2

9 3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1 Obecné požadavky na mouku Mouka je univerzální surovina pro výrobu celého pekařského sortimentu, ve většině těst tvoří 60 % i více z jejich hmotnosti. Rozhodující význam pro výrobu pečiva má pšeničná mouka. Žitná mouka se používá téměř výhradně k výrobě chleba, v pečivu ji najdeme vyjímečně (např. dalamánky). Předehřátá a prosátá mouka ve výrobě musí odpovídat veškerým jakostním a hygienickým požadavkům. Dle vyhlášky Mze č. 333/1997 Sb. se moukou rozumí mlýnský obilný výrobek získaný mletím obilí a tříděný podle velikosti částic, obsahu minerálních látek a druhu použitého obilí. Senzorické, fyzikální a chemické požadavky na jakost mouky Na jakost mouky jsou kladeny následující požadavky (Tab. 1 a 2) dle vyhlášky č. 333/1997 Sb. Vlhkost mouk ze všech druhů obilovin, pohanky a rýže smí být nejvýše 15 %. Kukuřičná mouka smí obsahovat nejvýše 3 % tuku v sušině. Mouky nesmějí být běleny chlorem. Celozrnné mouky smí obsahovat nejvýše 1,9 % minerálních látek. Tab. 1 Fyzikální a chemické požadavky na mouky (příloha 2 vyhlášky č. 333/1997 Sb.). Podskupina Granulace*1(µm%) velikost ok/propad nejméně /nejvýše Minerální látky (popel)*2 (% hmotnosti v sušině) nejvýše Mouka hladká z toho 257/96 162/75 - Pšeničná světlá - 0,6 Pšeničná polosvětlá - 0,75 Pšeničná chlebová - 1,15 Žitná světlá (výražková) - 0,65 Žitná tmavá (chlebová) - 1,1 Mouky polohrubé 366/96 162/75 0,5 Mouky hrubé 485/96 162/15 0,5 *1 granulace = velikost podílu částic, které propadají sítem stanovené velikosti ok *2 minerální látky (popel) = nespalitelné látky, které zůstanou po spálení 3

10 Tab. 2 Senzorické požadavky na jakost mouky (příloha 2 vyhlášky 333/1997 Sb.) Název mouky Barva Mouka pšeničná Bílá s nažloutlým odstínem Mouka chlebová Bílá se žlutozeleným nebo našedlým odstínem Mouka celozrná Hnědavý načervenalý nebo tmavočervený odstín Mouka žitná světlá výhražková Bílá Mouka žitná tmavá (chlebová) Šedobílá se zelenomodrým odstínem Tab. 3 Fyzikální a chemické požadavky na směsi na výrobu vybraných druhů pekárenských výrobků Druh Vlhkost v Obsah Popel v % Titr. Min. výrobku % nejvýše NaCl v % nejvýše kyseliny mmol.kg -1 nečistoty v % nejvýše Chlebové 14 4,0 4, ,15 výrobky Pšeničné 14 3,0 3, ,15 pečivo běžné Pšeničné pečivo jemné 14 3,0 2,5-0, Mikroorganismy vyskytující se v mouce Zrna a obilné produkty normálně obsahují několik druhů bakterií, kvasinek a plísní, které jsou druhově specifické a závislé na podmínkách se kterými se setkali během produkce, sklízení, uskladnění a zpracování. Zrna určená pro lidskou spotřebu jsou vypraná, vytříděná, ošetřená před tím, než se podrobují procesu mletí. Během mletí a prosévání, oddělíme slupku (otruby), zárodek a endosperm. Endosperm je pak rozdrcený na mouku. Každý krok v předběžné úpravě a mlecí operace snižuje množství mikroorganismů. Bez ohledu na mikroorganismy obsažené v mouce, profil mikroflóry v mletých zrnech je podobný jako v celých zrnech (Brackett, 2004). 4

11 Pšeničná a žitná zrna a výrobky vyrobené z těchto obilnin mohou být kontaminovány mikroflórou z půdy, životního prostředí nebo během jejich dalších zpracování. Tyto produkty mají nízké hodnoty vodní aktivity, vyšší obsah bílkovin, sacharidů, lipidů, jsou-li dobře skladovány, je zamezeno růstu všech mikroorganismů. Mikroflóra mouky je relativně málo početná, v důsledku působení bělících prostředků, které se používají na bělení mouky na požadovanou barvu (Golden, 2003). Během skladování postupně hynou epifytní druhy mikroorganismů (tj. mikroorganismy vyskytující se na rostlinách během vegetace) včetně Erwinia herbicola (nově Pantotea agglomerans). Avšak ani dlouhým sladováním se obilí nezbaví mikroorganismů úplně. Zmizí pouze nesporolující bakterie, kdežto spory plísní a sporotvorné bakterie zůstávají. Čištěním obilí se počet mikroorganismů částečně sníží. Mlecím procesem se odstraní povrchové částice zrna, ale přesto stačí ještě infikovat mikrobiologicky poměrně čistý endosperm. Mouky výše vymleté (zadní) obsahují větší počet otrubnatých částic, a tím i větší počet mikroorganismů než mouky málo vymleté tj. světlejší přední. Rozdíl je i mezi moukou žitnou a pšeničnou. Žitné mouky obsahují většinou vyšší počet mikroorganismů, protože mají větší podíl rozpustných látek než mouky pšeničné (Müller, 1986) Bakterie vyskytující se v mouce Množství bakterií v moukách je poměrně vysoké a kolísá od několika tisíc až do milionů v jednom gramu mouky. Mouky obsahují různé bakterie především půdní. Z půdních bakterií se vyskytují především Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacillus megatherium, máselné a octové bakterie a bakterie rodu Achromobacter a další bakterie (Pokorný, 1956). Dále jsou v mouce přítomny Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium, Micrococcus, Sarcina, Escherichia coli a Enterobacter aerogenes (Müller, 1986) Erwinia herbicola (Pantotea agglomerans) Druh Erwinia herbicola byl v současné době přejmenován na druh Pantotea agglomerans. Erwinia herbicola (Pantotea agglomerans) roste na běžných půdách, tvoří kolonie zlatavě nebo načervenale zbarvené. Nenarušuje zrno a ve starším obilí postupně hyne. Při dýchání uvolňuje značné množství tepla, které podporuje vznik samozáhřevu. V obilí špatné jakosti a nevhodně skladovaném Erwina herbicola rychle mizí a rozmnožují se plísně a bakterie. Na tyto bakterie působí plísně antagonisticky. 5

12 Na zdravém čerstvém obilí tvoří 50 až 98 % všech přítomných bakterií (Hoffman, 1986). Z obilí přechází do mouky. V roce 1986 Lind a Ureiny prováděli klinické testy a 52 testů z 86 testů vykazovali synonymičnost z Entrerobacter agglomerans, Erwinia herbicola. Tato synonymičnost byla potvrzená od Beji v roce 1988, která navíc identifikovala DNA skupinu 13 (Brenner, 1989) s Enterobacter agglomerans sensu strictu. Pro oddělení Enterobacter a Erwinia herbicola z rodů Enterobacacter a Erwinia vzniklo nové označení rodu Pantoea (Brenner, 2005). Rod Pantoea tvoří gramnegativní rovné tyčky pohyblivé s peritrichálními bičíky, většinou produkují žlutý pigment. Fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní, mající jak respiratorní, tak i fermentatorní typ metabolismu. Optimální růstová teplota je okolo 32 C, ale rostou pomalu (Sedláček, 2007). Pomalu rostou při 4 C a 41 C. Buňky mohou tvořit symplasmata. (Brenner, 2005). Glukózu i jiné sacharidy okyselují, ale bez tvorby plynu, jsou oxidáza negativní, kataláza pozitivní, indol negativní. Bývají izolovány z povrchu rostlin, semen, půdy a vody, stejně jako z klinického materiálu od zvířat a lidí (rána, krev, moč). Jedná se o oportunní patogeny pro člověka. Některé jsou fytopatogenní. Někteří zástupci původně patřili k enterobakterům nebo erwiniím (Sedláček, 2007) Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus Rod Bacillus druhy Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus. Rod Bacillus v sobě zahrnuje celou řadu druhů s podobnými biochemickými vlastnostmi. Jsou to tyčinkovité bakterie, označující se jako bacily. Velikost buněk je 2 až 3 µm x 0,7 až 0,8 µm. Jsou převážně pohyblivé, způsob výživy je chemoorganotrofní a optimální kultivační teplota je 30 C. U většiny druhů mají peritrichní umístnění bičíků ( Jsou schopné vytvářet vysoce rezistentní intracelulární spory. Jsou přítomny v povrchových vrstvách půdy, kde se zúčastňují přeměny složitých organických látek. Odtud se dostávají do vzduchu, do vody, na rostliny a jejich plody. Proto jsou hojně přítomny na cereáliích, z nichž se při mlecím procesu dostávají do mouky (Tichá, 1988). Vzhledem k velkému množství druhů je druhová diferenciace obtížná. Tvar endospóry i mateřské buňky jsou charakteristickými znaky jednotlivých druhů bacilů využitelných v taxonomii. Podle těchto charakteristik je možno dělit více než 60 zástupců rodu Bacillus do tzv. tří morfologických skupin: 6

13 I. morfologická skupina endospóry oválného tvaru, endospóra neztlušťuje mateřskou buňku. Do této skupiny patří zmiňované druhy B. subtilis, B. licheniformis, B. pulmilus, B. mesentericus. II. morfologická skupina endospóry oválného tvaru, endospóra vždy ztlušťuje mateřskou buňku. III. morfologická skupina endospóry kulatého tvaru, endospóra vždy ztlušťuje mateřskou buňku (Sedláček, 2007). Charakteristickou vlastností baktérií z rodu Bacillus je schopnost vytvářet vysoce rezistentní spory. Jde o spory endogenní vznikající uvnitř buňky, a to centrálně, paracentrálně či terminálně. Jsou kulovité nebo eliptické. Ke sporulaci dochází tehdy, když se kultura nachází v podmínkách nepříznivých pro růst a množení, např. při vyčerpání živin apod. Sporulace je proces řízený geneticky. Spory se od vegetativních buněk odlišují nejen morfologicky, ale i chemickým složením. Obsahují více lipidů a minimální množství vody asi na úrovni dehydrovaných proteinů. Spory jsou odolné vůči extrémním podmínkám. Odolávají vyschnutí, slabým kyselinám a hydroxidům, oxidačním činidlům a záření. Jsou rovněž termostabilní. Vydrží několik hodin varu, suché teplo 160 C je devitalizuje až na několik hodin. Tlakové páře o teplotě 115 C odolávají i více hodin. Termostabilita spor je ovlivňována ph prostředím. Je známo, že termostabilita spor je podmíněna nejen minimálním obsahem vody, ale také přítomností kyseliny dipikolinové a iontů Ca 2+ (Tichá, 1988). Bakterie z rodu Bacillus jsou přítomné ve značných koncentracích v půdě a dostávají se odtud na obiloviny, do mouk a pekárenských výrobků. Během bělícího procesu, při němž nepřestoupí teplota uvnitř výrobku 95 C, nedochází k usmrcení spor zmíněných bakterií. Tyto spory za vhodných podmínek vyklíčí ve vegetativní buňky, vodní aktivitě a ph výrobku, dále pak na podmínkách skladování teplota, vlhkost, doba (Tichá, 1988). Mezi nejdůležitější druhy patří Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus, které v mouce způsobují nitkovitost. Nitkovitost je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto bakterií společně s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu, který po zcukření podporuje tvorbu pouzder. Mouka začne vlhnout, při doteku se vytahuje do dlouhých nití, odtud název vady nitkovitost pečiva Ostatní bakterie v mouce Rod Pseudomonas jsou gramnegativní rovné nebo mírně zakřivené tyčky. Pohyblivé jedním nebo několika polárními bičíky, pouze zřídka jsou nepohyblivé. 7

