Kurz 1. Funkce a struktura buněčných membrán

Transkript

1 Kurz 1. Funkce a struktura buněčných membrán Garant: RNDr. Hana Sychrová, DrSc. Přednášející: RNDr. Petr Ježek, DrSc., Prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc., Doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Ing. Olga Zimmermannová, PhD., RNDr. Marie Kodedová, PhD., RNDr. Hana Sychrová, DrSc., Mgr. Jaromír Zahrádka, RNDr. Lydie Plecitá, PhD., David Reguera, PhD., Ing. Jaroslav Zelenka, PhD., Ing. Tomáš Špaček, PhD., Mgr. Katarína Smolková, PhD. Téma: V rámci kurzu budou účastníci seznámeni s nejnovějšími poznatky v oblasti buněčné membranologie a s možnostmi různých metodických přístupů (s důrazem na moderní fluorescenční a zobrazovací techniky) pro studium biologických procesů, kterých se účastní plazmatická membrána buněk i membrány vnitrobuněčných organel, zejména mitochondrií. Kurz je rozvržen do 5 dní, dopoledne proběhnou vždy 2-3 přednášky v rámci jednoho tematického bloku (celkem 4 bloky) a odpoledne bude věnováno praktickým laboratorním ukázkám a cvičením (5 x), poslední odpoledne bude věnováno písemnému testu, diskusi, analýze výsledků praktických cvičení a zhodnocení kurzu. Pro praktická cvičení budou účastníci rozděleni do malých skupin tak, aby si během praktických cvičení mohli vyzkoušet všechny metodické přístupy a techniky. Témata přednáškových bloků (vždy 2-3 přednášky v rámci bloku): Buněčné membrány Složení struktura a funkce membrán, buněčné transportní systémy - biochemické a biofyzikální přístupy k jejich studiu, vnitrobuněčné organely a úloha jejich membrán Fluoresceční techniky v moderní biologii Základy fluorescenčních technik, fluorescenční techniky v biologii, měření membránového potenciálu a vnitrobuněčného ph, studium interakce proteinů in vivo Mitochondriální integrovaná fyziologie Mitochondrie - významná součást buněčné fyziologie, mitochondrie a regulace rovnováhy reaktivních kyslíkových sloučenin, mitochondriální DNA Trojdimenzionální fluorescenční mikroskopie a nanoskopie Metody superrozlišující fluorescenční mikroskopie. Aplikace 3D nanoskopie na studie mitochondrií. Témata praktických cvičení: Fyziologické projevy absence membránových transportérů základní biologické pokusy srovnávající fenotypy buněk lišících se ve spektru transportních systémů; identifikace

2 mutantních buněk s poškozenými či naopak nadměrně aktivními transportéry pro kationty alkalických kovů; stanovení osmotolerance a osmosensitivity. Stanovení relativního membránového potenciálu základní fluorescenční techniky pro stanovení relativního membránového potenciálu (hyperpolarizace, hypopolarizace); používání fluorescenčních sond in vivo; pozorování změn membránového potenciálu po aplikaci různých chemických látek. Stanovení vnitrobuněčného ph in vivo heterologní exprese phluorinu pro stanovení vnitrobuněčného ph; tvorba kalibračních křivek; klasická fluorescenční spektroskopie vs. fluorescenční mikroskopie vs. fluorescenční reader; stanovení vnitrobuněčného ph v mutantních kmenech kvasinek postrádajících různé transportéry s využitím readeru a 96- jamkových destiček. Precizní respirometrie - základy kalibrace oxygrafu; základní bioenergetický test buňky; měření kinetiky; měření hypoxicky adaptovaných buněk. Trojdimenzionální fluorescenční mikroskopie a nanoskopie - základy práce na konfokálním mikroskopu; tvorbu konstruktů a transfekce buněk konjugáty fotokonvertibilních fluorescenčních proteinů; základní měření na BiplaneFPALM mikroskopu; výpočty lokalizací ve 3D a analýzu 3D obrazů.

