Role hemoxygenasy a gangliosidů při estrogenové a obstrukční cholestáze

Transkript

1 Role hemoxygenasy a gangliosidů při estrogenové a obstrukční cholestáze PETR T 1, ŠMÍD V 1, KUČEROVÁ V 1, ŠMÍDOVÁ J 2, VÁŇOVÁ K 1, VÍTEK L 1, ŠMÍD F 1, MUCHOVÁ L 1 1 Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. LF UK v Praze 2 Ústav pro histologii a embryologii, 1. LF UK v Praze

2 Estrogenová X obstrukční cholestáza Akumulace ŽK v krvi, nižší tok žluče, změna exprese a regulace transportérů, volné radikály, oxidační stres, změna v permeabilitě membrán, apoptóza, nekróza. účinek medikamentů ICP, PBC vrozené cholestatické syndromy tumory poranění žlučových cest choledocholitiáza defekt tvorby či transportu žluči na úrovni hepatocytu intrahepatálních cholestáza estrogeny snižují vychytávání ŽK na sinusoidální membráně a exkreci ŽK na kanalikulární membráně hepatocytu. vzniká přerušením transportu žluče člučovými cestami příčina v oblasti větších žlučovodů vně jater extrahepatální cholestáza Obranné mechanismy: glykosfingolipidy, hemoxygenasa

3 Glykosfingolipidy (GSL) rigidní molekuly zpevňující membránu hepatocytu ve vnější vrstvě plazmatické membrány rafty (GSL, proteiny, cholesterol) signální transdukce, buněčná adhese receptorové molekuly (bakterie, viry, toxiny) GM1 obrana hepatocytu

4 Hemoxygenasa-1 (HO-1) inducibilní enzym katalyzující degradaci hemu na biliverdin, CO a Fe 2+ (antioxidační, antiapoptické, cytoprotektivní a protizánětlivé vlastnosti) cílená aktivace: terapeutický cíl v léčbě jaterních onemocnění, ochrana jater před ischemicko-reperfusním či apoptickém poškození cílená inhibice: experimentální léčba novorozenecké hyperbilirubinemie (metaloporfyriny) obrana hepatocytu

5 Cíl práce Zjistit zda vede aktivace/inhibice HO-1 při cholestatických onemocněních ke změně složení jaterních gangliosidů a zda-li existuje mezi GSL a HO-1 určitý vztah.

6 Metodika samice potkanů kmene Wistar ( g) intrahepatální 18-ti denní cholestáza vyvolaná 17-αethinylestradiolem (EE) 5mg/kg X kontrola (PD), n=65 + modulace HO-1: hemin (2., 7., 12. a 17. den, i.p.) SnMP (3., 8., 13. a 18. den, i.p.) Kon EE BDL ikon akon iee, ibdl aee, abdl Extrahepatální 5-ti denní cholestáza vyvolaná podvazem segmentálních žlučovodů (BDL), n=40 + modulace HO-1: hemin (1. a 4. den, 15, i.p.) SnMP (1. den, i.p.)

7 Metodika Biochemické hodnoty ze séra Histochemická analýza Jaterní tkáň potkana Měření HO-1 Izolace gangliosidů Celková kyselina sialová TLC chromatografie Statistická analýza

8 Modulace HO-1 u EE cholestázy ŽK [µmol/l] Bili [µmol/l] ALP [µkat/l] Kon 5,5 1,0 1,8 EE 105,8 3,7 3,1 ikon 42,2 1,1 1,8 iee 134,7 3,5 3,6 akon 11,7 1,7 1,5 aee 146,4 5,6 3,1 Kys. sialová [nmol/g] HO-1 [pmol CO/mg FW/hod] Kon 21,5 240,8 EE 39,1 239,1 ikon 36,5 74,4 iee 42,7 44,8 akon 23,9 633,9 aee 31,3 435,2 úspěšná aktivace HO-1 úspěšná inhibice HO-1 cholestáza potvrzena: ŽK, Bili, ALP, P<0,03 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 ŽK [µmol/l], Kys. sialová [nmol/g] Kon EE ikon iee akon aee

9 Složení GSL při EE cholestáze Biosyntéza GSL TLC chromatografie Změny GD1b a GT1b při modulaci HO-1 0 A B C EE Kon žáby savci ryby Zmnožení GSL B větve u cholestatických vzorků Kon x EE..vliv cholestázy EE x iee vliv SnMP EE x aee..vliv heminu Modulace HO-1 u kontrol neměla vliv na signifikantní změnu GD1b a GT1b P<0,05

10 Modulace HO-1 u obstrukční cholestázy ŽK [µmol/l] Bili [µmol/l] Kon 17,3 1,4 BDL 372,0 250,3 ikon 14,0 2,0 ibdl 562,8 192,9 akon 21,8 3,8 abdl 638,4 291,3 cholestáza potvrzena: ŽK 22x, Bili 180x, P<0,05 3,0 2,5 Log ŽK [µmol/l], Kys. sialová [nmol/g] Kys. sialová [nmol/g] HO-1 [pmol CO/mg FW/hod] Kon 13,4 328,0 BDL 20,5 199,0 ikon 22,7 176,0 ibdl 39,9 59,0 akon 22,8 834,0 abdl 40,2 641,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Kon BDL ikon ibdl akon abdl

11 Složení GSL při obstrukční cholestáze Vliv podvazu žlučovodů Kon x BDL GD1b 2,4x GT1b 2,4x ikon x ibdl GD1b 2,3x akon x abdl GD1b 7,4x GT1b 9,6x Vliv Sn-mesoporfyrinu BDL x ibdl GD1b 2,2x GT1b 2,3x Vliv heminu Kon x akon GM3 4,4x P<0,05

12 Sin/cyt Zvýšený podíl cholestaticky změněné plochy řezu jaterní tkáně u skupin s ligovanými žlučovody (BDL, ibdl, abdl) BDL ibdl abdl ikon Kon akon C BDL ibdl GM1 přesun do sinus. membrány v důsledku cholestázy ŽK [µmol/l] ibdl Výrazný GM1 přesun do sinus. membrány v důsledku HO inhibice Kon BDL P < 0,01 P < 0,05 abdl Nižší GM1 přesun do sinus. membrány v důsledku HO inhibice

13 SAT2 exprese mrna skupina [%kontroly] ikon 383,8 Vliv ibdl 111,7 SnMP akon 48,2 abdl 15,3 Kon 52,9 BDL 17,5 GalT II Exprese mrna Gal II Kon BDL ikon ibdl abdl akon skupina exprese mrna [% kontroly] Kon 50,0 BDL 52,3 ikon 91,9 ibdl 75,2 akon 19,7 abdl 34,4 Hodnoty v % proti endogenní kontrole (β-aktin) Exprese mrna SAT2 ikon ibdl akon abdl Kon BDL

14 Závěr u EE cholestázy vede inhibice HO-1 ke zvýšení celkových gangliosidů v závislosti na koncentraci ŽK x aktivace HO-1 nemá na jaterní gangliosidy vliv U BDL cholestázy dochází k signifikantní elevaci celkových gangliosidů při inhibici i aktivaci kontrolních i cholestatických vzorků nezávisle na koncentraci ŽK uvedené rozdíly mohou být vysvětleny rozdílným mechanizmem obou typů cholestáz Práce byla podpořena GAUK a IGAMZ NT/

15