14 Aerobní se striktně respiratorním typem metabolismu, kdy kyslík je konečným akceptorem elektronů. Většina druhů nevyžaduje žádné růstové faktory. Široce rozšířené v prostředí, některé druhy jsou patogenní pro člověka, zvířata nebo rostliny (mohou být multirezistentní). Významnými druhy jsou: Pseudomonas aeruginosa vyskytující se v půdě, vodě, humánním klinickém materiálu je příležitostně patogenní pro rostliny, produkuje pigmenty modrozelený pyocyanin, žlutozeleně fluorescentní pyoverdin (fluorescein), ojediněle i tmavě červený pigment a Pseudomonas fluorescens vyskytující se v půdě, vodě, potravinách, humánním klinickém materiálu, některé kmeny jsou patogenní pro rostliny, produkují fluorescein, známe 5 biovarů od tohoto druhu jak uvádí Sedláček. Rod Achromobacter jsou gramnegativní rovné tyčky se zakulacenými konci, nespirálující, pohyblivé jedním až dvaceti peritrichálními bičíky. Obligátně aerobní a nefermentující, někteří zástupci jsou schopni aerobní respirace s nitrátem jako akceptorem elektronů. Chemoorganotrofní, jako zdroj uhlíku využívají řadu organických kyselin a aminokyselin, sacharidy obvykle neutilizují.obsahují charakteristické mastné kyseliny. Bývají izolovány z půdy, vody, nemocničního materiálu a prostředí (Sedláček, 2007). Rod Sarcina mají buňky většinou sférické, vyskytují se v krychlovitých balíčcích z osmi nebo více buněk. Některé buňky se vyskytují jednotlivě nebo po dvou a v tetrádách, buňky jsou obvykle zploštělé v místech kontaktu se sousedícími buňkami. Grampozitivní, anaerobní, nepigmentující a nepohyblivé. Mohou vytvářet spory. Chemoorganotrofní, vyžadují bohatá média a sacharidy. Jsou široce rozšířené v prostředí, běžně izolovány ze střevního traktu savců a z obilných zrn. Zástupci Sarcina maxima a Sarcina ventriculi byly izolovány z půdy, bláta, z povrchu obilných zrn (Sedláček, 2007). Rod Flavobacterium mají gramnegativní tyčky se zakulacenými konci, nespirálující, nepohyblivé. Aerobní se striktně respiratorním typem metabolismu. Kolonie mohou být pigmentující (žluté až oranžové) (Sedláček, 2007). Rod Acetobacter mají elipsoidní, mírně zakřivené až rovné tyčky vyskytující se jednotlivě, po dvou nebo v řetízcích. Buňky mohou být pohyblivé (peritrichální nebo laterální bičíky) nebo jsou nepohyblivé. Obligátně aerobní, mohou produkovat pigmenty. Chemoorganotrofní, optimální teplota 25 až 30 C, optimální ph pro růst 5,4 až 6,3. Acetobaktery se vyskytují na květech, ovocných plodech, v medu, v zahradní 8

15 půdě a ve vodě. Nepatogenní pro člověka a zvířata. Některé acetobaktery mohou způsobit kažení fermentovaných masných výrobků (Sedláček, 2007). Druh Escherichia coli jsou gramnegativní tyčinky, které se běžně vyskytují ve střevním traktu lidí a vyšších obratlovců. Escherichia coli dobře roste na běžných půdách v rozmezí teplot 10 až 46 C s teplotním optimem 37 C. Zkvašuje laktosu, glukosu, maltosu a celou řadu sacharidů. Většina kmenů Escherichia coli je nepatogenní, dokonce je počítáme mezi komenzály střevního traktu lidí. Za určitých okolností (při oslabení organismu, nemoci, hladovění apod.) se však chovají jako patogeny (Tichá, 1988) Kvasinky vyskytující se v mouce Kvasinky se v mouce vyskytují jen v menším množství. Bývají zastoupeny rody Sachcaromyces, Torulopsis, Rhodotorula. Kvasinka Endomycopsis fibuliger je nežádoucí, protože způsobuje křídovitost střídy pečiva. Na jakost správně skladované mouky nemají kvasinky podstatný vliv. V silně napadené mouce jsou však stejně nebezpečné jako bakterie a mohou se podílet i na jejím samozáhřevu (Hoffman, 1986). Kvasinkové mikromycety nejsou samostatnou taxonomickou skupinou. Dříve se poměrně striktně rozlišovaly tzv. pravé a nepravé kvasinky. Pravé kvasinky se rozmnožují pohlavně, za příznivých podmínek vyvářejí askospory, popřípadě basidiospory. Ostatní kvasinky zvané nepravé kvasinky nebo též kvasinkovité mikroorganismy se rozmnožují výhradně asexuální cestou (Ondrovčík, 2003). Kvasinky mají v potravinářské technologii dvojí význam, jako technologicky využívané mikroorganismy v kvasném průmyslu, při výrobě pekařských produktů, ale působí také patogenně. Patogenní kvasinky je při porovnání s patogenními bakteriemi poměrně málo - asi 15 druhů ze 4 rodů, přičemž většinou jde pouze o potencionální patogeny, vyvolávající onemocnění u oslabeného organismu (Janderová, Bendová, 1999) Saccharomyces cerevisiae Uvedený rod Saccharomyces zavedl v roce 1838 Meyven. Byla to tehdy jedna z prvních objevených kvasinek. Použil název pro pivovarskou kvasinku a odlišil ji od kvasinek, které zkvašovali ovocné mošty. Od této doby byly popsány další druhy rodu a jejich variety, které v osmdesátých letech dosáhly počtu 87. Druhy rodu Sachcaromyces cerevisiae mají buňky kulaté, oválné, cylindrické, které multilaterálně pučí. Vegetativní 9

16 fáze je převážně diploidní nebo někdy i vyšší ploidity. Spory jsou hladké, zpravidla 1 až 4 ve vřecku, které přetrvává (Janderová, Bendová, 1999). Druh Saccharomyces cerevisiae je pivní, vinná, lihovarnická a pekařská kvasinka. Fermentuje glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, rafinózu. Laktózu a dusičnan neasimiluje. Tvar buněk je kulatý až oválný se zřetelnou ostře ohraničenou vakuolou, což je charakteristické pro starší buňky. Buňky mívají rozměr 6 až 7 x 7,5 až 8,5 µm (Görner, Valík, 2004). V pekárenském průmyslu využíváme vlastnosti kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae v podobě lisovaného pekařského droždí při výrobě běžného a jemného pečiva, případně jiných kynutých výrobků. Pomocí genetického inženýrství jsou připravovány nové kmeny kvasinek žádoucích vlastností. Užívá se přitom metoda hybridizace, mutace, transformace aj. (Tichá, 1988). Z fyziologických vlastností má největší praktický význam jejich schopnost anaerobně zkvašovat hexózy na etanol a CO 2 podle rovnice: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2. Teoretický výtěžek je podle této rovnice 51,1 %. Proces etanolového kvašení je složitý a probíhá v řetězci vázaných na fosforylový mechanismus (Görner, Valík, 2004) Candida Rod Candida se vyznačuje především rozmanitými tvary buněk, které multilaterálně pučí. Mohou se tvořit asexuální chlamydospory. Pseudomycelium může být větvené, diferencované s blastokonidiemi nebo rudimentární. Neschopností tvořit pseudomycelium se od rodu Candida dříve odděloval rod Torulopsis (Janderová, Bendová, 2003). Jako všechny kvasinky využívá při svém metabolismu cukry a jako většina kandid je kvasí za tvorby CO 2. Kvasinky jsou odolné vůči nižšímu ph, které si vytvářejí při kvašení cukrů (Votava, 2003). Patogenní kvasinky rodu Candida Z asi 80 druhů tohoto rodu patří mezi potenciální patogeny maximálně 9 druhů. Dosud není jasné, které faktory a v jaké míře přispívají k patogenitě těchto kvasinek (Janderová, Bendová, 1999) Rhodotorula Rod Rhodotorula je nápadný růžově, oranžově až cihlově červeně zbarvenými koloniemi. Mnoha vlastnostmi je blízký kryptokokům. K nejčastěji izolovaným druhům náleží Rhodotorula rubra, způsobující občasné onychomykózy nebo infekce kůže a sliznic (Ondrovčík, 2003). 10

17 Jedná se o kvasinky rozšířené ve vzduchu, v půdě, ve sladkých i slaných vodách, ve vinařských provozech, na rostlinách i různých orgánech živočišného těla. Kolonie jsou hladké, lesklé, slizovité. V tekutém médiu tvoří Rhodotorula sediment a prstenec. Všechny druhy rodu Rhodotorula jsou lipidotvorné. Za určitých podmínek hromadí v buňkách tuk až v nadměrném množství. Tyto organismy tvoří červené barvivo karotenoidní povahy, nerozpustné ve vodě, lokalizované na vnitřní straně plasmatické membrány a nedifundující do média. Podmínkou jeho tvorby je přístup kyslíku a světla (Janderová, Bendová, 2003) Torulopsis Někteří mykologové tento rod neuznávají a jeho příslušníky řadí do rodu Candida (Ondrovčík, 2003) Plísně vyskytující se v mouce Plísně jsou mikroskopické organismy, které vytvářejí chomáčkovité, barevné povlaky na různých substrátech. Botanicky plísně náležejí mezi houby (Mycota). Obecně užívaný pojem plísně zahrnuje ve skutečnosti jednak plísně pravé (řád Mucorales), jednak vláknité houby nedokonalé (třída Deuteromycetes) a z nich zejména řád Monialiales. Základním morfologickým útvarem je vlákno (hyfa). Vlákna jsou buď bez přehrádek nebo jsou pravidelně či nepravidelně článkovaná. Jednotlivá vlákna se větví a proplétají. Tuto spleť vláken nazýváme mycelium. Rozeznáváme mycelium substrátové (prorůstá substrátem, na němž se plíseň rozmnožuje) a mycelium vzdušné, které je často bohaté a vystupuje až na několik cm nad substrát (Tichá, 1988). Plísně vyskytující se na obilí můžeme rozdělit do dvou skupin a to na plísně šedé a plísně barevné. Plísně šedé jsou reprezentovány především rodem Rhizopus a Mucor (Mucor racemosus, Mucor pusillum, Mucor spinosum). Považují se za málo škodlivé. Jejich celulolitická aktivita je nepatrná a svým podhoubím nemohou proniknout do obilky. Plísně barevné jsou nejčastěji zelené a černé formy rodu Aspergillus a Penicillium. Jejich schopnost pronikat do obilky je obdivuhodná. Jsou nositeli neodstranitelného zatuchlého pachu a některé druhy mohou být toxické. Z dalších plísní je třeba jmenovat rod Alternaria. Alternaria je psychrofilní, vyskytuje se při teplotách kolem 0 C. Cladosporium je rovněž psychrofilní, s možností aktivního rozvoje až do -6 C. Fusarium a Trichoderma jsou představiteli termofilních druhů s optimem růstu 11

18 kolem 37 C. Při správném skladování plísně pomalu odumírají, za dva měsíce skladování se sníží jejich počet o 90 %. Značná část mikroflóry obilí přechází do mouky. Čištěním obilí se počet mikroorganismů částečně sníží. Mlecím procesem se odstraní povrchové částice zrna, ale přesto stačí ještě infikovat mikrobiologicky poměrně čistý endosperm. Vzhledem k velkému povrchu mouky a bezprostřednímu zpřístupnění živin pro mikroorganismy je kontaminace mouky mnohem nebezpečnější (Müller, 1986). Plísně kontaminující obiloviny jsou přítomny jednak na povrchu obilek (většinou v podobě spor), jednak uvnitř zrna (většinou v podobě mycelia). Je tedy třeba rozeznávat vnější a vnitřní mykoflóru obilí. Vnitřní mykoflóra je tvořena parazitickými a saprofytickými plísněmi, které bývají častěji přítomny v epidermální vrstvě, vzácněji v aleuronových buňkách, endospermu, klíčku. Zatímco parazitické aktivně prorůstají obilkou, saprofytické plísně se dostávají do obilky většinou při jejich mechanickém poškození. V epidermálních vrstvách a ostatních částech zrna se nejčastěji vyskytují plísně rodu Alternaria, Epicoccum, v menší míře Fusarium, Cladosporium, Aspergillus, Penicillium. Vnější mykoflóra - povrch obilek je kontaminován relativně velkou populací spor plísní. Izolací a identifikací jednotlivých druhů plísní se zabývala řada mykologů, kteří prokázali na obilí více než 100 různých druhů plísní. Systematickým studiem bylo zjištěno, že na obilí dochází během jeho zrání, po sklizni a v průběhu skladování k plynulým změnám v kontaminující mykoflóře. Charakter těchto změn je podmíněn jednak vnějšími ekologickými podmínkami relativní vlhkostí, teplem a tenzí kyslíku a přítomností cizích příměsí, jednak stavem zrna samotného jeho vodní aktivitou, teplotou obilní masy, stupněm mechanického poškození. Lze říci, že obsah mikroorganismů v mouce závisí na stupni kontaminace obilí, z něhož je mouka získávána, na způsobu ošetření zrna před mletím (čištění, praní, loupání), stupni vymletí mouky, úrovni hygieny ve mlýně. Obsah plísní v moukách závisí na stupni jejich vymletí. Množství spor plísní v 1 g pšeničné mouky speciál kolísá v rozmezí 200 až 1500, v 1 g chlebové mouky v rozmezí 400 až 3500 (Tichá, 1988) Fyzikálně chemické podmínky pro růst a množení plísní Plísně jsou nenáročné a značně tolerantní k různým, často i extrémním podmínkám vnějšího prostředí. 12