3 Kurz 2. Základy receptorové neurofyziologie Odborný garant: RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc. Přednášející: MUDr. Jiří Paleček, PhD; MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc, RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc.; RNDr. Hana Zemková, CSc., MUDr. Vladimír Doležal, DrSc., další vědečtí pracovníci oddělení buněčné neurofyziologie, funkční morfologie, buněčné a molekulární neuroendokrinologie, neurochemie a oddělení proteinových struktur Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky a řada odborných pedagogů Lékařské fakulty UK a Přírodovědecké fakulty UK Praha). Jak funguje náš nervový systém? Proč cítíme bolest a jak reagujeme na změny vnějšího prostředí? Jaké jsou příčiny onemocnění nervové soustavy a jaké jsou nejnovější přístupy k hledání účinných léků? Každé slovo, které slyšíme, a každá myšlenka, která nás napadne, jsou zajišťovány neúnavnou činností ohromného množství iontových kanálů a receptorů, které řídí tok iontů buněčnou membránou a umožňují tak vznik a šíření akčních potenciálů v nervové soustavě. Správná funkce těchto důležitých proteinových komplexů je podmínkou pro správnou činnost nervové soustavy. Pochopení procesů, které jsou příčinou abnormální regulace iontových kanálů a metabotropních receptorů, je nezbytnou podmínkou pro vývoj nových léčebných přístupů, které lidstvu v budoucnu umožní zvládnout neurodegenerativní onemocnění, jakými jsou Alzheimerova a Parkinsonova choroba, závažné poruchy po mozkových příhodách a po ischemickém poškození mozku, či neuropatické bolestivé stavy signalizující poškození nervů. Kurz bude zaměřen na objasnění současných přístupů ke studiu iontových kanálů a receptorů, jejichž aktivita je klíčová v přenosu signálů nervové soustavy. Pozornost bude zaměřena zejména na čtyři různé skupiny receptorů: a) NMDA podskupinu glutamátových receptorů, jejichž nadměrná aktivace vede k buněčné smrti, b) purinergní P2X receptory, jež jsou aktivované extracelulárními nukleotidy a hrají důležitou úlohu v periferním i centrálním přenosu signalizace a zánětlivých onemocněních, c) specifickou podskupinu teplotně citlivých iontových TRP (transient receptor potential) kanálů, které zprostředkovávají převod signalizace v periferním nervovém systému a účastní se mechanizmů zánětlivé a neuropatické bolesti a d) acetylcholinové receptory (muskarinové a nikotinové), které zajišťují přenos vzruchu v centrální i periferní nervové soustavě. Metody studia zahrnují molekulární biologii, biochemii, imunocytochemii, fluorescenční mikroskopii, farmakologii a elektrofyziologii.

4 Témata přednáškových bloků: - úloha excitabilních buněk ve fyziologii organizmu - typy excitabilních buněk: neuronů, glií, svalových buněk a hypofyzárních buněk - neuropřenašeče, jejich biosyntéza, výdej a degradace (glutamát, acetylcholin, kyselina gama-aminomáselná, glycin, serotonin, histamin, noradrenalin, ATP) - iontové kanály (ligandem aktivované, napětím aktivované, mechanoreceptory; kationtové a aniontové kanály; sodíkové, draslíkové, vápníkové a chloridové, polymodální iontové kanály) - receptory spřažené s G-proteiny, metody studia aktivace - agonisté, antagonisté a alosterické modulátory membránových receptorů, základní farmakologie - buněčné mechanizmy převodu a přenosu signálu v periferní a centrální nervové soustavě - molekulární struktura a funkce receptorů pro neuropřenašeče, hormony a jejich signalizační dráhy - neurodegenerativní onemocnění a bolest, studium mechanizmů na buněčné a molekulární úrovni - struktura a funkce membránových receptorů, molekulárně biologické a bioinformatické metody studia - principy počítačového modelování kinetiky aktivace iontových kanálů a receptorů, základy enzymové kinetiky - současné metody studia aktivace membránových receptorů nervové soustavy a důležitých buněčných signalizačních drah - hlavní mechanizmy interakce mezi neuronem a glií (purinergní signalizace, plasticita) Témata praktických cvičení: - snímání membránových proudů technikou patch clamp konfigurace snímání, elektrotechnické základy - příprava buněk pro elektrofyziologická a mikroskopická měření - příprava mikroelektrod a elektrofyziologická měření - hlavní představy o molekulárních mechanizmech aktivace, inaktivace a desensitizace membránových receptorů - mikroskopické techniky pro studium aktivity a exprese iontových kanálů - přístupy zpracování elektrofyziologických dat - porozumění záznamům miniaturních proudů a napětí - kritéria kvality výsledků elektrofyziologických a mikroskopických záznamů - hlavní charakteristiky hardware a software pro elektrofyziologický výzkum - nové směry elektrofyziologického výzkumu: automatizace vysokopropustné systémy jako nástroj pro farmakologický výzkum (hledání výhod a nevýhod) - vápníkový imaging, mikrofluorimetrie, zjištění intracelulární koncentrace vápenatých iontů - mikrofluorimetrické měření v živých buňkách - vyhodnocení mikrofluorimetrických dat - experiment pro zjištění aktivity iontových kanálů metodou vápníkového imagingu - programy pro vyhodnocení aktivity iontových kanálů a metabotropních receptorů - modelování jako nástroj pro poznání důležitých dějů, které nelze změřit - bioinformatické přístupy ke studiu membránových receptorů