19 Tolerance k teplotě Plísně jsou schopny růst v širokém rozmezí teplot od -8 do 90 C. Při optimální teplotě, která je odlišná pro jednotlivé druhy, však rostou mnohonásobně rychleji. Tak jako u všech mikroorganismů rozlišujeme i u plísní druhy psychrofilní (rostou nejlépe při nízkých teplotách), mezofilní (rostou při středních teplotách) a termofilní (rostou nejlépe při vyšších teplotách). Většina plísní kontaminující cereálie patří mezi plísně mezofilní. Z psychrofilních jsou to některé druhy z rodu Fusarium, Cladosporium, Alternaria. Z termofilních se na obilí vyskytují nejčastěji Aspergillus fumigatus a Mucor pusillus (Tichá, 1988). Počet termofilních mikroorganismů v 1 g mouky dosahuje jen několika desítek. Je-li mouka skladována při teplotách 15 až 20 C, mohou se množit četné druhy mikroorganismů a svou činností připravit podmínky pro rozvoj dalších mikroorganismů, někdy i tepelně náročnějších. Sníží-li se teplota, životní pochody mikroorganismů se zpomalí, popř. zcela zastaví. Dlouhým skladováním mohou některé druhy hynout. Nízké teploty při skladování mohou proto sloužit jako preventivní opatření proti rozvoji mikroorganismů. Snížením teploty na 8 C se životní činnost mikroorganismů výrazně omezí (Müller, 1986). Tolerance k vlhkosti Vlhkost obilí je nejdůležitější podmínkou, která ovlivňuje rozvoj mikroorganismů. Přibližná hranice vlhkosti, při které se mohou mikroorganismy ještě vyvíjet je 14 %. S touto vlhkostí se mohou vyrovnat jenom některé druhy plísní, Aspergillus wenti potřebuje nejméně vlhkost 15,1 %, Penicillium 16,3 % a Aspergillus clavatus a Aspergillus niger dokonce 18,3 % (Müller, 1986). K růstu mycelia je obvykle třeba nižší vlhkost než ke klíčení spor. Při optimální teplotě stačí ke klíčení a růstu plísní nižší relativní vlhkost, při nižší teplotě je naopak třeba vyšší relativní vlhkost (Tichá, 1988). Vlhkost může být způsobena adsorbovanou, kapilární nebo zkondenzovanou vodou. Zkondenzovaná voda je pro rozvoj mikroorganismů nejvhodnější. Ke kondenzaci vody dochází např. při uskladnění mouky ještě teplé po semletí na chladné podlaze skladů nebo při transportu mouky na větší vzdálenosti, kdy je velký teplotní rozdíl mezi moukou a okolním vzduchem (Müller, 1986). Tolerance ke kyslíku Skladuje li se mouka v hermeticky uzavřených prostorách, snižuje se počet mikroorganismů až tisíckrát ve srovnání se skladováním na vzduchu. Plísně jakožto striktní aeroby hynou. Na tomto principu byly založeny pokusy s autokonzervací mouky, při nichž se dýcháním spotřebuje kyslík a nahradí se oxidem uhličitým. Pokusy ukázaly, že některým 13

20 aerobním mikroorganismům postačí jen 2 až 5 % kyslíku a že současně dochází k rozvoji anaerobních mikroorganismů. Aby se omezil rozvoj aerobních i anaerobních mikroorganismů v mouce, je třeba vhodně řídit aeraci mouky při skladování (Hofman, 1986). Tolerance k ph Na rozdíl od většiny mikroorganismů, které rostou a množí se pouze v určitém ph rozmezí, jsou plísně k hodnotám koncentrace vodíkových iontů v substrátu značně tolerantní. Přesto, že optimum ph pro většinu plísní je v rozmezí 5 až 7, mohou tyto mikroorganismy růst ještě při ph 1,5,ale také při ph 11 (Tichá, 1988). Tolerance ke světlu Světlo nemá na činnost mikroorganismů velký vliv, většina přítomných mikroorganismů se rozvíjí i ve tmě. Přímé sluneční paprsky mikroorganismy hubí, jejich účinek se však ve skladech s omezeným přístupem denního světla, navíc přefiltrovaných přes sklo, nemůže nijak projevit (Müller, 1986) Aspergillus Zástupci rodu Aspergillus jsou všudypřítomní. Nacházejí se v půdě, na rostlinných zbytcích, na surovinách, potravinách, ve vzduchu atd. Jsou rovněž běžnými kontaminanty vnější mykoflóry zrna. Některé druhy jsou patogenní pro člověka a zvířata. Řada druhů produkuje toxické metabolity mykotoxiny (Tichá, 1988). Jako nenáročný saprofyt se vyskytuje na obilí, mlýnských a pekařských výrobcích. Často způsobují zkázu potravin s vysokým obsahem cukru a soli a s nízkou hodnotou aktivity vody (Görner, Valík, 2004). Rod Aspergillus patří do řádu Eurotiales mitosporní zástupce Trichocomaceae. Je známo více než 230 druhů, českým názvem se Aspergillus nazývá providlák. Mnohé druhy jsou osmofilní (Kubátová, 2006). Při určování druhů rodu Aspergillus sledujeme makrohabitus na Czapkově agaru, kde zástupci rodu vytvářejí dobře vyvinuté vegetativní mycelium a konidiální aparát i případné plodničky (kleistothecium, askomata). Nepohlavní rozmnožovací struktury rodu Aspergillus jsou tvořeny konidioforem, kteří je hlavicovitě zakončen. Konidiofor vyrůstá buď přímo ze substrátového mycelia nebo ze vzdušných hyf, je hyalinní, žlutě nebo hnědě zbarvený, se stěnou hladkou, zdrsnělou, bradavčitou nebo ostnitou. Na vrcholu se konidiofor pozvolna nebo náhle rozšiřuje v měchýřek kulovitého, polokulovitého, elipsoidního nebo palicovitého tvaru. Po celém povrchu 14

21 nebo na části měchýřku vyrůstají fialidy (konidiogenní buňky), a to buď v jedné řadě, nebo ve dvou řadách za sebou. Primární fialidy (někdy se jim říká metuly) bývají tlustší a delší a nesou na svém vrcholu jednu nebo dvě fialidy sekundární, které jsou obvykle kratší a tenčí. Fialidy jsou lahvicovitého tvaru a jsou na vrcholu zúženy v krátký konidiogenní krček. Jím vypučí tvořící se mladé konidie v bazipetálních řetízcích. Konidie mohou být kulovité, elipsoidní, hruškovité nebo ovální a mají povrch buď hladký, zdrsnělý nebo ostnitý. Měchýřek s fialidami a s řetězci konidií tvoří konidiální hlavici. Narůstají-li fialidy na měchýřku paprsčitě, je tvar hlavice kulovitý nebo oválný. Některé druhy vytvářejí kromě konidiálního stádia i stádium pohlavní s askomaty (kulovité kleistothecium). Vřecka jsou většinou s 8 askosporami, vejčitého, oválného nebo kulovitého tvaru, s prstenci nebo rýhou v ekvatoriální rovině (Malíř, Ostrý, 2003). Obr. 1 Na obrázku je znázorněná perokresbou mikroskopická struktura rodu Aspergillus (Kubátová, 2006). Na Czapek-Doxově agaru vytvářejí různě zbarvené kolonie (zelené, zelenomodré, žlutozelené, černé, okrové, citrónově žluté, bílé, skořicově hnědé). Barva kolonie je jedním z diagnostických znaků. Povrch kolonií bývá sametový, vlnatý, vločkový aj. Aspergillus tvoří rychle rostoucí kolonie po 7 dnech při teplotě 25 C dosahují průměru mm. V kolonii se mohou vytvářet nápadná tmavá sklerocia víceméně kulovitého tvaru. Teplotní optimum této plísně je 33 C, může však růst v rozmezí teplot od do C ( Aspergillus candidus a Aspergillus 15

22 ochraceus se začínají rozvíjet při vlhkosti 15 % (tvoří 75 % plísňové mikroflóry). Aspergillus flavus začíná růst při vlhkosti vyšší než 18 % (Müller, 1986). Jesenská (1987) prováděla rozbory více než 101 vzorků mouky v roce 1981, při kterých izolovala z těchto vzorků nejčastěji kmeny rodu Aspergillus a to Aspergillus candidus, Aspergillus glaucus, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus wentii a další. Většina druhů z rodu Aspergillus jsou toxigenní plísně například Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nonius produkují aflatoxiny. Lidské a veterinární patogeny jsou Aspergillus fumigatus (původce mykóz), Aspergillus niger (ušní plíseň), Aspergillus flavus a jiné (Görner, Valík, 2004). V současnosti bylo popsáno asi 18 druhů aspergilů patogenních pro člověka Ve skutečnosti však více jak 95 % všech infekcí odpovídají pouze tři druhy Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus a Aspergillus niger, z nichž Aspergillus fumigatus výrazně dominuje v etiologii aspergilózy více než s 80 % podílem (Malíř, Ostrý, 2003). Aspergillus flavus tvoří šedozelené kolonie, stářím zhnědne. Vyskytuje se v půdě, na obilovinách, jádrovinách. Některé kmeny produkují mimořádně silný aflatoxin a karcinogenní účinky (Müller, 2006). Aspergillus fumigatus tvoří rychle rostoucí kolonie při teplotě 27 i 37 C. Je schopen růst i při teplotě 55 C. Barva kolonií je sametově zelená. Mikroskopické znaky: konidiofory uniseriátní, s hladkou nazelenalou stopkou (zvláště v horní části) a široce kyjovitým měchýřkem. Konidiální hlavice typicky sloupcovité. Konidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavičnaté, 2,5-3µm v průměru. Aspergillus fumigatus produkuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj. Kontaminant potravin a nebezpečný patogen pro člověka a jiných živočichů (Kubátová, 2006). Aspergillus niger je nejrozšířenějším druhem. Měchýřky jsou kulovité, mycelium bílé v době zralosti konidií černé. Spodní strana je bezbarvá až nažloutlá. (Müller, 1985) Penicillium Rodové označení Penicillium poprvé použil německý botanik Johan H. F. Link ( ) v roce 1809 pro konidiální stádium mikroskopické houby. Historie studia rodu Penicillium spadá do začátku 19. století. Velkým přínosem ve studii rodu Penicillium byl přechod od pozorování růstu na přirozeném substrátu a na herbářových 16

23 položkách využití kultivačních metod čistých kultur, které začali využívat významní mykologové např. Brefeld, Dierckx, Sopp a mnoho dalších (Malíř, Ostrý, 2003). Penicillium patří do řádu Eurotiales a je to druhově velmi bohatý rod, čítá přes 250 druhů. V přírodě je to jedna z nejčastěji se vyskytujích hub (půda, ovzduší) - významný rozkradač rostlinných zbytků. V prostředí člověka častý kontaminant potravin a krmiv. Penicillium je producentem mykotoxinů a mnoha dalších exterolitů. Je to také alergenní houba (malé konidie působí jako alergeny. Existuje pouze jeden patogenní druh a to Penicillium marneffei (Kubátová, 2006). Příslušníci rodu Penicillium patří k nejrozšířenějším vláknitým mikromycetům teplého a mírného klimatu. Jejich spóry jsou prakticky všudypřítomné, a proto jsou tyto mikromycety také velmi častými kontaminanty potravin, životního a pracovního prostředí člověka (Malíř, Ostrý, 2003). Makroskopické znaky kolonie se hodnotí na standardních živných médií CYA, MEA při standardní kultivační teplotě 25 C. Kolonie dosahují v průměru mm. Roste v rozmezí teplot od 4 C do 35 C ( Ploché, vlnovité, rýhované nebo zrnité kolonie, vzdušné mycelium je obyčejně bezbarvé, substrátové mycelium často zbarvené v závislosti na druhu. Častá přítomnost výpotku (exudátu). Mnohé druhy vytvářejí sklerocia (Görner, Valík, 2004). Morfologické znaky jsou založeny na nepohlavním stádiu houby, jehož hlavní součástí jsou konidiofory, slouží k tvorbě spor konidií, jimi se houba šíří v prostředí. U některých druhů je i známo pohlavní stádium Eupenicillium, Talaromyces, charakteristické tvorbou drobných plodnic (menších než 1 mm) (Kubátová, 2006). Mezi nejvýznamnější mikroskopické znaky patří typ větvení, povrchová struktura, velikost konidií, tvar konidií, fialid. 17

24 Obr. 2 Na obrázku je znázorněná perokresbou stavba konidioforu rodu Penicillium ( Obr. 3 Stavba a uspořádání konidiofor u jednotlivých podrodů (Kubátová, 2006). Každý z podrodů má specifickou stavbu konidioforu. Podrod Aspergilloides má konidiofor monoventricilátní, podrod Penicillium má konidiofor asymetricky větvený tervertcilátní, podrod Biverticillium biverticilátně symetrický a podrod Furcatum má 18

25 konidiofor divarikátní. Konidiofor tvoří u podrodu Aspergilloides fialidy (konidiogenní buňky), u podrodu Biverticillium fialidy a metuly u podrodu Penicillium a Furcatum fialidy, metuly a větve. Tvar konidiogenní buňky u podrodů Aspergilloides, Penicillium a Furcatum je lahvičkovitý (ampuliformní) a u podrodu Biverticillium je kopíčkovitý (lanceolátní acerózní). Konidie jsou většinou uspořádány do řetízků (Malíř, Ostrý, 2003). Konidie jsou jednobuňkové okrouhlé nebo oválné, zelené, hnědé, modré, červené nebo jinak zbarvené Některé druhy vykazují i pohlavní rozmnožování a tvoří kulovité asky ve kterých jsou umístněné askospory (Görner, Valík, 2004). Na pšenici zejména během skladování se vyskytuje řada druhů, z nichž nejčastější jsou podle různých autorů: Penicillium cyclopium, Penicillium expansum, Penicillium thomii, Penicillium brevicompactum, Penicillium viridicatum, Penicillium roqueforti (Tichá, 1988). Penicillium thomii vytváří kolonie velmi rychle rostoucí, sametové, tmavozelené s bílým okrajovým myceliem. V koloniích se tvoří bělavá až narůžovělá sklerocia. Při 37 C neroste. Konidie monoverticilátní, bradavčité, s malým měchýřkem. Produkce mykotoxinů není známa (Kubátová, 2006). Penicillium expansum vytváří sivě zelené až modrozelené kolonie soustředně vrstevnaté s bílým okrajovým lemem. V přírodě je původcem hniloby jablek a hroznů révy vinné. Produkuje toxin Paulin (Müller, 1986). Kolonie Penicillium notatum mají sametový vzhled a na povrchu hluboké paprsčité rýhy, které pronikají až na spodní stranu. Kolonie jsou modrozelené nebo šedozelené, okrajový bílý lem je široký 1 až 2 mm. Na povrchu kolonie tvoří žlutý nebo žlutohnědý výpotek. Spodní strana kolonie je žlutá, zlatožlutá až hnědožlutá. Pigment obvykle prolíná i do okolního agaru. A. Flemming objevil, že tento druh produkuje penicilin. Penicillium viridicatum tvoří kolonie vlnaté, vločkovité až zrnité, zelené nebo žlutozelené s lemem širokým 1 až 2 mm. Výpotek je čirý nebo nažloutlý. Spodní strana kolonií je bezbarvá, žlutá nebo světle hnědá. Vyskytuje se v půdě a zejména na obilí. Některé kmeny produkují toxiny, ochratoxin A, citrinin aj. (Hofman, 1986) Alternaria Druhy tohoto rodu jsou velmi rozšířeny v přírodě na rostlinných zbytcích (zvláště listech), v půdě i na živých rostlinách. Některé druhy jsou převážně 19

26 saprofytické a jen příležitostně parazitují na rostlinách, jiné jsou specializovaní paraziti. Některé druhy žijí epifyticky na povrchu listů, stonků i na plodech živých rostlin spolu s druhy rodu Cladosporium, Torula aj. z čeledi Dematiaceae a vytvářejí na nich černé povlaky, tzv. černě, které vyrůstají na místech, kde ulpěly sladké výrony rostlin, mšic nebo šťáva z plodů. Ty, které parazitují vnikají hyfami pouze do svrchních vrstev pletiva, kde způsobují nekrózu. Pronikání pokožkou je jednak mechanické, jednak pomocí enzymů, další patogenní působení se děje za účasti fytotoxinů (Fassatiová, 1979). Některé druhy alternarií produkují mykotoxiny a vzhledem k možnosti intoxikace cestou inhalace spór, není vyloučen jejich podíl na poškozování zdraví exponovaných jedinců. Mikromycety rodu Alternaria poprvé popsal mykolog Christian G. D. Nees ( ) v roce Alternaria je anamorfní rod podle starších systémů zařazený do imperfektní třídy Hyphomycetes = Deuteromycetes (mitosporické houby), čeledi tmavě zbarvených hub Dematiaceae. Sexuální stádia náleží mezi Ascomycota, řádu Pleosporales do rodů Pleospora a Lewia. Podle databáze (CABI Databáze of Fungal Names) dosud bylo popsáno celkem 449 druhů, variet a synonym rodu Alternaria (Malíř, Ostrý, 2003). Mikroskopické morfologické znaky (velikost a tvar spór, počet přehrádek, tvorba spór v různě dlouhých řetězcích nebo jednotlivě a další znaky) jsou dosud hlavním rozlišovacím kritériem pro determinaci jednotlivých druhů. Vzhledem k velké variabilitě jednotlivých znaků u téměř všech popsaných druhů je jejich systematické zařazení často obtížné (Prokinová, 2004). Makroskopické znaky na sladinovém agaru vytvářejí některé druhy tmavé, nízké kolonie v nichž je přítomno značné množství konidií (Tichá, 1988). Rod Alternaria zahrnuje vláknité mikromycety, které se na kultivačních médiích vyznačují rychlým růstem a tvoří z počátku bílé, později šedé až olivově hnědé kolonie. Textura přechází od zrnitého až k vlnatému vzhledu (Malíř, Ostrý, 2003). Vegetativní mycelium je zčásti hyalinní (zvláště vzdušné), z části tmavě hnědě zbarvené (substrátové). Spodní strana je vždy tmavá hnědočerná, šedočerná až černá. Konidiofory jsou hustě článkovány, málo větvené a vytvářejí po stranách i na koncích vícebuněčné zďovité konidie (dictyospory), způsobem vzniku perespory. Konidie, poměrně velkých rozměrů, mají širší bazální část a užší apikální část, která může mít nepatrný nebo značně dlouhý vláknitý výběžek. Poslední buňka apikální části konidie pučí v novou, 20

27 dceřinou konidii. Tento pochod se může opakovat vícekrát, takže vzniká řetězec centrifugálně tvořených konidií. V jiných případech apikální buňka první konidie vytvoří konidionosné vlákno, na jehož konci vznikne další konidie. Konidionosné vlákno pokračuje bočně v růstu dále, a tak vytváří kolénkatý konidiofor, na jehož záhybech sedí konidie. Konidie jsou žluté, okrové, světle hnědé nebo tmavě hnědé, jejich povrch může být hladký, zdrsnělý až ostnitý (Fassatiová, 1979). Na pšenici se hojně vyskytují Alternaria alternata, Alternaria chartarum, Alternaria tenuissima a Alternaria consortiale. Druhy izolované z cereálií jsou značně pleomorfní (co do tvaru a velikosti konidií). Některé druhy alternarií tvoří toxické metabolity. Nejčastější je to kyselina tenauzonová, alternariol, alternuen (Tichá, 1988). Alternaria alternata konidie se tvoří v dlouhých řetězcích, které jsou většinou nevětvené. Konidie jsou hnědé, hladké i ostnité, typicky alternarioidní, pouze konečné konidie v řetězci bývají kulovité a bez výběžku. Konidie jsou štíhlejší než u Alternaria chartarum a mají také méně podélných přehrádek. Je to běžný saprofyt, ale v parazitické činnosti je agresivnější než ostatní uvedené druhy. Podobně jako jiné druhy i rod Alternaria patří k psychrofilní mykoflóře.vegetuje i za teplot kolem 0 C. Alternaria teneuissima v kultuře zůstává středně vyvinuté vegetativní mycelium a průměrná sporulace. Konidiofory světle hnědé nebo žluté, podobně jako konidie, které tvoří jednoduché nebo větvené řetězce. Velikost konidií je variabilní podle substrátu a bývá v rozmezí 20 až 40 x 9 až 12 µm. Povrch konidií je hladký nebo ostnitý, řetězce poměrně krátké. Délka výběžku 5 až 16 µm. Alternaria chartarum v kultuře i u starých kmenů se udržuje dlouho porost nízký, sametový a tmavě zbarvený. Vytváří tmavé hladké nebo ostnité konidie většinou alternarioidního typu, avšak o něco širší než Alternaria alternata. Na apikálním konci těchto konidií se tvoří kolénkatý výběžek, který má funkci konidioforu. Konidiální řetězce jsou poměrně krátké, zato často větvené. Konidie jsou kulovité 2,5 až 4 µm, zřídka vejčité a až 5,5 µm dlouhé, drsné, s četnými drobnými bradavkami, silnou stěnou s hnědým zabarvením (Fassatiová, 1979) Mucor Rod Mucor patří do řádu Mucoroles. Zástupci tohoto řádu jsou nejznámější běžně pojímané plísně. Pro rozlišení rodů i druhů řádu Mucorales se používají především znaky nepohlavních rozmnožovacích orgánů, jen v některých případech 21

28 charakter zygospor. Při určování druhů je třeba mít na zřeteli, že jejich morfologická měnivost je značná a že bývá ovlivněna kvalitou živného substrátu, vlhkostí ovzduší, teplem, světlem a dalšími činiteli (Fassatiová, 1979). Rodu Mucor je rozdělen do více jak padesáti druhů. Vzhled kolonií: vzdušné mycelium je vatovité, zpočátku bílé anebo světle pískové, později tmavé, rychle se rozrůstá. Hyfy jsou málo větvené, obyčejně neseptované. Substrátové mycelium je slabě vyvinuté. Některé druhy vytvářejí v tekutých produktech kvasinkovité shluky (kulovité mycelium). V hyfách se tvoří částečné soudkovité nebo kulovité hrubostěnné silně granulované tmavozelené chlamydospory. Sporangiofory jsou silné, stojící větvené nebo nevětvené nesoucí na konci po jedné sporangii. Sporangia jsou kulovitá, zpočátku světlá, později hnědá nebo tmavohnědá až černá, dobře viditelná zrakem. Zralá sporangia praskají a část jejich stěny zůstává pod kolumelou jako límeček (Görner, Valík, 2004). Zygospory jsou kulovité s vnější silnou blánou rozdělenou na políčka, z nichž vyčnívají kónické výrůstky. Rod Mucor je saprofytický, jeho druhy jsou velmi rozšířené na rostlinách, ovoci a na mnohých potravinách. Mucor plumbeus (syn. Mucor spinosus) se vyskytuje příležitostně na pekařských kvasnicích, častěji na mlýnských produktech (Jesenská, 1987). Mucor spinosus (syn. Mucor plumbeus) vytváří porosty 2 až 10 mm vysoké, zpočátku bílé, později typicky šedočerné. Sporangiofory větvené, sporangia hnědá, veliká až 130 µm. Kolumela oválná až válcovitá, v mládí hladká, ve stáří se zřetelnými ostrými výrůstky na vrcholu. Spory kulovité, tlustostěnné, o rozměrech 4 až 7,5 µm. Velmi hojný druh v půdě, ve vzduchu, byl izolován též na chlebě,je nevybíravý v substrátu. Byly u něho též zjištěny toxiny. 22

29 Obr. 4 Na obrázku je znázorněna stavba sporangioforu s fruktifikačními orgány ( Mucor piriformis jeho porosty jsou husté, vlnaté, vysoké 20 až 30 µm (vzácněji i vyšší), zpočátku bílé, později nažloutlé. Sporangiofory málo větvené, větvení je sympodiální. Sporangia zpočátku bílá, později až hnědočervená. Kolumela hyalinní, oválná až hruškovitá, příležitostně kulovitá. Spory pravidelně elipsoidní. Vyskytuje se v půdě a často na hnijícím ovoci, odkud se dostává do sirupů. Často jím plesniví obilí a bylo zjištěno, že má toxické účinky na teplokrevné živočichy (Fassatiová, 1979). Mucor mucedo porosty husté, zpočátku stříbřitě šedé, později žlutavé, na světle dorůstají výšky 30 až 150 mm, ve tmě jen 10 mm. Sporangiofory přímé, skelně hyalinní. Sporangia na delších sporangioforech, veliká 80 až 200 µm, žlutá až žlutošedá. Kolumela hruškovitá až válcovitá, spory oválné. Izolován byl také z obilí (Fassatiová, 1979) Fusarium Houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny většiny zemědělských plodin. U obilovin napadají fuzária paty stébel, listy a klasy. Nejvýznamnější škody vznikají po napadení klasů, proto jsou fuzariózy jednou z nejzávažnějších chorob především ozimé pšenice na světě. Způsobují výnosové ztráty, snižují klíčivost zrna a především snižují pekařskou kvalitu zrna, následně způsobují vážné toxikologické problémy s dopadem na zdraví člověka (Širušková, 2007). 23