5 Obrázek pracoviště pro výzkum funkce iontových kanálů: Elektrofyziologické zařízení pro snímání miniaturních membránových proudů vyvolaných aktivací iontových kanálů (mikroskop, zesilovač, elektronické rozhraní pro digitalizaci signálu a řízení stimulace)

6 Kurz 3 Inženýrství kostní tkáně Odborný garant kurzu: MUDr. Lucie Bačáková, CSc. Postdoktorand: Mgr. Jana Lišková, PhD. Přednášející: Jako lektoři budou střídavě působit vědečtí pracovníci z oddělení Růstu a diferenciace buněčných populací a rovněž zvaní lektoři z oblasti teorie i výrobní či klinické praxe. Úvod do problematiky: Tkáňové inženýrství je mezioborová disciplína, která podle dnes již klasické definice Langera a Vacantiho z roku 1993 využívá principy technických a biologických vědních oborů pro vývoj biologické náhrady, která obnoví, zachová nebo zlepší funkci tkáně či celého orgánu. Jmenovaná biologická náhrada pak obsahuje dvě základní složky: buňky a jejich nosič, který by se měl chovat jako analog extracelulární matrix (ECM), tedy řídit adhesi, růst, diferenciaci a specifické funkce buněk. Nosičem buněk mohou být buď skutečné molekuly ECM, jako je kolagen, elastin, fibronektin, laminin i fibrin, tj. molekula dočasné ECM), nebo umělé materiály, především syntetické polymery, keramické materiály, materiály založené na uhlíku, kovy i materiály kompozitní, tj. obsahující dvě či více uvedených složek. Jako složku buněčnou lze použít buňky již diferencované nebo buňky progenitorové a kmenové, jejichž diferenciace v žádoucí fenotyp je pak navozena vhodnými vlastnostmi nosiče. Tkáňová náhrada, která byla konstruována z buněčné složky a jejího vhodného nosiče, se nazývá bioarteficiální tkáňová náhrada. Návrh harmonogramu týdenního kurzu: Inženýrství kostní tkáně Pondělí : Přednáška mentora: MUDr. L. Bačáková, CSc, FgU AVČR: Úvod do problematiky tkáňového inženýrství obecně. Následují dotazy studentů a diskuse : Metodická přednáška + ukázky (Mgr. Jana Lišková, PhD) Základní typy sterilizace vzorků materiálu pro kultivaci Základy izolace a kultivace buněk, jejich nasazení na materiál pro kultivaci v klasickém statickém systému. Princip sledování růstu buněk v přístroji xcelligence Real Time Cell Analyser : Oběd : Praktická cvičení (vede Mgr. Jana Lišková, PhD, s asistenty): manipulace se vzorky materiálů (pokud možno jednoduché malé planární vzorky, např. ve tvaru koleček či čtverečků) - jejich sterilizace, vložení do kultivačních nádob a jejich osazení buňkami, počítání buněk v Bürkerově hematologické komůrce i v automatickém přístroji ViCell Analyser, který zároveň hodnotí i viabilitu buněk : Nasazení různých typů a koncentrací buněk (různé linie endotelových a hladkých svalových buněk, fibroblasty) do senzorických destiček přístroje xcelligence Real Time Cell Analyser a uvedení přístroje do chodu.