30 Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Rod Fusarium náleží k významným potencionálně toxinogenním polním mikromycetům. Do současné doby bylo popsána řada druhů rodu Fusarium. Jejich identifikace není vždy jednoduchá ať se jedná o izoláty z potravin nebo klinické kmeny (Malíř, Ostrý, 2003). Na základě konidiálního stádia je rod Fusarium rozdělen do 12 sekcí a osahuje asi 40 druhů. Pro bližší určení druhu se doporučuje kultura na sladinovém agaru, na vločkovém agaru, kde se hojně tvoří chlamydospory a makrokonidie. Fusaria vytvářejí bohaté myceliální porosty světlých barev, plstnaté nebo vatovité s provazcovitými myceliálními svazky, které vzlínají po stěnách kultivačních nádobek. Spodní strana kultury bývá pestře zbarvena (Fassatiová, 1979). Konidiální stádium vytváří buď volné jednotlivé konidiofory, na nichž se vytvářejí konidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářkovitých útvarů, zvaných sporodochia. V některých případech se vytvářejí souvislé konidionosné porosty pionéry. K typickému vytváření sporodochií a pionérů však dochází spíše na přirozeném substrátu (Malíř, Ostrý, 2003). U fusárií rozlišujeme dva druhy konidií a to mikrokonidie a makrokonidie. Obojí mohou tvořit na konci konidionosné buňky řetězce nebo shluky. Mikrokonidie jsou většinou jednobuněčné, oválné, elipsoidní, hruškovité apod. Makrokonidie mají rohlíčkovitý nebo srpkovitý tvar. Jdou dvoubuněčné až vícebuněčné. Jejich tvar je pro jednotlivé druhy charakteristický a patří k důležitým taxonomickým znakům při určování fusárií. (Tichá, 1988). Mimoto se u některých druhů vyskytují hojně i chlamydospory, které jsou různého tvaru i velikosti, o různém počtu buněk, často se zbarvenou stěnou, který mívá i bradavičnatou strukturu. Chlamidospory vznikají buď na konci vláken nebo mezi buňkami vlákna. U fusárií se setkáváme i se sklerocii tuhými kulovitými útvary. Mnohé druhy tvoří plodničky perithecia. (Fassatiová, 1979). Na pšenici se často vyskytuje F. poae, F. tritictum, F. culmorum, F. moniliforme a F. graminearum. (Tichá, 1988). Fusarium poae vzdušné mycelium na sladinovém agaru roste velmi rychle, je bílé, bíločervené nebo červené. Substrátové mycelium krvavě červené nebo okrově žluté až hnědé (Fassatiová, 1979). Konidiofory jsou více či méně větvené, s poměrně krátkými a širokými monofialidami. Mikrokonidie převažují, jsou většinou jednobuněčné, široce kapkovité až hruškovité. Makrokonidie se tvoří zřídka. 24

31 Chlamydospory se netvoří. Tento druh je významný kontaminant potravin, je producentem trichothecenů, butenolidu a fusarinu C (Kubátová, 2006). Fusarium culmorum porosty na sladinovém agaru velmi rychle rostou a vytvářejí bílé vločkovité mycelium, které později žloutne až červená od pigmentu, který se vytváří v substrátovém myceliu a prolíná i do spodní strany kultury. Mikrokonidie se zřetelně vytvořenými 3 přehrádkami, s 5 přehrádkami s nejširším průměrem v horní třetině. Chlamydospory kulovité až oválné, většinou interkalární, hladké nebo s drsným povrchem, jednotlivé, v řetízcích nebo ve shlucích. Mikrokonidie se netvoří (Fassatiová,1979). Významný kontaminant potravin, je producentem trichothecenů, zearalenolu, butenolidu, culmorinu a fusarinu C (Kubátová, 2006). Fusarium moniliforme vločkovité mycelium na sladinovém agaru zpočátku bílé, později červené, povrch je v době tvoření mikrokonidií práškovitý až růžově zbarvený. Substrátové mycelium i spodní strana temně červenofialová. Mikrokonidie v hojné míře jednobuněčné, vyjímečně i dvoubuněčné. Mikrokonidie s tenkou stěnou, přímé nebo lehce zahnuté, na obou koncích zašpičatělé, dolní buňka s lehce naznačenou nožkou. Produkuje giberelin růstovou látku. Bylo zjištěno, že produkuje toxickou látku kyselinu fusariovou, která vyvolává v některých krajích neurotoxikózu prasat a drůbeže. (Fassatiová, 1979). Fusarium graminearum vzhled kultury i její zbarvení je značně závislé na typu živné půdy a ph. Na glukoso-bramborovém agaru po 5 dnech šedorůžové až živě červené, později hnědočervené, se sektory bílými nebo šedožlutými. Vzdušné mycelium vločkovité, zpočátku bílé. Mikrokonidie se tvoří na jednoduchých nebo větvených konidioforech, které se shlukují do sporodochií. Mikrokonidie jsou srpovité s protáhlou nebo i zkrácenou apikální buňkou, jindy zřetelně stavěné s nápadně vyvinutou nožkou na bazální buňce. Chlamydospory jsou kulovité, tlustostěnné, hyalinní nebo světle hnědé. Mají povrch hladký nebo zdrsnělý a velikost 10 až 12 µm. Produkuje zearaleon, který způsobuje gastroenterotoxikózy u vepřového dobytka, ovcí a koní. (Fassatiová, 1979). 25

32 Obr. 5 Na obrázku je znázorněna perokresbou stavba konidioforu Fusarium culmorum ( Cladosporium Zástupci rodu Cladosporium jsou saprotrofní mikromycety, z nichž se část adaptovala k parazitismu rostlin, část se významně podílí na kontaminaci potravin rostlinného i živočišného původu. Taxonomicky se rod Cladosporium řadí do oddělení Ascomycota řádu Dothideales (Malíř, Ostrý, 2003). Je známo asi 50 druhů a jejich výskyt je všudypřítomný. Nachází se na obílí (polní mykoflóra), ovoci a zelenině, na masných produktech. Roste na vlhkých stěnách a stropech i při velmi nízkých teplotách. Cladosporium suaveolens se objevuje na dřevěném nářadí a zařízení používaných při přípravě těsta v pekárnách (Görner, Valík, 2004). Morfologický popis mycelium je bohatě vyvinuto, mladé hyfy tenkostěnné, hyalinní a s delšími buněčnými úseky, starší hyfy tmavší, tlustostěnné, s kratšími buněčnými úseky. Konidiofory na přirozeném substrátu vyrůstají většinou ve svazcích ze stromatu, na agarových půdách se tvoří rozptýleně na konci nebo po stranách vzdušných hyf. Jsou většinou přímé nevětvené, ale i větvící se, olivově až temně hnědé, na konci kolénkatě zprohýbané (Fassatiová, 1979). Konidie jsou světě šedé až temně šedohnědé nebo zelenohnědé, vznikají pučením (blastospory) na konci konidioforu, kde z každé nově vypučené spóry pučí další a tvoří tak centrifugálně řetízky, které se mohou ještě větvit. Tvarově i velikostí jsou konidie velmi různé: kulovité, citrónkovité, oválné, válcovité nebo nepravidelně doutníkové, tupě zakončené nebo s jedním popř. oběma 26

33 konci zašpičatělými. Vyskytují se konidie jednobuněčné až tříbuněčné, na povrchu hladně, jemně bradavčité nebo ostnité (Malíř, Ostrý, 2003). Na obilí i v mouce často nacházíme Cladosporium herbarum a Cladosporium cladosporoides. Některá Kladosporia produkují též toxické metabolity (kyselinu epicladosporiovou a kyselinu fagicladosporiovou) (Tichá, 1988). Malíř a Ostrý ve své práci produkci těchto mykotoxinů pro nedostatek dalších relevantních informací nepotvrzují. 3.3 Vady v mouce způsobené mikroorganismy Rozvoj mikroorganismů začíná v mouce neznatelně, změnu znaků jakosti nelze zpočátku zpozorovat. Jakmile však vznikly podmínky k aktivnímu rozvoji mikroorganismů jejichž činnost se stále zesiluje a nedojde-li k příslušným opatřením, vede k samozahřívání, popřípadě i k hnití mouky. Účinky mikroorganismů na mouku se mohou projevit jako zatuchlý pach, kysnutí, jedovatost, samozahřátí a sléhávání mouky (Müller, 1986) Samozahřívání mouky Samozáhřev mouky vzniká a probíhá obdobně jako samozáhřev obilí, není však tak častý (Hofman, 1986). Mikroorganismy jako všechny živé organismy potřebují ke své existenci energii. Jako saprofyty ji získávají rozkladem organických látek, při němž se uvolňuje značné množství energie. Čím větší je vlhkost mouky, tím intenzivnější je přívod živin do buněk v ní obsažených mikroorganismů a tím větší je dýchání a uvolňování tepla. Teplo opět umožňuje rychlé rozmnožování mikroorganismů. Teplo vyloučené mikroorganismy se vlivem špatné vodivosti mouky hromadí uvnitř moučné masy. Hlavním původcem zahřívání jsou mikroorganismy. Účastní se na něm především plísně rodu Penicillium a Aspergillus, které se začínají objevovat již při vlhkosti 14 % a teplotě 15 C. Tato teplota a vlhkost jsou pro skladování běžné (Müller, 1986). Celý proces má tři fáze: 1. Při zvýšené vlhkosti mouky dochází k silnému rozvoji plísní a běžné nesporotvorné mikroflóry mouky, teplota stoupá na 24 až 30 C. 2. Teplota stoupá až ke 40 C a rozvíjejí se termofilní sporotvorné baktérie a aktinomycety. Počet nesporotvorných bakterií klesá. 3. Při dalším zvyšováním teploty na 50 C převládají termofilní baktérie, snižuje se počet plísní a aktinomycety a kvasinky se již nerozmnožují. Další samozahřívání 27

34 potlačuje rozmnožování i termofilních mikroorganismů, protože silně zahřátá mouka byla vysušena (Hofman, 1986). Výsledkem samozahřátí je zatuchlý a kyselý pach mouky, ztráta sypkosti a pekařských vlastností. Dochází ke ztrátě sušiny, klesá obsah bílkovinového dusíku a zvyšuje se obsah amoniového a amoniakálního dusíku. Zvyšuje se titrační kyselost i obsah redukujících cukrů. Vlivem denaturace bílkovin ztrácí mouka schopnost bobtnat i pružnost lepku, a tím se snižuje její pekařská jakost (Hofman, 1986). Vzniklé cukry začínají reagovat s uvolněnými aminokyselinami, dipeptidy, tripeptidy a vznikají melanoidy. Tyto tmavě zbarvené látky způsobují tmavnutí mouky. Aby se zabránilo samozahřívání mouky, je nutno při skladování sledovat její teplotu. Zahřívající se mouku je třeba přečerpat nebo přesypávat (Müller, 1986) Kysnutí mouky Vyskytuje se řidčeji a projevuje se specificky kyselou chutí a pachem. Zvyšuje se kyselost mouky. Příčinou je rozmnožení mléčných bakterií zkvašujících sacharidy na kyseliny mléčnou, případně i na jiné organické kyseliny. Na rozdíl od plesnivění probíhá kysnutí ve vnitřních partií i uvnitř pytlů (Müller, 1986). Na kysnutí se podílejí i bakterie rozkládající škrob na jednoduché sacharidy a bakterie zkvašující vzniklé sacharidy na různé kyseliny. Za přítomnosti kvasinek může probíhat i ethanolové kvašení a působením octových bakterií se pak ethanol oxiduje na kyselinu octovou. Ke kysnutí je náchylná čerstvě semletá mouka. V průběhu skladování bakterie vyvolávající kysnutí postupně hynou, a tím možnost kysnutí klesá (Hofman, 1986). Kysnutím mouky se zhoršují pekařské vlastnosti. Těsta vyrobená z takové mouky mají ostrou vůni po kyselině octové, acetonu a esterech (Müller, 1986) Nitkovitost mouky a pečiva Nitkovitost je vada chleba eventuálně i pečiva, která se sice nevyskytuje příliš často, ovšem v teplých letních měsících se s ní můžeme setkat, protože bakterie, které tuto chorobu způsobují Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus a B. licheniformis, jsou termofilní. Spory těchto bakterií přečkávají teplotu pečení, která nepřekročí 100 C uvnitř chleba, a mohou za příznivých podmínek vyklíčit. Napadány bývají zejména výrobky vyšší hmotnosti a z pšeničné mouky. Nitkovitost je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto bakterií společně s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu, který po zcukření podporuje tvorbu pouzder. Střída chleba začne druhý až třetí den po 28

35 upečení vlhnout, maže se, je lepivá, zbarvuje se dožluta a odporně hnilobně páchne. Při doteku se vytahuje do dlouhých nití, což je patrné zejména při rozlomení bochníku (obr. 6, 7). Vznik nitkovitosti podporují následující podmínky: kontaminace surovin, především mouky, ale i droždí, sušeného mléka či sladových přípravků sporami uvedených bakterií, nedostatečně vyčištěné výrobní zařízení, pomalé chlazení chleba po upečení (nejkritičtější teplota je mezi 30 a 45 C), nízká kyselost chleba (B. subtilis a B. mesentericus se množí nejlépe při neutrální reakci, růst je potlačován při kyselosti kolem ph 5,0), skladování chleba v teplé a vlhké atmosféře (optimální teplota pro vznik nitkovitosti je při teplotě C). Nitkovitost chleba tudíž může být způsobena mimo jiné právě nedostatečným propečením pekařských výrobků. Nitkovitost chleba sice nemůže v zásadě nijak ohrozit zdraví spotřebitele, je však závažným jakostním nedostatkem ( Koláče všech typů zřídka kdy postihne nitkovitost v důsledku vysoké koncentrace cukru, který omezí dostupnost vody. Avšak některé přísady jako cukr, ořechy, koření, polevy a náplně jsou zdrojem kontaminace. I když pečící proces je všeobecně dostačující k tomu, aby zničil tyto mikroorganismy, mnohé z nich se dostávají na hotový výrobek z polev, náplní, z chladícího a okolního vzduchu (Golden, 2003). Mikroflóra také může způsobovat nepříznivé změny ve vůni a chuti obilných produktů kvůli produkci vonných těkavých kyselin. Příklady některých vůní separovaných, které byly produkovány jsou 3-methyl butanol, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octanol a 2-octen-1-ol. Další faktor pro růst mikroflóry je zvýšení čísla kyselosti tuků. Toto zvýšení čísla kyselosti tuků je způsobeno odolností lipáz proti vysokým teplotám (Brackett, 2004). 29

36 Obr. 6 Chléb napadený nitkovitostí ( Obr. 7 Detail nitkovitosti toastového chleba (Needham, 2004) Na obr. 7 jsou viditelné dlouhé táhnoucí se provazce, které produkují Bacillus subtilis, díky kterým dostala tato mikrobiální vada svůj název nitkovitost chleba Plesnivění mouky Spory plísní se při mletí dostávají do mouky. Při zvýšení vlhkosti nad 14 % z nich vyrůstá mycelium. Silný zatuchlý pach mouky působí plísně rodu Penicillium. Nelze jej odstranit ani častým a intenzivním proséváním mouky a přechází dokonce do 30

37 pekařských výrobků. Prosévání mouky a ostré vypékání úporný a nepříjemný pach jen snižují. Plesnivěním klesá jakost lepku a obsah bílkovin a zvyšuje se obsah dusíkatých látek rozpustných ve vodě. Stoupá také kyselost mouky a porušuje se škrob (Hofman, 1986). Voda je základní součástí mikrobiální buňky (80 až 90 %) a je rovněž nutná pro výměnu látek mezi buňkou a prostředím. Čím je vlhkost prostředí vyšší, tím intenzivnější je výměna látek mezi mikrobiální buňkou a prostředím a tím rychleji se mohou mikroorganismy rozmnožovat (Hofman, 1986). Mikroorganismy svými enzymy přeměňují sušinu mouky (škrob, bílkoviny, celulózu) v látky jednodušší, ve vodě rozpustné. Činností plísní mohou vznikat také hrudky. Tvoří se působením zvýšené vlhkosti a prorůstáním plísňovým podhoubím. Tím mouka ztrácí sypkost. Plesnivění je také spojeno s tmavnutím mouky vlivem přítomnosti barevných plísňových spor. Jiný druh zápachu mikrobiologického původu, který se může v mouce vyskytnout, je zápach snětivý. Pochází ze špatně vyčištěného obilí, v němž se vyskytovala klubíčka sněti. Při mlecím procesu se tato klubíčka rozbila a uvolnil se trimethylamin, který svým zápachem připomíná slanečkový lák (Müller, 1986). 3.4 Mykotoxiny a jejich výskyt v mouce Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity řady druhů mikroskopických vláknitých hub (plísní), které mohou kontaminovat široké spektrum potravin a krmiv. Producenti těchto nebezpečných přírodních kontaminantů vyvolávají různé toxické syndromy nazývané souhrnně mykotoxikosy. Plísně jsou všudypřítomné, a tak se mykotoxiny vyskytují prakticky na všech úrovních potravního řetězce většiny živočichů. Systematické studium mykotoxinů bylo iniciováno množícími se signály o nebezpečnosti používání plesnivých potravin a krmiv ve výživě až v 60. letech minulého století. Z více než 300 dosud identifikovaných mykotoxinů se přibližně jen 20 těchto sloučenin vyskytuje v potravinách či krmivech ve vyšších hladinách a je spojováno se zdravotním riziky pro člověka i zvířata (Velíšek, 2002). Dopad mykotoxinů v potravním řetězci je důležitá celosvětová záležitost. Obecně si spotřebitelé méně častěji uvědomují rizika spojená s konzumací potravin kontaminovanými mykotoxiny, ale častěji si všimnou hrozeb, spojených s konzumací potravin obsahující pesticidy, přídatné látky a těžké kovy (Galvano, 2005). Vidina 31

38 celkového potravinového nebezpečí je v pravidelné přítomnosti mykotoxinů v obilovinách, ořeších, zelené zrnkové kávě a ovoci. Jestliže jsou kontaminována mykotoxiny také krmiva, mohou se tyto sekundární metabolity také objevit v živočišných produktech (D Mallo, 2003) Přehled nejdůležitějších mykotoxinů a jejich producentů vyskytujících se v mouce Přítomnost některých mykotoxinů byla prokázána v obilovinách, mouce, pečivu i v těstovinách. Příčinou kontaminace může být použití mouky vyrobené z plesnivého obilí nebo z plesnivé mouky či samostatného pekárenského výrobku. Je známo více než 200 druhů plísní schopných produkovat mykotoxiny a stále jsou zjišťovány další. Mykotoxiny jsou takové látky, které vlastnímu producentovi neškodí, ani ho nijak neovlivňují, pro řadu ostatních organismů jsou však i v nízkých koncentracích toxické. Bylo prokázáno, že ne všechny kmeny toxinogenního druhu produkují mykotoxiny. Rovněž produkční kmeny tvoří toxin jen za určitých podmínek (teplota, vlhkost) a na určitých substrátech. Některé látky tvorbu toxinu stimulují, jiné naopak brzdí. Jeden typ mykotoxinu může být produkován celou řadou druhů plísní. Stejně tak jeden druh plísně může tvořit současně několik mykotoxinů (Tichá, 1988). Optimálně fyzikálně chemické podmínky pro tvorbu mykotoxinů jsou u různých druhů různé. Optimální teplota pro tvorbu aflatoxinů je 25 až 35 C, pro tvorbu paulinu 25 C. Některé plísně rodu Fusarium produkují mykotoxiny i při teplotě -5 C. Mykotoxiny v nízkých dávkách v lidské výživě vyvolávají akutní otravy, při opakovaných nižších dávkách působí některé z nich jako chronické karcinogeny. Přehled nejdůležitějších mykotoxinů, jejich producentů a účinků je uveden v tabulce 4. (Hofman, 1986). 32

39 Tab. 4 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů (Hofman, 1986). Mykotoxin Producent substrát Biologický účinek Aflatoxiny Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus olejniny, obilí,mouka, krmivo, rýže, luštěniny karcinogeny, chronické poškození jater a ledvin, poškození reprodukce Ochratoxiny Aspergillus ochraceus, Penicillium viridicatum pšenice, oves, rýže, krmivo, kukuřice poškození ledvin, tuková degenerace jater, potraty zvířat Patulin Penicillium expansum, Aspergillus clavatus, Aspergillus terreus, obilí, krmivo, mouka, rýže, ovoce karcinogen, poškození jater a ledvin Aspergillus giganteus Zearalenon Fusarium graminearum obilí, kukuřice, seno, sláma gastroenterotoxikózy hospodářských zvířat, potraty Trichotheceny Různé druhy rodů Fusarium, obilí, mouka, krmivo krvácivost, poruchy zraku, smrtelné stavy Trichoderma Sterigmatocystin Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans kukuřice, krmivo, poškození jater a ledvin, karcinogen luštěniny, olejniny Citrinin Penicillium cintrinum, oves, pšenice, poškození ledvin Aspergillus candidus, Aspergillus nidulans rýže, krmivo Rubratoxin Penicillium rubrum obilí krvácení, poškození jater Penicilová kyselina Penicillium cyclopium obilí, krmivo sarkomy 33

40 Aflatoxiny Aflatoxiny patří s ohledem na svoji extrémně vysokou toxicitu mezi nejvíce sledované mykotoxiny. Nejvýznamnějšími producenty alfatoxinů jsou dvě blízce příbuzné plísně rodu Aspergillus a to Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Riziko napadení příslušnými toxinogenními plísněmi (zvýšená pravděpodobnost je zejména po sklizni) je vysoké především v subtropických a tropických klimatických podmínkách (Velíšek, 2002). Aflatoxiny tvoří řadu B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M 2. Jednotlivé toxiny se liší chemickým složením a barvou fluorescence v ultrafialovém světle. Alfatoxiny B 1 a B 2 fluoreskují modře, alfatoxiny G 1 a G 2 zeleně. Aflatoxiny jsou zjišťovány v pekárenských výrobcích. Jejich zdrojem je mouka vyrobená z plesnivého obilí. Pekárenské výrobky s dlouhou trvanlivostí mohou při nevhodném skladování zplesnivět a pak obsahovat aflatoxiny (Hofman, 1986). Základem skeletu B 1 a B 2 je kumarin kondenzovaný s cyklopentanonem, u druhých dvou G 1 a G 2 je místo cyklopentanonu 5,6-dihydropyran-2-on. Všechny látky navíc obsahují bishydrofurofuranový kruh (Velíšek, 2002). Aflatoxin M 1 byl izolovaný v mléce dojnic a v mateřském mléce a tento aflatoxin je metabolizovaný z B 1 z kontaminované stravy. Aspergillus flavus je jako jediný schopný syntetizovat aflatoxin B 1 z kyseliny cyklopiazonové a tento mykotoxin byl nedávno identifikován jako kontaminující látka v podzemnici olejné, která byla spojena s hromadnou úmrtností v Turecku v roce Na druhé straně Aspergillus parasiticus produkuje často všechny čtyři aflatoxiny (D Mallo, 2003). Expozice mykotoxinů může u zvířat i člověka vyvolat v závislosti na dávce řadu akutních i chronických onemocnění. V první řadě je nutné zmínit jejich hepatotoxicitu. Aflatoxin B 1 je považován za nejpotentnější známý přirozený hepatokarcinogen. Mutagenita a karcinogenita aflatoxinů obecně klesá v řadě B 1 >G 1 >B 2 >G 2. Souvisí s interakcí reaktivních metabolitů s DNA a následnou inhibicí její replikace a transkripce. Aktivovaný derivát aflatoxinu inhibuje též biosyntézu RNA, proteinů a další děje. Jako stimulátory produkce aflatoxinů působí např. mastné kyseliny s dlouhým uhlovodíkovým řetězcem nebo propionová kyselina (Velíšek, 2002). Aflatoxiny mohou navodit akutní účinky, to byl případ v roce 1974 v Indii, kdy propuklo jaterní onemocnění u 997 osob a z nichž 97 zemřelo vlivem spotřeby kontaminovaného obilí aflatoxiny. Chronické vystavení aflatoxinů může způsobit snížení imunitní funkce. Dále bylo poukázáno odborníky na synergické působení aflatoxinů a viru hepatitidy B (D Mallo, 2003). Tyto data vedla k závěru, že chronická 34

41 virová hepatitida B a C byla vyvolána v důsledku vystavení kontaminované potravě aflatoxinem B 1 (Galvano, 2005) Ochratoxiny Ochratoxiny jsou označovány podle typů symboly A, B, C. Jejich nebezpečí pro potraviny je v jejich termostabilitě. Producenti těchto ochratoxinů jsou Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzeae, Penicillium cyclopium, Penicillium variabile, Penicillium viridicatum. Vyskytují se na obilovinách včetně žita a často v ovesných vločkách. V chladnějším klimatu je producentem ochratoxinů především Penicillium viridicatum. Nalezneme jej rovněž v koření, jablečné šťávě, zelené kávě, ale také v pšeničném a žitném chlebu (Müller, 1986). Z toxikologického hlediska je nejvýznamnějším reprezentantem diskutovaných v této skupiny mykotoxinů ochratoxin A. Ve své molekule obsahuje fenylalanin se substituovaným (3R)-3,4-dihydromethylisokumarinem. Toxické účinky jsou přičítány atomu chlóru, kterým je aromatický kruh substituován. Ochratoxin B se liší od ochratoxinu A pouze absencí atomu chloru a je prakticky netoxický (Velíšek, 2002). Nedávné studie ve Francii indikovali kontaminaci obilovin ochratoxinem A (OTA) v rozsahu 0,6 až 12,8 µg/kg v kontaminovaných vzorcích (D Mallo, 2003). Nejzávažnějším biologickým účinkem zaznamenaným u zvířat exponovaných OTA je nefrotoxicita, dále je prokázána jeho hepatotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita. U člověka je expozice OTA spojována s balkánskou endemickou neuropatií (BEN) a nádory ledvin. Při prováděném průzkumu byl zjištěný častý výskyt OTA v krevní plasmě obyvatel různých částí Evropy, což zdůraznilo potřebu systematického sledování tohoto kontaminantu v potravním řetězci člověka (Velíšek, 2002). Přítomnost OTA v lidském těle je prodloužená a poločas rozpadu v krvi je 35 dnů po jednotlivém ústním dávkováním. OTA není uložen v tukových tkáních jak prokázalo několik laboratorních studií na zvířatech, ale je distribuován přes krev do ledvin (Galvano, 2005). Pro rezidua ochratoxinu A existují v řadě zemí hygienické limity. V EU jsou tyto hodnoty pro kávové boby a cereálie 20 µg/kg. V ČR se tyto hodnoty pro různé skupiny potravin pohybují v rozmezí 3 10 µg/kg, pro dětskou výživu jen 1 µg/kg. 35