7 Úterý : Přednáška zvaného lektora (Ing. Karel Balík, CSc., ÚSMH AV ČR): Kompozitní biologicky inspirované materiály s amorfní, vláknitou a krystalickou složkou pro inženýrství kostní tkáně. Následují dotazy studentů a diskuse : Metodická přednáška + ukázky (Mgr. Jana Lišková, PhD): Vizualizace buněk na materiálech (fixace, typy barvení, základy imunoflurescence I) : Oběd : Praktická cvičení (vede Mgr. Jana Lišková + asistenti): Fixace buněk na materiálech, fluorescenční barvení buněk na materiálech (Texas Red, Hoechst), fotografování několika zorných polí, počítání buněk na digitálních fotografiích a měření jejich adhesní plochy počítači obrazovou analýzou (např. Atlas, Tescan); : Začátek imunofluorescenčního barvení buněk, a to vybranými primárními protilátkami proti specifickým adhesním či cytoskeletárním proteinům. Buňky v protilátkách zůstanou do dalšího dne. Průběžné sledování růstu buněk v přístroji CeLLigence na monitoru počítače (automatické snímání populační hustoty buněk na základě změn elektrického odporu). Středa : Přednáška zvaného lektora: Ing. Jaroslav Fencl, firma Beznoska s.r.o., Kladno: Výroba a povrchové úpravy kostních implantátů, kloubních náhrad a chirurgických nástrojů pro ortopedii ve firmě Beznoska s.r.o., a jejich klinická úspěšnost : Metodická přednáška (Mgr. Jana Lišková, PhD): Základy imunofluorescence II (primární a sekundární protilátky, excitace/emise sond, atd.), základy průtokové cytometrie : Oběd : Praktická cvičení (vede Mgr. Jana Lišková, PhD + asistenti): Stanovování celkového proteinu - výchozí bod metody ELISA. 15: : Barvení fixovaných a nefixovaných buněk propidium iodidem, stanovení obsahu DNA a podílu živých a mrtvých buněk průtokovou cytometrií Čtvrtek : Přednáška odborníka: MUDr. Marek Majerníček, Ortopedická klinika IPVZ a 1. LF UK FN Na Bulovce: Praktická chirurgická implantace a problematika vhojování umělých kostních a kloubních náhrad, vyuţití kostních morfogenetických proteinů (BMP) v léčebném procesu : Metodická přednáška (Mgr. Jana Lišková, PhD): Kvantitativní hodnocení specifických proteinů metodou enzymatické imunosorbentní eseje (ELISA), semikvantitativní hodnocení průtokovou cytometrií : Oběd : Praktická cvičení (vede Mgr. Jana Lišková, PhD + asistenti): Stanovování celkového proteinu - výchozí bod metody ELISA. 15: : Demonstrace dynamických kultivačních systémů pro cévní, chlopenní či kostní tkáň. Pátek : Přednáška zvaného lektora: Ing. Alexander Kromka, PhD, Fyzikální ústav AV ČR: Vrstvy nanokrystalického diamantu pro potenciální povrchové modifikace kostních a stomatologických

8 implantátů, elektricky vodivé nanodiamanty dopované bórem a možnosti elektrické stimulace kostních buněk pro urychlení hojení defektů : Výklad principu real-time PCR a demonstrace přístroje (vede Mgr. Jana Lišková, PhD) : Oběd : Praktická cvičení (vede Mgr. Jana Lišková, PhD + asistenti): Hodnocení kvantitativních výsledků (počet a plocha buněk, obsah proteinu) jejich statistické porovnání na různých materiálech (software Excel), konečné vyhodnocení výsledků průtokové cytometrie, výsledků sledování růstu buněk v přístroji xcelligence) : Test znalostí získaných během kursu, diskuse a závěr (vede mentor: MUDr. L. Bačáková, CSc.) Případná změna zvaného lektora vyhrazena! Obrázková příloha Obr. 1. Práce v laboratořích Odd. biomateriálů a tkáňového inženýrství. A: Nová budova, oddělení je v přízemí; B: Místnost pro buněčné kultury, nasazování buněk na umělé materiály vyvíjené pro tkáňové inženýrství v boxu s laminárním prouděním vzduchu; C: Kultivace buněk na umělých materiálech v dynamickém bioreaktoru; D: Vizualizace buněk na materiálech pomocí fluorescenčního barvení; E: Fotografování buněk v invertovaném mikroskopu vybaveném fluorescencí a digitální kamerou; F: Práce v imumocytochemické laboratoři; G: Počítačové vyhodnocení získaných výsledků; H: Seminář v zasedací místnosti. A B

9 C D E F G H Obr. 2. Inovace cévních protéz vyráběných pletařskou technologií z polyetylentereftalátu v podniku VÚP a.s., Brno, Česká republika. A: Drsný a vysoce hydrofobní vnitřní povrch protézy, nevhodný pro adhesi buněk; B: Pokrytí tohoto povrchu definovanými molekulárními vrstvami fibrinu, kolagenu I a fibronektinu (konjugovány s fluorescenčními markery); C, D: souvislá vrstva endotelových (C) a

10 hladkých svalových buněk (D) na vnitřním povrchu vrapované protézy; E, F: detail endotelových (E) a hladkosvalových buněk (F). Imunofluorescence beta-aktinu (C, E) či alfa aktinu (D, F). Microscop Olympus IX 51 (A, B) nebo konfokální mikroskop Leica TCS SP2 AOBS, 60x1µm, obj. 10x (C, D) či 60x (E, F). A B 200 m C D 240 m m

11 E F 40 m m