42 Patulin Nejvýznamnějšími producenty patulinu jsou plísně Penicillium patulinum a Penicillium expansum, které patří mezi běžné patogeny mnoha druhů ovoce a zeleniny. Chemickou strukturou se patulin řadí mezi mykotoxiny laktonového typu, jedná se o opticky inaktivní 4-hydroxy-4H-furo(3,2-c)pyran-2(6H)-on. Patulin je velmi dobře rozpustný ve vodě, v kyselém prostředí (v rozmezí ph 3,0 6,5) (Velíšek, 2002). Faktory vhodné pro tvorbu patulinu jsou: minimální teplota 15 C, optimální teplota 25 C, maximální teplota 40 C, relativní vlhkost 82 % a doba kultivace 6 dní. Účinek patulinu na savce: nekróza jater, edémy, je karcinogenní (Müller, 1986). Akční limit pro patulin WHO je 0,05 mg/kg, česká legislativa udává obecně limitní hodnoty pro potraviny v rozmezí od 0,05 až 0,1 mg/kg (Velíšek, 2002) Trichotheceny Trichotheceny jsou hlavní metabolity sekundárního metabolismu převážně plísní rodu Fusarium. Podle druhu a chemotypu houby může být produkován jeden nebo více mykotoxinů v různém množství a v různém poměru. Ve prospěch produkce fusáriových mykotoxinů působí zejména chladnější klima s vyšší vlhkostí vzduchu (Radová- Sypecká, Hajšlová, 2003). Největším problémem ve smyslu rizika dietární expozice člověka těmto mykotoxinů je kontaminace cereálíí, zvláště pšenice a kukuřice. Přestože je dnes známo téměř 150 trichothecenů, jen asi 10 z nich lze běžně v zemědělských plodinách detegovat (Velíšek, 2002). Trichotheceny mají tetracyklickou seskviterpenovou strukturu, zahrnující šestičlenný heterocyklus s kyslíkem, epoxidovou skupinu v poloze C-12, C-13 a dvojnou vazbu v poloze C-9, C-10. Trichotheceny lze rozdělit podle přítomných funkčních skupin : Typ A, která nemá na C-8 oxoskupinu (např. T-2 toxin, HT-2 toxin, monoacetoxyscirpenol) Typ B, kde je na C-8 oxoskupina (např. Nivalenol NIV, deoxynivalenol DON, 3acDON, jeho isomer 15acDON a fusarenon X) Typ C obsahující další epoxyskupinu v poleze C-7 a C-8 nebo C-9 (např. krocin) Plísně rodu Fusarium produkují pouze toxiny A a B (Radová-Sypecká, Hajšlová, 2003). Při studiu chemické reaktivity trichothecenů byla věnována zvýšená pozornost toxinu DON s ohledem na velmi častý výskyt v obilninách představující často základní 36

43 složku potravního koše. Tak např. při mletí pšenice s obsahem 0,51 mg/kg DON bylo v mouce přítomno 0,35 mg/kg tohoto toxinu, ale koncentrace v otrubách vzrostla zhruba na dvojnásobek. Obdobně činil obsah NIV v pšeničné mouce % (v závislosti na stupni vymletí) množství nacházejícího se ve výchozí surovině. Při pečení různých výrobků z pšeničné mouky se ztráty DON pohybovaly v rozmezí % (vztaženo na výchozí hladiny v mouce). K výraznému snížení hladiny DON dochází při mytí kontaminovaného obilí. Např. při výchozím obsahu toxinu v ječmeni 16,1 mg/kg činil pokles obsahu toxinu v zrnech po 24 hodinách máčení ve vodě 92 % (Velíšek, 2002). První zprávy o možné kontaminaci a nebezpečí trichothecenů pochází ze Sibiře počátkem 19. století. Krátce po snědení toxické stravy lidé pozorovali pálení úst, jazyka, hltanu, žaludku a zvraceli, měli průjem a bolesti břicha. Toto stádium choroby trvalo 3 až 9 dní, potom se stav pacientů upravil. Dnes se předpokládá, že toto onemocnění způsobil T-2 toxin. Dnes se intenzivně rozvíjí zkoumání vlastností tohoto T-2 toxinu, resp. i jiných fusariových toxinů na laboratorních zvířatech. Toxikologický účinek se projevuje jako omezení produkce bílkovin a ovlivnění syntézy DNA. Odborníci vyslovili i hypotézu, že za zvýšený výskyt rakoviny střev u obyvatel některých krajin by mohli odpovídat mykotoxiny fusárií. Další hypotézou je, že trichotheceny jsou základní původci onemocnění člověka pelagrou, které bylo dosud považované za onemocnění způsobené avitaminózou (Jesenská, 1987). Příjem potravin kontaminovaných trichotheceny je spojován s výskytem různých lidských onemocnění jako jsou septická angína, onemocnění kloubů u dětí a rakovina jícnu. Dlouhodobé požívání trichothecenů může být jedním z faktorů, které zapříčiňují výskyt rakoviny. Karcinogenní a mutagenní účinky mohou mít mykotoxiny, které interferují s DNA (Radová-Sypecká, Hajšlová, 2003). Hygienické limity pro trichothecenů se ve státech EU poněkud liší, pro DON se pohybují v rozmezí 1 2 mg/kg. V ČR jsou povolené množství pro DON u obilovin (včetně rýže a kukuřice) 2 mg/kg, pro mouku 1 mg/kg (Velíšek, 2002) Zearalenon Zearalenon je důležitý estrogenní toxin, který se často kontaminuje obilí spolu s trichotheceny a monoliformy (Galvano, 2005). V současné době je známo 15 derivátů. Mezi ně patří i F-2 toxin. Producentem je Fusarium graminearum (Müller, 1986). Obsah zearalenolu často významně klesá při technologickém zpracování obilovin. Např. v bílé mouce připravené z kontaminované pšenice bylo obsaženo jen 30 37

44 až 50 % výchozího obsahu tohoto mykotoxinu, v chlebu se jeho obsah oproti mouce snížil o %. Akutní toxicita zearalenonu je nízká, nicméně jeho příjem dietou může vyvolat (díky strukturní podobnosti se steroidními hormony estrogeny) hyperestrogenní syndrom (Velíšek, 2002) Toxické účinky mykotoxinů a metody stanovení Mykotoxiny jsou podle míry akutní toxicity členěny do tří skupin. Akutní toxicita se tradičně odhaduje výpočtem LD 50 tj. výpočtem dávky, která způsobí akutní uhynutí 50 % experimentálních zvířat. Rozdělení mykotoxinů podle jejich toxicity je uvedeno v tabulce 5. Tab. 5 Dělení mykotoxinů podle jejich akutní toxicity pro běžná laboratorní zvířata (např. potkana) (Malíř, Ostrý, 2003). Toxicita Mykotoxin Silně toxické (LD 50 cca jednotky mg/kg Alfatoxiny, ochratoxin A, patulin, t.hm. rubratoxiny, T-2 toxin Středně toxické (LD 50 cca desítky mg/kg Citrinin, kyselina cyklopiazonová, t. hm. sterigmatocystin Slabě toxické (LD 50 cca stovky a tisíce Griseofulvin, trichothecenů, zearalenon, mg/kg t. hm. kyselina mykofenolová Analytické stanovení mykotoxinů se skládá z několika na sebe navazujících kroků, z nichž každý z nich rozhoduje o výsledku analýzy. Odběr a zpracování vzorků vzorky potravinových surovin, krmiv je nutno homogenizovat. Extrakce provádí se organickým rozpouštědlem nejlépe na laboratorní třepačce v Erlenmayerově baňce se zábrusem. K extrakci mykotoxinů se nejčastěji používá metanol, octan etylnatý, chloroform. Mykotoxiny jsou nejčastěji stanoveny imunochemickými a chromatografickými metodami. Imunochemické metody (ELISA, RIA) je založena na reakci antigenu (mykotoxinu) s protilátkou u níž se měří množství navázaných látek. Měření se provádí spektrofotometricky (závislost absorbance na koncentraci). Chromatografické metody (TLC, HPTLC, HPLC, GC) jsou jedny z nejvýznamnějších analytických metod. Umožňuje dělení, identifikaci a stanovení velkého počtu organických a anorganických látek (Malíř, Ostrý, 2003). 38

45 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Materiál a metody Pro mikrobiologické analýzy byly použity následující vzorky mouk zakoupených v obchodní síti. Vzorek č. 1 - pšeničná polohrubá mouka, výrobce Spar Vzorek č. 2 pšeničná jemně mletá celozrnná mouka, výrobce Mlýn Pohornský Ruskov Vzorek č. 3 pšeničná celozrnná mouka polohrubá, výrobce Mlýn Pohornský Ruskov Vzorek č. 4 celozrnná žitná jemně mletá biomouk a výrobce PRO-BIO s. r. o. Vzorek č. 5 celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka, výrobce PRO-BIO s. r. o. Pro stanovení mikroorganismů se volilo ředění 10-1, 10-2, 10-3, tzn. že bylo naváženo od každého vzorku 20 g mouky a smícháno se 180 ml sterilní destilované vody a 10 minut třepána na třepačce a následně bylo prováděno desítkové ředění. Po důkladném protřepání a promíchání byl 1 ml příslušné zředěné suspenze vzorku inokulován do Petriho misky a byl zalit příslušnou sterilní na 45 C zchlazenou živnou půdou. Po ztuhnutí byly Petriho misky umístěny do inkubátoru Stanovované skupiny mikroorganismů Ve vzorcích mouk byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: Celkový počet mikroorganismů (CPM) na PCA při 30 C za 72 hodin. Kvasinky a plísně na agaru s kvasničným extraktem a chloramphenikolem při teplotě 25 C za hodin. Koliformní bakterie na VRBG půdě při teplotě 37 C za 24 hodin. Sporulující mikroorganismy na PCA půdě při teplotě 30 C za 72 hodin. Pro stanovení sporulujících bakterií se musí nejprve zničit živé formy mikroorganismů, tak aby přežily pouze sporulující mikroorganismy. Jednotlivé vzorky se dají do vodní lázně a ta se zahřívá na teplotu 80 C po dobu 15 minut. Rozbory byly prováděny ihned po otevření balení, další rozbory byly prováděny po třech a čtyřech měsících skladování při pokojové teplotě. 39

46 4.1.2 Složení a příprava živných půd K rozboru byly používány hotové živné půdy od výrobce Biokar Diagnostics z Francie. Živné médium PCA Složení : Kvasničný extrakt 5,0 g/l Glukóza 20,0 g/l Chloramfenikol 0,1 g/l Agar 15,0 g/l Příprava: Půda PCA se připraví tak, že navážíme 40,1 g a rozpustíme v 1 l destilované vody. Upravíme ph na 6,6 ± 0,2 při 25 C. Půda se steriluje v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 15 minut. Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramphenikolem Složení: Kvasničný extrakt 5,0 g Glukóza 20,0 g Chloramphenikol 0,1 g Agar 12,0 g Příprava: Všechny složky se smíchají s destilovanou vodou (1 l) a nechají se po několik minut stát, pak se směs zahřívá k varu za častého míchání do úplného rozpuštění, upraví se ph, aby po sterilizaci 121 C 15 minut jeho hodnota činila 6,6 při 25 C. Živné médium VRBG Složení: Pepton pro bakteriologii 7 g/l Kvasničný extrakt 3 g/l Glukóza 10 g Žlučové soli 1,5 g/l NaCl 5 g/l Barviva červeň 0,03 g/l, krystalová violeť 0,002 g/l Agar 13 g/l Příprava: Navážka 39,5 g živné půdy byla rozpuštěna v 1 l destilované vody. ph bylo upraveno na 7,4 ± 0,2. VRBG půda se nesterilizuje v autoklávu, ale po dosažení varu se 2 minuty vaří a po zchlazení se ihned používá k zalití očkované suspenze. 40

47 Veškeré použité laboratorní sklo bylo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru typu HS 62 A. Zavatičkované pipety byly sterilizovány zabalené do hliníkové fólie či uzavřené do nerezového válce. Sterilizace probíhala po dobu 60 minut při teplotě 160 C. Zkumavky, Erlenmeyerovy baňky s destilovanou vodou a živné půdy byly sterilizovány v parním sterilizátoru RS 20 A 20 minut při teplotě 121 C Vyjádření výsledků Po uplynutí inkubační doby se provedl odpočet mikroorganismů z Petriho misek. Výpočet byl proveden podle rovnice : N = Σ c / V.d (n 1 +0,1. n 2 ) N..počet kolonií mikroorganismů v 1 g / 1 ml vzorku Σ c...počet kolonií vzrostlých při dvou po sobě jdoucích ředění souběžně na dvou petriho miskách V..objem inokula d první použité ředění n 1..počet ploten naočkovaných prvního ředění n 2..počet ploten naočkovaných druhého ředění Výsledky byly vyjádřeny v KTJ/g mouky. 41

48 4.2 Výsledky a diskuze Ve vzorcích mouky byly ihned po otevření a následně třech a čtyřech měsících skladování při teplotě místnosti byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů. Výsledky mikrobiologických analýz jsou uvedeny v tabulkách (č. 6-10) a znázorněny v grafech (č.1 5). Stanovení celkového počtu mikroorganismů Výsledky stanovení CPM jsou uvedeny v tabulce č. 6 a grafu č. 1. Tab. 6 Stanovení celkového počtu mikroorganismů I. rozbor ihned po otevření KTJ/g II. rozbor po 3 měsících KTJ/g III. rozbor po 4 měsících KTJ/g pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka 1, , , , , , pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka 3, , , , , , celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka 7, , ,

49 Graf 1 Stanovení celkového počtu mikroorganismů [KTJ/g] pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka Müller (1986) uvádí, že celkový počet mikroorganismů v pšeničné mouce se pohybuje v rozmezí hodnot v průměru do KTJ/g. Vzorek pšeničné polohrubé mouky v průměru obsahoval ihned po otevření 1, KTJ/g. Po třech měsících skladování byl proveden další rozbor. Vzorek pšeničné polohrubé mouky obsahoval v průměru 1, KTJ/g. Dále byl proveden rozbor po čtyřech měsících, kdy vzorek pšeničné polohrubé mouky obsahoval v průměru 1, KTJ/g. Pšeničná celozrnná hladká mouka ihned po otevření obsahovala v průměru 9, KTJ/g. Po třech měsících skladování byl proveden další rozbor. Vzorek obsahoval v průměru 6, KTJ/g. Rozbor po čtyřech měsících ukázal, že obsah byl 3, KTJ/g. Pšeničná celozrnná polohrubá mouka ihned po otevření obsahovala v průměru 3, KTJ/g. Po třech měsících skladování byl proveden další rozbor a vzorek mouky obsahoval v průměru 1, KTJ/g. Po čtyřech měsících se počet mikroorganismů snížil na 6, KTJ/g. Jak je patrné z grafu č. 1 celozrnná polohrubá mouka obsahuje větší počet mikroorganismů, což je způsobeno větším podílem obalových částic, na kterých se vyskytují mikroorganismy. To souhlasí s tvrzením Müllera (1986), který uvádí, že celozrnné mouky obsahují více otrubnatých částic, a tím i větší počet mikroorganismů než u mouk světlých. 43

50 Výsledky vzorků biomouk byly porovnány s rozbory, které si nechala udělat společnost Biomlýn ( U bioproduktů firmy Biomlýn dosahovaly celkové počty mikroorganismů hodnot 4, KTJ/g u vzorků žitné mouky. Vzorek celozrnné jemně mleté žitné biomouky obsahoval ihned po otevření v průměru 2, KTJ/g celkového počtu mikroorganismů. Po třech měsících skladování byl proveden rozbor a bylo zjištěno, že vzorek celozrnné jemně mleté žitné biomouky obsahoval v průměru 1, KTJ/g. Po čtyřech měsících obsahoval 1, KTJ/g. Jak je patrné z grafu č. 1 obsah celkového počtu mikroorganismů u vzorku žitné biomouky několikanásobně převyšuje hodnoty zjištěné u pšeničných mouk. Vzorek celozrnné jemně mleté pšeničné biomouky obsahoval ihned po otevření v průměru 7, KTJ /g celkového počtu mikroorganismů. Po následujícím rozboru, který byl proveden po třech měsících, byl obsah celkového počtu mikroorganismů 4, KTJ/g. Po čtyřech měsících byl obsah 2, KTJ/g. Obr. 8 Nárůst kolonií mikroorganismů při stanovení CPM Stanovení kvasinek a plísní Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách č.7 a 8 a grafech. č. 2 a 3. Tab. 7 Stanovení plísní 44

51 pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka I. rozbor ihned po otevření KTJ/g II. rozbor po 3 měsících KTJ/g III. rozbor po 4 měsících KTJ/g Graf 2 Stanovení plísní KTJ/g pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka Jesenská (1987) analyzovala 101 vzorků mouk u kterých stanovovala počet plísní. V průměru obsahovaly vzorky pšeničné hladké mouky 1, KTJ/g plísní. Podle Görnera a Valíka (2003) jsou doporučené mikrobiologické limity pro plísně KTJ/g. Dle normy ČSN jsou limity pro mlýnské obilné výrobky v rozmezí hodnot 10 3 až 10 4 KTJ/g. Jak je patrné z tabulky č. 7 a grafu č. 2, největší obsah plísní byl zjištěn u vzorku celozrnné žitné jemně mleté biomouky, kdy ihned po otevření obsahoval 377 KTJ/g. Během skladování se obsah plísní postupně snižoval. Všechny stanovované vzorky mouk splňují doporučený mikrobiologický limit KTJ/g. 45

52 Obr. 9 Nárůst kolonií plísní Tab. 8 Stanovení kvasinek pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka I. rozbor ihned po otevření KTJ/g II. rozbor po 3 měsících KTJ/g III. rozbor po 4 měsících KTJ/g

53 Graf 3 Stanovení kvasinek KTJ/g pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka Vzorek pšeničné polohrubé mouky obsahoval ihned po otevření 227 KTJ/g kvasinek. Po třech měsících se počet kvasinek snížil na 105 KTJ/g a po čtyřech měsících se obsah snížil na 10 KTJ/g. U pšeničné celozrnné hladké mouky byl obsah kvasinek ihned po otevření 15 KTJ/g. Při dalších rozborech u tohoto vzorku nebyli kvasinky detekovány. Vzorek pšeničné celozrnné polohrubé mouky obsahoval 135 KTJ/g kvasinek ihned po otevření. Po třech měsících skladování se počet kvasinek snížil na obsah 55 KTJ/g mouky. Po čtyřech měsících skladování se snížil obsah kvasinek na 15 KTJ/g mouky. Jak je patrné z grafu č. 3 vzorek celozrnné žitné jemně mleté biomouky obsahoval největší počet kvasinek. Ihned po otevření vzorek obsahoval 482 KTJ/g kvasinek. Po třech měsících skladování byl proveden další rozbor, který ukázal, že obsah kvasinek se snížil na 241 KTJ/g. Po čtyřech měsících byl obsah kvasinek ještě nižší 73 KTJ/g mouky. Také vzorek pšeničné celozrnné jemně mleté biomouky obsahoval větší počet kvasinek než tomu bylo u celozrnných pšeničných mouk, které nebyly v kvalitě bio. Ihned po otevření byl obsah kvasinek u tohoto vzorku 45 KTJ/g mouky. Po třech měsících skladování byl obsah kvasinek u této mouky vyšší 109 KTJ/g. Po čtyřech měsících byl obsah kvasinek u tohoto vzorku 100 KTJ/g. 47

54 Obr. 10 Nárůst kolonií kvasinek Stanovení sporulujících bakterií U stanovení sporulujících bakterií se nejprve musí zničit vegetativní formy mikroorganismů, tak aby přežili pouze sporulující mikroorganismy. Výsledky jednotlivých druhů mouky, u kterých byl stanovován počet sporulujících mikroorganismů je uveden v následující tabulce č. 9 a v grafu č

55 Tab. 9 Stanovení počtu sporulujících bakterií pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka I. rozbor ihned po otevření KTJ/g II. rozbor po 3 měsících KTJ/g III. rozbor po 4 měsících KTJ/g 5, , , , , , , , , , , , , , , Graf 4 Stanovení počtu sporulujících bakterií 2,5 2 [KTJ/g] ,5 1 ` 0,5 0 pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka Görner a Valík (2003) uvádějí doporučené mikrobiologické limity pro sporulující bakterie 20 KTJ/g mouky. Všechny analyzované vzorky mouk tuto hodnotu překročily. Vzorek pšeničné polohrubé mouky obsahoval ihned po otevření 550 KTJ/g. Po třech měsících skladování byl proveden další rozbor, který ukázal, že se obsah sporulujících bakterií snížil na 336 KTJ/g mouky. Po čtyřech měsících se obsah snížil na 286 KTJ/g mouky. 49

56 Vzorek celozrnné pšeničné hladké mouky obsahoval ihned po otevření 304 KTJ/g sporulujících bakterií. Po třech měsících obsahoval 168 KTJ/g mouky, po čtyřech 141 KTJ/g sporulujících bakterií. Rozdíl mezi celozrnnou hladkou a polohrubou moukou je v tom, že vzorek polohrubé pšeničné celozrnné mouky obsahuje větší počet sporulujících bakterií a počet po otevření byl 468 KTJ/g. Po třech a čtyřech měsících skladování byly provedeny další rozbory a obsah sporulujících bakterií je v obou případech 350 KTJ/g mouky. Jak je patrné z grafu č. 4 byl největší počet sporulujících mikroorganismů obsažen ve vzorku celozrnné jemně mleté žitné biomouky, kdy obsah ihned po otevření byl 2, KTJ/g mouky. Po třech měsících skladování se obsah sporulujících bakterií snížil na 1, KTJ/g. Po čtyřech měsících se obsah snížil na 8, KTJ/g mouky. U vzorku pšeničné celozrnné jemně mleté biomouky byl obsah menší než u žitné mouky, ale převyšoval než u pšeničných mouk, které nejsou v bio kvalitě. Vzorek obsahoval ihned po otevření 7, KTJ/g sporulujících bakterií. Po třech měsících byl obsah 9, KTJ/g, po čtyřech měsících 8, KTJ/g mouky. Jak je patrné z grafu č. 4 obsah sporulujících bakterií se snižuje s délkou skladování s výjimkou vzorku pšeničné biomouky, kde se naopak obsah nepatrně zvýšil. Obr. 11 Kolonie sporulující bakterie 50

57 Výsledky stanovení koliformních bakterií Stanovení koliformních bakterií je významné tím, že umožňuje zjistit stupeň znečištění potravin, krmiv a vody střevní mikroflórou. Podle počtu zjištěných koliformních bakterií lze posoudit, jak byly dodrženy technologické postupy a hygienické zásady ve výrobě, přepravě a skladování (Hofman, 1986). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce č. 10 a grafu č. 5. Tab. 10 Stanovení koliformních bakterií pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka I. rozbor ihned po otevření KTJ/g II. rozbor po 3 měsících KTJ/g III. rozbor po 4 měsících KTJ/g , , , Graf 5 Stanovení koliformních bakterií KTJ/g pšeničná polohrubá mouka pšeničná jemně mletá celozrnná mouka pšeničná celozrnná mouka polohrubá celozrnná žitná jemně mletá biomouka celozrnná pšeničná jemně mletá biomouka 51

58 Jak je patrné z tabulky č. 10 a grafu č. 5 ve vzorcích mouky, které nebyly v bio kvalitě nebyly detekovány žádné koliformní bakterie. Naopak u vzorků biomouk byla zjištěna přítomnost koliformních bakterií. Görner a Valík (2003) uvádí doporučený mikrobiologický limit pro koliformní bakterie 10 KTJ/g. Norma ČSN uvádí limity pro koliformní bakterie u mlýnských obilných výrobků hodnoty Vzorek celozrnné jemně mleté žitné mouky obsahoval ihned po otevření 2, KTJ/g, po třech měsících skladování mouka obsahovala 1, KTJ/g a po čtyřech měsících 1, KTJ/g koliformních bakterií. Vzorek celozrnné jemně mleté pšeničné mouky neobsahoval žádné koliformní bakterie ihned po otevření. Po třech měsících skladování se provedl další rozbor a bylo zjištěno, že mouka obsahovala 15 KTJ/g koliformních bakterií a po dalším měsíci skladování se počet koliformních bakterií zvýšil na 45 KTJ/g. Přítomnost koliformních bakterií u biomouk je způsobená tím, že obilí, které se pěstuje v bio kvalitě není chemicky ošetřováno a jako hnojivo se používají hnůj a kejda, které pocházejí z ekologických chovů a obsahují střevní mikroflóru hospodářských zvířat a odtud se dostávají na povrch zrna a následným mletím se dostávají do mouky. Přítomnost koliformních bakterií není nebezpečná pokud jsou výrobky z mouky tepelně opracovány, protože koliformní bakterie se ničí záhřevem. 52

59 Obr. 12 Nárůst kolonií koliformních bakterií u žitné biomouky 53